Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 19
1.1. Бронхиальная астма - мультифакторное заболевание. Генетические и фармакогенетические аспекты Б А 19
1.2. Фенотипы бронхиальной астмы тяжелого течения. Терапевтически резистентная Б А 24
1.3. Механизмы действия ГКС. Структура глюкокортикоидного рецептора 31
1.4. Молекулярные механизмы развития стероидорезистентности. Роль изоформ ГР в развитии стероидорезистентности 39
1.5. Ген глюкокортикоидного рецептора NR3С1 47
1.6. Структура и функции бета2-адренорецептора. Ген ADRB2 51
1.7. Ген множественной лекарственной устойчивости MDR1 59
1.8. Роль цитокинов в персистенции воспаления при Б А. Гены IL4 и IL13 66
ГЛАВА 2. Материалы и методы 73
2.1. Клиническая характеристика обследованных лиц 73
2.1.1. Клиническая характеристика больных БА в зависимости от степени тяжести заболевания 73
2.1.2. Клиническая характеристика больных ТРБА и ТЧБА 82
2.1.3. Клиническая характеристика больных ИФА 90
2.2. Лабораторные и инструментальные методы 91
2.3. Молекулярно-генетические методы 92
2.3.1. Характеристика исследованных генетических вариантов 92
2.3.2. Выделение геномной ДНК из крови пациентов 94
2.3.3. Полимеразная цепная реакция и рестрикционный анализ 94
2.3.4. Выделение общей РНК из крови пациентов 103
2.3.5. Реакция обратной транскрипции и полимеразная цепная реакция в режиме реального времени 104
2.4. Статистическая обработка результатов исследования 107
ГЛАВА 3. Результаты проведенных исследований 108
3.1. Распределение аллельных вариантов, обусловленных мутациями С3435Т гена MDR1; Glyl6Arg и Gln27Glu гена ADRB2; С-589Т гена IL4; ArgBOGln гена IL13; N363S, R23K, Ile559Asn, Val729Ile и Ile747Met гена NR3 Сів обследованных группах 108
3.1.1. Распределение аллельных вариантов, обусловленных мутациями С3435Т гена MDR1; Glyl6Arg и Gln27Glu гена ADRB2; С-589Т гена IL4; ArgBOGln гена IL13; N363S, R23K, Ile559Asn, Val729Ile Hlle747MetreHaNR3Cl в группе контроля 108
3.1.2. Распределение аллельных вариантов, обусловленных мутациями С3435Т гена MDR1; Glyl6Arg и Gln27Glu гена ADRB2; С-589Т гена IL4; Argl30Gln гена IL13; N363S, R23K, Ile559Asn, Val729Ile и Ile747Met гена NR3C1 у больных БА в зависимости от степени тяжести заболевания по сравнению с группой контроля 113
3.1.3. Распределение аллельных вариантов, обусловленных мутациями С3435Т гена MDR1; Glyl6Arg и Gln27Glu гена ADRB2; С-589Т гена IL4; ArgBOGln гена IL13; N363S, R23K, Ile559Asn, Val729Ile и Ile747Met гена NR3C1 у больных ТРБА и ТЧБА по сравнению с группой контроля 121
3.1.4. Распределение аллельных вариантов, обусловленных мутациями С3435Т гена MDR1, -С589Т гена IL4 и ArgBOGln гена IL13 у больных ИФА по сравнению с группами Б А и контроля 128
3.2. Ассоциации аллельных вариантов, обусловленных мутациями С3435Т гена MDR1; Glyl6Arg и Gln27Glu гена ADRB2; С-589Т гена IL4; ArgBOGln гена ILB; N363S и R23K гена NR3C1, с фенотипами БА 134
3.2.1. Ассоциации аллельных вариантов, обусловленных мутациями С3435Т гена MDR1; Glyl6Arg и Gln27Glu гена ADRB2; С-589Т гена IL4; Argl30GIn гена IL13; N363S и R23K генаШЗСІ, со степенью тяжести БА 135
3.2.2. Ассоциации аллельных вариантов, обусловленных мутациями С3435Т гена MDR1; Glyl6Arg и Gln27Glu гена ADRB2; С-589Т гена IL4; ArgBOGln гена IL13; N363S и R23K гена NR3C1, с фенотипами больных ТРБА и ТЧБА 166
3.3. Экспрессия изоформ глюкокортикоидного рецептора у больных Б А в зависимости от степени тяжести заболевания 182
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 189
Выводы 225
Практические рекомендации 226
Список литературы 228
- Фенотипы бронхиальной астмы тяжелого течения. Терапевтически резистентная Б А
- Структура и функции бета2-адренорецептора. Ген ADRB2
- Реакция обратной транскрипции и полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
- Распределение аллельных вариантов, обусловленных мутациями С3435Т гена MDR1, -С589Т гена IL4 и ArgBOGln гена IL13 у больных ИФА по сравнению с группами Б А и контроля
Введение к работе
Актуальность темы
Бронхиальная астма (БА) относится к числу наиболее распространенных хронических воспалительных заболеваний бронхолегочной системы. В связи с урбанизацией населения к 2025 году ожидается увеличение количества больных БА до 400 миллионов человек (Gibeon D.S. et al., 2010). Рост заболеваемости, увеличение количества тяжелых форм БА, резистентных к лечению и сохраняющиеся на прежнем уровне, несмотря на достижения терапии, показатели смертности приводят к тому, что БА остается серьезной медицинской и социальной проблемой (Чучалин А.Г., 2005; Федосеев Г.Б., Трофимов В.И. и соавт., 2011).
По результатам исследований анализа эффективности терапии БА в США и в Европе, у 70% пациентов с БА симптомы заболевания не контролируются (AJRCEE, 2000; ENFUMOSA, 2003; TENOR, 2006). Несмотря на успехи фармакотерапии и выявление многих механизмов данной патологии, тяжелая форма БА остается наименее изученной.
В России до 80% пациентов не достигают адекватного уровня лечебного контроля над БА (Чучалин А.Г., 2005; Лещенко И.В. и соавт., 2009); у 10-20% больных диагностируется тяжелое течение заболевания с признаками терапевтической резистентности (Петровский В.Ф. и соавт., 2008). Резистентность к глюкокортикостероидам (ГКС) достигает 20%, к 2-агонистам адренергических рецепторов – 15%, к ингибиторам лейкотриеновых рецепторов – 40%, (Чучалин А.Г., 2001). Около 10% пациентов с БА тяжелого течения (ТБА) не отвечают на традиционные режимы лечения, включая высокие дозы ингаляционных ГКС (ИГКС), а 1% пациентов нуждается в постоянной терапии пероральными ГКС (ТГКС) (Barnes P., 2010).
В последнее время обсуждается понятие терапевтически резистентной бронхиальной астмы (ТРБА); выделяют фенотипы фатальной астмы, «хрупкой» («brittle») астмы, гормонозависимой БА (ГЗБА) – стероидозависимой и стероидорезистентной (Barnes P.J. et al., 1998; Огородова Л.М. и соавт, 2001; Wenzel S., 2005; Chung K.F., 2011). Однако до сих пор нет четкого определения фенотипа ТРБА, и эта терминология пока не применяется повсеместно. Сложившаяся ситуация требует создания единых критериев для постановки диагноза ТРБА с учетом гетерогенности заболевания.
Наиболее перспективными в понимании патогенетических механизмов развития ТРБА, а также в поиске новых диагностических тестов, обладающих высокой степенью чувствительности и специфичности, являются генетические исследования. Вклад генетических факторов в этиопатогенез БА составляет от 36 до 94% (Anderson G., 2008). Генетическая детерминированность может быть ответственна за 60-80% вариации ответа на ряд противоастматических препаратов (Пузырев В.П., Огородова Л.М., 2010). В связи с этим особую актуальность приобретает изучение генов лекарственных мишеней.
Мутации, ассоциированные с ответом на 2-агонисты, обнаружены в гене 2-адренорецептора (ADRB2), а также в гене глюкокортикоидного рецептора (NR3C1). У лиц с определенным генотипом при назначении ГКС, вероятно, может развиваться не только стероидозависимость, но и стероидорезистентность, а при назначении 2-агонистов не исключено отсутствие бронходилатирующего эффекта. Однако результаты исследований очень противоречивы (Hawkins G.A. et al., 2004; Contopoulos-Ioannidis D.G. et al., 2005; Hall I.P. et al., 2007) и требуют уточнения, а у пациентов с ТРБА подобный анализ вообще не проводился.
Актуальным является изучение механизма генетического контроля транспорта ГКС из клетки и связанных с ним различий в стероидочувствительности. Ген множественной лекарственной устойчивости (MDR1) кодирует транспортный белок Р-гликопротеин-170 (Pgp-170), который участвует в эффлюксе липофильных соединений, в том числе ГКС (Farrell. R.O. et al., 2003). Исследований по изучению гена MDR1 при БА в доступной нам литературе мы не нашли.
Одним из молекулярных механизмов развития стероидорезистентности является дисбаланс изоформ глюкокортикоидного рецептора (ГР), который может определять чувствительность тканей-мишеней к ГКС. Данные литературы, касающиеся этого механизма при БА, единичны и противоречивы (Gagliardo R. et al., 2000; Whorwood C.B. et al., 2001; Goleva E. et al., 2006), а в аспекте фенотипов ТРБА, степени тяжести БА и терапии ГКС, особенно при динамическом наблюдении, вообще отсутствуют как в зарубежной, так и в отечественной литературе.
Для решения проблемы терапевтической резистентности необходимо также изучение вклада аллельных вариантов генов цитокинов Тh2: интерлейкина 4 (IL4) и интерлейкина 13 (IL13), ассоциированных с иммунным ответом. Исследования в этом направлении пока ограничиваются анализом аллельных вариантов гена IL4 преимущественно при аллергической БА (Фрейдин М.Б. и соавт., 2002; Келембет Н.А., Гембицкая Т.Е. и соавт, 2008), а комплексная оценка полиморфных вариантов генов IL4 и IL13 при ТРБА еще не проводилась.
Таким образом, представляется актуальным изучение генетической природы терапевтической резистентности больных БА к лекарственным препаратам, в частности, к ГКС и 2-агонистам. Это позволит выявить генетические маркеры для прогнозирования чувствительности и терапевтической резистентности к лекарственным средствам и разработать диагностический алгоритм с использованием фармакогенетического подхода у больных БА.
Цель исследования
Оценить значение фармакогенетических факторов в терапии глюкокортикостероидами и бета2-агонистами у больных терапевтически резистентной бронхиальной астмой и разработать критерии прогнозирования терапевтической резистентности с учетом генетических маркеров.
Задачи исследования
-
Определить частоты аллелей, обусловленных мутациями С3435Т гена MDR1; Gly16Arg и Gln27Glu гена ADRB2; Ile559Asn, Val729Ile, Ile747Met, Asn363Ser, Arg23Lys гена NR3C1; С–589Т гена IL4 и Arg130Gln гена IL13, у больных БА различной степени тяжести, а также в зависимости от терапевтической резистентности.
-
Определить частоты аллелей, обусловленных вышеперечисленными мутациями, в контрольной группе, а также аллелей, обусловленных мутациями С3435Т гена MDR1, С–589Т гена IL4 и Arg130Gln гена IL13, у больных идиопатическим фиброзирующим альвеолитом (ИФА).
-
Определить уровни экспрессии изоформ ГР и ГР, кодируемых геном NR3C1, у пациентов с ГЗБА, а также у больных БА среднетяжелого и легкого течения заболевания до и после терапии ГКС.
-
Выявить вклад вышеперечисленных генетических детерминант в формирование патогенетических и клинических фенотипов БА, а также их ассоциацию с ответом на терапию ГКС.
-
Разработать алгоритм диагностики, в том числе молекулярно-генетического исследования, для выявления маркерного профиля терапевтической резистентности у больных БА.
Научная новизна исследования
-
Впервые определен маркерный профиль ТРБА у больных славянской популяции на основании комплексной оценки распределения аллелей, обусловленных мутациями С3435Т гена MDR1; Gly16Arg и Gln27Glu гена ADRB2; Ile559Asn, Val729Ile, Ile747Met, Asn363Ser, Arg23Lys гена NR3C1; C–589Т гена IL4 и Arg130Gln гена IL13.
-
Впервые установлен генетический профиль, включающий аллели, обусловленные мутациями С3435Т гена MDR1; Gly16Arg и Gln27Glu гена ADRB2; Ile559Asn, Val729Ile, Ile747Met, Asn363Ser, Arg23Lys гена NR3C1; C–589Т гена IL4 и Arg130Gln гена IL13, у больных БА в зависимости от степени тяжести заболевания, позволяющий диагностировать и дифференцировать фенотипы БА.
-
Впервые выявлены ассоциации аллельных вариантов вышеперечисленных генов с фенотипами ТРБА, а также с проводимой терапией. У больных БА различной степени тяжести показана роль изоформ ГР как маркера эффективности терапии ГКС.
-
Впервые выявлены генетические предикторы терапевтической резистентности, включая стероидорезистентность, у пациентов со стероидочувствительным и стероидорезистентным вариантами ИФА.
-
Впервые на основании выявленного генетического маркерного профиля с учетом патогенетических и клинических фенотипов БА определены предикторы формирования терапевтической резистентности, что позволило разработать единые критерии постановки диагноза ТРБА и рекомендовать их для практического применения, включая амбулаторный этап.
Практическая ценность работы
-
Разработан метод диагностики ТРБА, основанный на молекулярно-генетических исследованиях, включая фармакогенетический подход, позволивший создать маркерные профили тяжелого и легкого течения БА. Это позволяет прогнозировать эффективность ГКС и 2-агонистов, своевременно назначать альтернативные лекарственные препараты, тем самым предотвращать развитие ятрогенных осложнений и обеспечивать индивидуальный подход, то есть персонифицированную терапию, а также способствовать усовершенствованию принципов индивидуальной противовоспалительной терапии с оптимальным соотношением «эффективность-безопасность».
-
Показана необходимость использования фармакогенетических маркеров с учетом патогенетических и клинических фенотипов, наряду с критериями терапевтически резистентной БА (ATS,2000), для формирования группы труднокурабельной БА.
-
Разработанное с позиции фармакогенетики комплексное молекулярно-генетическое исследование маркеров ТРБА может быть рекомендовано для широкого практического применения, включая амбулаторный этап. Прогнозирование эффективности терапии у больных БА на основе комплекса фармакогенетических исследований позволяет персонализировать терапию и снизить фармакоэкономические затраты.
-
Выявленные молекулярные механизмы и генетические маркеры, ассоциированные с режимом лекарственной терапии, объемом лечения, ответом на проводимую терапию открывают возможности использования новых мишеней для воздействия «таргетной» терапии, внедрения новых препаратов, основанных на регулировании экспрессии генов лекарственных мишеней, генов воспаления, генов, ответственных за детоксикацию ксенобиотиков и транспорт лекарственных препаратов.
Положения, выносимые на защиту
-
ТРБА является мультифакторным заболеванием, генетические черты которого имеют популяционные особенности. В развитии БА тяжелого течения с признаками терапевтической резистентности каждый из генетических факторов предрасполагает к развитию заболевания, а их комбинации, «генетические ансамбли», обладают аддитивным эффектом и приводят к высокому риску развития БА, когда для развития болезни достаточно минимального влияния факторов внешней среды, или/и к тяжелому, трудноконтролируемому течению БА.
-
Развитие терапевтической резистентности у больных БА обусловлено нарушением функции 2-адренорецептора (2-АР) и ГР вследствие их детерминированности определенными аллелями генов лекарственных мишеней ADRB2 и NR3C1, генов провоспалительных цитокинов IL4 и IL13, генов детоксикации, а также дисбалансом экспрессии изоформ ГР.
-
Терапевтически-резистентные и терапевтически-чувствительные больные БА представляют собой две различные группы пациентов, отличающиеся друг от друга генетическими маркерами, характером воспаления, механизмами развития стероидочувствительности, функциональными особенностями 2-АР и, соответственно, ответом на терапию ГКС и 2-агонистами.
-
ТРБА – это гетерогенное заболевание, которое включает ГЗБА, нередко в сочетании с нервно-психическим вариантом БА; характеризуется поздним началом манифестации, зрелым возрастом пациентов преимущественно женского пола, с повышенным индексом массы тела, наличием коморбидной патологии, преобладанием нейтрофильного воспаления, выраженной и частично обратимой бронхообструкцией, а также плохим контролем над заболеванием и склонностью к развитию осложнений.
-
При БА ГКС модулирут экспрессию изоформ ГР, и это особенно выражено при терапии системными ГКС.
Апробация работы
По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работ, в том числе 10 статей, из них 7 в журналах, рекомендуемых ВАК; в зарубежной литературе 9 работ.
Материалы диссертации докладывались на научной сессии общего собрания Северо-Западного отделения РАМН «Генетика в профилактике, диагностике и лечении заболеваний человека» (Санкт-Петербург, 2005); на XVI, XVII, XIX, XIX, XX Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2006, Казань, 2007, Москва, 2009, 2010); на 4-м конгрессе Евро-Азиатского респираторного общества, 5 международном конгрессе пульмонологов Центральной Азии (Ташкент, 2008); на 4 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Каракол, 2009); на научно-практических конференциях «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2007, 2009); на научно-практической конференции «Бронхиальная астма: вчера, сегодня, завтра» (Санкт-Петербург, 2007); на Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины – возможное и реальное», посвященном памяти Е.И. Шварца (Санкт-Петербург, 2010); на конференции «От научных исследований к практической пульмонологии» в рамках научной сессии НИИ Пульмонологии (Санкт-Петербург, 2010 г); на XIV научно-практической конференции «Булатовские чтения: актуальные вопросы пульмонологии и клинической аллергологии – врачам общей практики» (Санкт-Петербург, 2010); на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы внутренней медицины», посвященной 170-летию кафедры госпитальной терапии ВМА им. С.М. Кирова (Санкт-Петербург, 2010); на научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры госпитальной терапии им. акад. М.В. Черноруцкого СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 2011); на Европейской конференции «Генетика человека» (Nice, 2007); на XVI, XVIII, XX, XXI конгрессах Европейского респираторного общества (Munich, 2006; Berlin, 2008; Barcelona, 2010; Amsterdam, 2011).
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты исследования внедрены в лечебную практику клиники госпитальной терапии, а также межклинического аллергологического отделения и консультативно-диагностического центра ГБОУ ВПО СПбГМУ им. И.П. Павлова Минздравсоцразвития РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 251 страницах машинописного текста, содержит 46 таблиц, иллюстрирована 31 рисунком и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и обсуждение, выводы, практические рекомендации и список литературы, включающий 236 научных источников 47 – на русском языке и 186 - на иностранном).
Фенотипы бронхиальной астмы тяжелого течения. Терапевтически резистентная Б А
Бронхиальная астма относится к группе мультифакторных заболеваний, развитие которой определяется сложным взаимодействием множества генов и факторов внешней среды (Чучалин А.Г., 2001; Sayers I., 2007; Трофимов В.И., 2008; Hall LP., Barnes P.J., DrazenJ.M. et al., 2009; ПузыревВ.П., Огородова Л.М., 2010).
За последние 10 лет в медицинских и биологических научных журналах опубликовано около 1000 статей, посвященных анализу наследственных основ БА. Число генов, протестированных в связи с заболеванием или обнаруженных в полногеномных исследованиях, составляет более 600; для ряда этих генов воспроизводимость ассоциаций настолько высока, что позволяет говорить о том, что они являются однозначно установленными генами подверженности заболеванию.
БА - одно из первых заболеваний, для которого был проведен полногеномный анализ ассоциаций. Известно о более двенадцати полногеномных скринингах, в результате которых подтверждена ассоциация БА с локусами, в которых локализованы гены-кандидаты данного заболевания (5q23-31, 5р15, 5q31.1-33, 6р12-21.2, 11р13, llql2-13, 12ql4-24.1, 13qll-14, 13q21.3, 14qll.2-13, 16pl2.1-11.2, 17pl 1.1-ql 1.2, 19ql3, 21q2) и другие. Генетический скрининг позволил обнаружить на 10 различных хромосомах 15 локусов, ассоциированных с БА. К генам, ассоциированным со стероидорезистентной бронхиальной астмой (СРБА), относится кластер, идентифицированный в 5q31-32 хромосоме, который в числе прочих включает ген глюкокортикоидного рецептора (NR3C1), а также гены рецепторов к IL-3, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, GM-CSF и (32-адренорецептору (ADRB2) (Kumar A., Ghosh В., 2009).
Ряд генов, имеющих отношение к заболеванию, выявлен в рамках другого подхода - позиционного клонирования. Первым геном, ассоциированным с БА, обнаруженным этим методом, стал ADAM33, кодирующий белок дезинтегрин и металлопротеазу 33. Ассоциация гена ADAM33 с Б А, в частности, с функцией легких, была подтверждена во многих этнических популяциях. Позже были идентифицированы и другие гены, предрасполагающие к развитию БА, например, ген PHF11, который кодирует хроматин-зависимый транскрипционный фактор семейства растительных гомеодоменов и ассоциирован с БА тяжелого течения; ген DPP10, кодирующий дипептидил-пептидазу-10.
В исследовании, опубликованном в середине 2007г., была использована панель из 317 тысяч однонуклеотидных маркеров для генотипирования детей, страдающих БА, что позволило впервые установить сильную ассоциацию БА с генами ORMDL3 и GSDML, расположенными близко друг от друга на хромосоме 17q21 (Пузырев В.П., Огородова Л.М., 2010).
На сегодняшний день накоплено множество примеров, показывающих, что различия ответа на лекарственную терапию обусловлены вариантами нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих ферменты метаболизма лекарств, молекул-переносчиков лекарств и их рецепторов (Evans W.E., McLeod H.L., 2003).
Вредные привычки и другие средовые факторы, влияют на фармакокинетические механизмы, контролируемые, в свою очередь, индивидуальным генетическим профилем. В результате у одних больных стандартный режим дозирования оказывается оптимальным, у других -неэффективным, у третьих - токсическим. В США ежегодно до 100 000 человек умирают от неправильного применения лекарств, что занимает шестое место среди причин смертности. О ситуации в России можно только догадываться, поскольку официальная статистика по данному вопросу отсутствует (Середенин СБ., 2004).
В последние годы активно изучается связь . фармакокинетики и фармакодинамики лекарственных средств с полиморфизмом генов транспортеров: переносчиков органических анионов (ОАТР-С, ОАТ-1, ОАТ-3), органических катионов (ОСТ-1) и транспортного белка Pgp-170, кодируемого геном MDR1. Выделяют также группу генов, кодирующих ферменты биотрансформации лекарственных средств, в частности, изоферменты цитохрома Р-450 (CYP2E1, CYP1A1, CYP2C19) и ферменты II фазы биотрансформации (N-ацетилтрансферазы, глутатион SH-S-трансферазы и другие). Ген GSTP1, кодирующий глутатион S-трансферазу я1, является наиболее привлекательным геном-кандидатом для БА и атопии, так как более всего экспрессируется в легочной ткани и расположен в локусе llql3, для которого неоднократно показано сцепление с атопическими признаками (Carroll W, 2005).
В работах исследователей из Санкт-Петербурга и Новосибирска была установлена ассоциация «нулевых» генотипов GSTT1 и GSTM1, приводящих к отсутствию ферментов, с БА (Иващенко Т.Э., Желенина Л.А., 2003; ЛяховичВ.В., ВавилинВ.А., Макарова СИ. и соавт., 2006). Установлено, что тяжесть течения БА ассоциирована с «нулевым» и нормальным аллелями гена GSTT1. Ферменты, контролируемые этими генами, важны для метаболизма всех ксенобиотиков, включая различные фармакологические препараты (Баранов B.C., 2009).
Хорошо известно, что пациенты по-разному реагируют на введение одного и того же лекарственного вещества (Vesell E.S., 1989). Эффективность действия лекарственного препарата зависит от многих изменяющихся параметров, таких, как возраст, функциональное состояние органов, сопутствующая терапия, химическая природа лекарств, их взаимодействие между собой (Evans W.E., McLeod H.L., 2003). Например, на фоне приема ИГКС у одной трети больных БА не наблюдается объективного улучшения функции легких; нередко развиваются побочные эффекты, такие как катаракта или/и глаукома. Терапия ингибиторами 5-липооксигеназы у 3-5% пациентов вызывает повышение уровня печеночных ферментов, а при назначении р2-агонистов длительного действия у некоторых больных БА возрастает риск смерти (Wechsler М.Е., Israel Е., 2005).
Фармакогенетическое тестирование постепенно входит в клиническую практику. На сегодняшний день в США свыше 120 лекарственных препаратов имеют маркировку с фармакогенетическими данными, которые клиницист может учитывать при назначении (Shin J., Kauser S.R., Langaee Т., 2009). Вклад генетических факторов в вариабельность реакции на лекарственные средсва варьирует от 20 до 95% (KalowW., TangB.K., Endrenyi L, 1998); по другим данным около 70-80% изменчивости индивидуального ответа на терапию может иметь генетическое обоснование (Wechsler М.Е., Israel Е., 2005). Генетическая изменчивость может быть ответственна за 60-80% вариации ответа на ряд противоастматических препаратов (Пузырев В.П., Огородова Л.М., 2010).
При фармакогенетических исследованиях исследуются гены, кодирующие «молекулы-мишени» лекарственных препаратов (рецепторы, ферменты, ионные каналы) и гены, продукты которых вовлечены в патогенетические процессы (цитокины, факторы транскрипции и другие).
Структура и функции бета2-адренорецептора. Ген ADRB2
Выделяют кортикочувствительных и стероидорезистентных пациентов. К кортикочувствительным относятся больные, у которых на фоне приема системных или ингаляционных ГКС ремиссия достигается быстро и поддерживается длительно. Стероидорезистентными считают пациентов, у которых после 7-14-дневного курса лечения преднизолоном в таблетированной форме в дозе 40 мг в сутки объем форсированного выдоха за первую секунду (ОФВі) увеличивается менее, чем на 15%, несмотря на увеличение ОФВі более, чем на 15 % в ответ на бронходилататор (Leung D.Y., Bloom J.M., 2003).
Большинство исследователей считают, что нечувствительность к ГКС -достаточно редкий феномен, встречающийся лишь у 5 % больных БА. Однако обследование пациентов с плохо контролируемой БА показало, что таких больных гораздо больше: около 25% пациентов с ГЗБА соответствуют критериям стероидорезистентности (Chan М.Т., Leung D.Y.M., Szefler J.D, et al., 1998).
У больных БА существует два типа стероидорезистентности (Leung D.Y.M., Spahn J.D., Szefler S.J., 2002). Стероидорезистентность 1-го типа составляет более 95% от всей СРБА; развивается как в результате индуцированной аллергенами или инфекцией активации клеток, так и вследствие длительного действия препаратов (ГКС, [32-агонистов), то есть является вторичной. Это наиболее часто встречающийся тип резистентности к действию ГКС, вызванный значительным уменьшением связывающей способности ГР с соответствующими участками ДНК при нормальном количестве ГР и касается преимущественно Т-лимфоцитов. У пациентов с БА с признаками стероидорезистентности 1-го типа нарушения функционирования ГР обратимы. В ответ на назначение высоких доз ГКС у этих больных могут развиваться многочисленные побочные эффекты терапии, включая угнетение функции надпочечников и кушингоидный синдром. Это происходит потому, что стероидорезистентность охватывает только иммуновоспалительные клетки.
В большинстве случаев пациенты не абсолютно резистентны к ГКС, а имеют сниженную чувствительность к ним. В исследовании В.И. Трофимова (2001) было подтверждено нарушение клеточной чувствительности к ГКС в виде снижения кортизолпоглощения лимфоцитов у больных ГЗБА (Трофимов В.И., Шапорова Н.Л., Дудина О.В. и соавт., 2001).
Одной из гипотез развития ГКС-ассоциированных осложнений является представление о том, что побочные эффекты терапии ГКС происходят из-за трансактивации генов через связывание димеров ГР с ДНК, тогда как связывание мономера ГР с факторами транскрипции или с коактиваторами, приводящее к репрессии гена, не вызывают этих осложнений (Belvisi M.G., Sharon L., Wicks S.L. et al. 2001).
Стероидорезистентность 2-го типа иначе называется первичной, встречается очень редко и является крайним вариантом снижения чувствительности к ГКС, ассоциированным с более редкими и агрессивными мутациями гена NR3С1 или генов, модулирующих функцию ГР. У таких пациентов имеет место семейный анамнез нарушения чувствительности к действию ГКС, изначально наблюдается резкое снижение количества ГР, связанное с уменьшением их плотности, повышенная термолабильность ГР и нарушение связывания ГР. Дефект является генетически детерминированным и касается всех без исключения типов клеток. В ответ на терапию большими дозами ГКС у таких пациентов практически не развиваются побочные эффекты (Barnes Р J., 2004).
В 2003 году в Европе прошло многоцентровое исследование клинических фенотипов тяжелой астмы - European Network For Understanding Mechanisms Of Severe Asthma (ENFUMOSA), где сравнивались пациенты с БА среднетяжелого и тяжелого течения заболевания. Была дана характеристика БА тяжелого течения, которая включала наличие не менее одного обострения за последний год, несмотря на лечение высокими дозами ИГКС ( 1200 мкг/сутки беклометазона или эквивалентных доз других ИГКС) или ТГКС.
Подчеркивалась ассоциация непереносимости аспирина с тяжелым течением БА. Атопия по-прежнему рассматривалась как важнейший фактор риска развития БА, однако ее нельзя было считать предиктором тяжелого течения заболевания. Сохраняющаяся эозинофилия на фоне терапии ГКС рассматривалась как доказательство резистентности к проводимой терапии у больных ТБА. Авторы обращали внимание на часто встречающийся нейтрофилез в периферической крови и в мокроте как фактор хронизации и проградиентного течения заболевания с формированием необратимых изменений в бронхах - также, как при хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). У небольшого количества больных БА высокие дозы ИГКС и ТГКС не уменьшали симптомы заболевания и не вызывали значимого повышения ОФВі. Эти пациенты были определены как больные СРБА (ENFUMOSA, 2003).
В 2006 году были опубликованы результаты исследования: «The Epidemiology and Natural History of Asthma: Outcomes and Treatment Regimens (TENOR) study». Основным критерием включения пациентов с ТБА в исследование было наличие резистентности к проводимой терапии, включающей не менее трех препаратов на протяжении года. Среди предикторов обострения БА был отмечен молодой возраст больных, женский пол, негроидная раса, индекс массы тела более 35 кг/м , форсированная жизненная емкость легких (фЖЕЛ) менее 70% после пробы с бронхолитиком; наличие в анамнезе пневмонии, сахарного диабета, катаракты, ИВЛ, проведение трех и более курсов терапии ТГКС за последние три месяца. Пациентам с высоким риском обострения БА рекомендовался курс системными ГКС для профилактики жизнеугрожающего обострения Б A (Miller М.К., Lee J.H., Blanc P.D., 2006).
Реакция обратной транскрипции и полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
Известно, что БА, особенно тяжелого течения, характеризуется персистирующим воспалением, гиперреактивностью бронхов и нередко развитием резистентности к проводимой терапии. Роль атопии как фактора риска неоднозначна для различных фенотипов неконтролируемой БА: наибольший вклад этого механизма установлен у пациентов с «brittle» БА, наименьший - при БА с постоянной бронхообструкцией (Кобякова О.С., 2005).
Большинство больных БА имеют специфический паттерн воспаления в дыхательных путях, который характеризуется дегрануляцией тучных клеток, инфильтрацией эозинофилов и увеличением количества активированных клеток Th2. Th2 синтезируют IL4 и IL13, которые воздействуют на В-лимфоциты, приводя к продукции IgE; IL5 влияет на активность эозинофилов, IL9 регулирует пролиферацию и дифференцировку тучных клеток (Wills-Karp М., Chiaramonte М., 2003).
С точки зрения генетики, интересным фактом оказалось то, что гены IL4, IL5, IL9 и IL13 расположены в одном кластере в локусе 5q31-33. Гены IL4 и IL13 состоят из 4 экзонов и 3 интронов, находятся на расстоянии всего лишь 25 килобаз друг от друга и расположены в одном направлении, что послужило основанием предположить возникновение этих генов в результате дупликации в ходе эволюции.
Первые аллельные варианты были открыты в интронах (G543C в первом интроне и Т1922С в третьем интроне), а также в кодирующей части (A2043G и А2579С в транслируемом и 3 -нетранслируемом регионе, соответственно, четвертого экзона) гена IL13 (RosenwasserU., KlemmD.J., DresbackJ.K. et al.,1995). Позднее полиморфные варианты были определены в промоторном участке С1055Т гена IL13 (Noguchi Е., Shibasaki М., Arinami Т. et al., 1998).
Установлена связь гаплотипа С-589Т гена IL4 и Argl30Gln гена IL13 с БА и атопическим дерматитом. Описана ассоциация полиморфизма -703 С/Т гена IL5 с Б А. Кроме того, полиморфизм в З -UTR гена IL4, находящийся в сильном неравновесии по сцеплению с транзицией -589С/Т, может иметь прогностическое значение в отношении степени тяжести атопической БА. Выявлено, что полиморфные варианты генов IL4, IL5, IL9, IL4RA вносят небольшой (до 5-10%), но статистически значимый вклад в изменчивость количественных, патогенетических и клинических значимых для Б А признаков: показатели легочной функции, уровень иммуноглобулинов, гиперреактивность бронхов (Фрейдин М.Б., Пузырев В.П., Огородова Л.М. и соавт., 2002; Не J.Q., Chan-Yeung М., Becker А., 2003).
В американской и японской популяциях выявлено, что полиморфизм С-589Т гена IL4, связанный с более высокой продукцией IL4, ассоциирован с повышенным уровнем IgE в сыворотке крови и с клиническими проявлениями БА. Однако во французской популяции подобной ассоциации выявлено не было. При исследовании австралийской популяции показана ассоциация данного полиморфизма с увеличением специфического IgE к клещам домашней пыли, но не с увеличением общего IgE (Баранов B.C., 2009).
Исследовалась также связь между аллельными вариантами С-589Т гена IL4 и СРБА. Показано, что повышенная экспрессия аллеля -589Т определялась в группе больных СРБА по сравнению с гормоночувствительной БА (Sandford A.J., Chagani Т., Zhu S., 2000; Rosenwasser L., Klemn J.D., Klemn J.M. etal.,2001).
При обследовании больных БА, проживающих в Северо-Западном регионе России, было выявлено, что распределение генотипов IL4 у больных БА статистически значимо отличалось от контрольной группы. Так, частота генотипа -589СТ гена IL4 была больше у больных Б А (51,1%), по сравнению с контрольной группой (27,5%). Риск развития аллергической БА у мужчин при носительстве генотипа 590СТ гена IL4 увеличивался более чем в 11 раз. Следует отметить, что сочетание двух редких аллельных вариантов генов IL4 (-589Т) и IL4Ra (-576R) чаще встречалось в группе больных Б А по сравнению с контрольной группой практически здоровых людей; риск развития атопической БА при этом возрастал более, чем в 3 раза (Келембет Н.А., Гембицкая Т.Е., Иващенко Т.Э. и соавт., 2008).
Несколько типов клеток являются источниками IL13 и IL4: Т-лимфоциты, активированные тучные клетки, базофилы, эозинофилы, гладкомышечные клетки дыхательных путей. Свое действие IL13 и IL4 осуществляют посредством взаимодействия с рецепторами на поверхности клеток. Рецепторы к IL4 и IL13 представлены практически на всех клетках; отличием является то, что рецепторы к IL13 представлен на В-лимфоцитах, а к IL4 - на Т-лимфоцитах. Рецепторы обоих цитокинов обладают общей а-цепью (IL4R.cc), которая участвует в передаче сигнала внутрь клетки, тем самым реализуя функции этих цитокинов. Для IL-4 идентифицировано 2 типа рецепторов, один из которых состоит из альфа-субъединицы (IL4Ra) и общей для других цитокиновых рецепторов гамма-субъединицы (IL4Ry). Другой тип рецепторов представляет собой IL4Ra и альфа-субъединицу-1 рецептора к IL13 (IL13Ral). Последний тип рецептора способен передавать сигналы от IL4 и IL13, что и обеспечивает некоторое сходство их функций. Однако этот вариант рецептора не экспрессируется на Т-лимфоцитах; соответственно, с этим и связано отсутствие эффекта IL13 на данные клетки. Рецептор IL13 представляет собой гетеродимерный комплекс, состоящий из IL13Ra-cy6beflHHH4bi и либо низкоаффинной IL13Ral-, либо высокоаффинной IL13Ra2-cy6beflHHmjbi. Субъединица IL13Ral является связывающей. Субъединица IL13Ra2 препятствует проведению сигнала в клетку и, связываясь с IL13, блокирует его активность, являясь своеобразной «ловушкой» (Симбирцев А.С., 2007; Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008; Burchard E.G., Silverman Е.К., Rosenvasser L.J., 1999).
Распределение аллельных вариантов, обусловленных мутациями С3435Т гена MDR1, -С589Т гена IL4 и ArgBOGln гена IL13 у больных ИФА по сравнению с группами Б А и контроля
Среди больных БА с отягощенным наследственным анамнезом по аллергическим заболеваниям на уровне тенденции чаще встречался аллель 3435С (0,555) гена MDR1, а у пациентов без такового анамнеза - аллель 3435Т (0,441) (р=0,097). Причем у пациентов с Б А среднетяжелого течения генотипы 3435СС и 3435СТ гена MDR1 были ассоциированы с отягощенной наследственностью по БА (р=0,024).
При распределении генотипов у больных БА в зависимости от особенностей аллергологического анамнеза была выявлена статистически значимая ассоциация между полиморфными вариантами N363S гена NR3C1 и эпидермальной сенсибилизацией. В группе пациентов с признаками эпидермальной сенсибилизации генотип 363SN выявлен у 8,8%, а в группе без эпидермальной сенсибилизации - не выявлен ни у кого (р=0,021). При этом частота аллеля 363N гена NR3C1 в первой подгруппе составила 0,044, во второй - 0.
Было обнаружено различие на уровне тенденции в распределении генотипов Gln27Glu гена ADRB2 в подгруппах БА с наличием бытовой сенсибилизации и без таковой (р=0,082). У больных БА с повышенной чувствительностью к аллергенам домашней пыли аллель 27Glu гена ADRB2 встречался чаще (0,417) по сравнению с группой пациентов, у которой данной сенсибилизации не было (0,263).
Одним из проявлений побочного действия лекарственных средств является лекарственная аллергия. В группе больных БА с признаками лекарственной аллергии генотип 130ArgArg был выявлен у 100%, а в группе пациентов без лекарственной сенсибилизации - только у 25% (р=0,044). Больные ТБА с признаками пыльцевой сенсибилизации отличались по распределению аллельных вариантов Glyl6Arg гена ADRB2 от больных без данной сенсибилизации (р=0,047). У пациентов с наличием признаков пыльцевой аллергии аллель 16Gly встречался чаще (0,483), чем среди лиц без таковой сенсибилизации (0,300). Неудивительно, что и в отношении гомозиготного генотипа 16GlyGly гена ADRB2 была отмечена та же тенденция: генотип 16GlyGly был выявлен у 6 больных ТБА с пыльцевой сенсибилизацией (35,7%) и только у одного больного ТБА (14,3%) без вышеуказанной аллергии (р=0,076). У больных БА генотип 3435ТТ гена MDR1 чаще встречался в группе с наличием профессиональной сенсибилизации, чем в группе без таковой (3435ТТ=0,500 и 3435ТТ=0,120, соответственно; р=0,073). Мы обнаружили ассоциативные связи между клинико-патогенетическими вариантами БА и аллельными вариантами С3435Т гена MDR1, С-589Т гена IL4 и Gln27Glu гена ADRB2. У больных гормонозависимой БА преобладали генотипы 3435СС и 3435СТ гена MDR1 (р=0,022). Все пациенты с ТБА без признаков стероидозависимости были гомозиготами по аллелю 27Glu гена ADRB2, в то время как среди больных ГЗБА преобладали генотипы с аллелем 27Gln гена ADRB2 (р=0,039). Все больные БА без инфекционной зависимости были гетерозиготами -589СТ гена IL4. Ни у одного из 18 пациентов этой группы не было выявлено гомозиготное носительство по аллелям -589С и -589Т гена IL4, в то время как у больных с инфекционно-зависимым вариантом БА вышеперечисленные генотипы были представлены (р=0,007). Аналогичное распределение С-589Т гена IL4 было выявлено у больных ТБА без инфекционного зависимого варианта по сравнению с больными ТБА с наличием такового (р=0,048). Различия на уровне тенденции были отмечены в распределении генотипов Gln27Glu гена ADRB2 в подгруппах больных БА с наличием инфекционно-зависимого варианта БА и без такового варианта (р=0,060). При этом у больных инфекционно-зависимым вариантом БА частота аллеля 27Glu гена ADRB2 составила 0,414, а среди пациентов без инфекционной зависимости - 0,250. Следует отметить, что мы обнаружили также различие в распределении генотипов Gln27Glu гена ADRB2 у больных БА с сопутствующими функциональными нервно-психическими расстройствами и без таковых (р=0,025). У больных БА с изменением функционального состояния центральной нервной системы частота аллеля 27Glu гена ADRB2 была равна (0,500), в то время, как при отсутствии функциональных нарушений нервной системы -(0,333). Больные БА тяжелого течения статистически значимо различались по распределению генотипов С3435Т гена MDR1 в зависимости от наличия клинико-патогенетического нервно-психического варианта заболевания. В группе больных со смешанной БА тяжелого течения, в том числе с нервно-психическим вариантом, аллель 3435Т гена MDR1 был выявлен у 82,4%, а в группе пациентов без нервно-психического варианта - только у 40,0% (р=0,002). Пациенты с ТБА с измененным функциональным статусом центральной нервной системы в 2 раза чаще были носителями аллеля 3435Т гена MDR1 (0,500), в отличие от больных ТБА, у которых эти изменения отсутствовали (0,250). У больных БА была выявлена ассоциация между аллельными вариантами гена MDR1 и сопутствующей гипертонической болезнью. Было отмечено, что чем тяжелее была стадия гипертонической болезни, тем чаще встречался генотип 3435ТТ гена MDR1 (р=0,012; рис. 18).
