Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Роль инфекции при обострении хронической обструктивной болезни легких (обзор литературы) 17
1.1. Потенциальная роль инфекции в патогенезе ХОБЛ 17
1.2. Этиология инфекционного процесса при обострении ХОБЛ 20
1.3. Инфекция и цито-биохимические маркеры воспаления при обострении ХОБЛ 27
1.4. Цитоморфологическая характеристика воспаления у больных ХОБЛ30
1.4.1. Характеристика воспаления при обострении ХОБЛ по данным цитологического исследования индуцированной мокроты 30
1.4.2. Характеристика воспаления при обострении ХОБЛ по данным браш-биоптатов слизистой бронхов 34
1.4.3. Характеристика воспаления при обострении ХОБЛ по данным бронхобиоптатов 37
1.5. Роль провоспалителъных цитокинов (ИЛ-8, ФНО-а) при обострении ХОБЛ 41
1.6. Инфекция и ген макрофагального белка, ассоциированного с естественной резистентностью (NRAMP1) 46
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 49
2.1. Клиническая характеристика обследуемых 49
2.1.1. Клиническая характеристика пациентов с хронической обструктивной болезнью легких 49
2.2. Материалы для лабораторных исследований 55
2.3. Методы лабораторных исследований 56
2.3.1. Микробиологическое исследование мокроты 56
2.3.2. Определение антигенов Chlamydia pneumoniae и Mycoplasma pneumoniae в мокроте методом полимеразной цепной реакции 58
2.3.3. Определение титров IgM и IgG к Chlamydia pneumoniae и Mycoplasma pneumoniae в сыворотке крови иммуноферментным анализом 59
2.3.4. Определение ИЛ-8 и ФНО-а в сыворотке крови и мокроте 59
2.3.5. Цитологическое исследование индуцированной мокроты 60
2.3.6. Цитохимическое определение активности миелопероксидазы нейтрофилов в мазках крови и мокроты 61
2.3.7. Определение активности эластазы в плазме крови и мокроте 63
2.3.8. Определение активности трипсиноподобных протеиназ в плазме крови и мокроте 64
2.3.9. Определение активности агпротеиназного ингибитора и аг-макроглобулина в плазме крови и мокроте 64
2.3.10. Определение активности кислотостабильных ингибиторов в плазме крови и мокроте 66
2.3.11. Браш-биопсия и подсчет цитограмм браш-биоптатов 66
2.3.12. Эндобронхиальная биопсия и морфометрическая оценка биоптатов 68
2.3.13. Молекулярно-генетическое исследование 69
2.3.14. Методы статистического анализа, использованные в работе 71
ГЛАВА 3. Характеристика инфекционного процесса при обострении хронической обструктивнои болезни легких 75
3.1. Инфекция и колонизация при хронической обструктивной болезни легких 75
3.2. Этиология инфекционного процесса при обострении ХОБЛ в зависимости от возраста, курения, профессиональных вредностей и тяжести бронхообструкции 80
ГЛАВА 4. Цито-биохимические маркеры воспаления при обострении ХОБЛ 86
4.1 Сравнительная характеристика биохимических маркеров воспаления при обострении и в фазу клинической ремиссии ХОБЛ 87
4.2. Биохимические маркеры воспаления в зависимости от характера обострения ХОБЛ 93
4.3. Биохимические маркеры воспаления при обострении ХОБЛ в зависимости от фактора курения 119
4.4. Активность миелопероксидазы нейтрофипов при обострении и в фазу клинической ремиссии ХОБЛ 133
4.5. Активность миелопероксидазы нейтрофипов при обострении ХОБЛ в зависимости от этиологии инфекционного процесса 155
4.6. Влияние курения на активность миелопероксидазы нейтрофилов при обострении ХОБЛ 168
ГЛАВА 5. Цитоморфологическая характеристика воспаления при обострении ХОБЛ 179
5.7. Клеточный состав индуцированной мокроты при ХОБЛ в зависимости от фазы болезни, этиологии обострения и фактора курения 179
5.2. Цитологическая оценка бронхиальных браш-биоптатов у больных ХОБЛ в зависимости от фазы болезни, наличия и характера инфекционного агента и фактора курения 208
5.3. Цитоморфологическая характеристика биоптатов слизистой бронхов при обострении ХОБЛ 245
5.4. Функциональные связи между клиническими симптомами, ОФВ, биохимическими и цитоморфологическими маркерами воспаления при обострении ХОБЛ в зависимости от наличия инфекции и фактора курения 255
5.4.1. Анализ взаимосвязей между одноименными клетками и различными клеточными популяциями в индуцированной мокроте и браш-биоптатах слизистой бронхов 255
5.4.2. Анализ взаимосвязей между клетками браш-биоптатов, а также между клеточным составом браш-биоптатов и активностью протеиназ и ингибиторов в мокроте 268
5.4.3. Взаимосвязи между клиническими симптомами, ОФВ и цитоморфологическими маркерами воспаления при обострении ХОБЛ 278
ГЛАВА 6. Цитокиновый профиль (ИЛ-8, ФНО-А) крови и мокроты у больных хобл в зависимости от фазы болезни, этиологии обострения и фактора курения 288
ГЛАВА 7. Ассоциация полиморфных вариантов гена NRAMP1 с развитием хобл и с клиническими проявлениями заболевания 297
ГЛАВА 8. Обсуждение полученных результатов 308
Выводы 330
Практические рекомендации 333
Список использованной литературы 334
- Характеристика воспаления при обострении ХОБЛ по данным цитологического исследования индуцированной мокроты
- Цитохимическое определение активности миелопероксидазы нейтрофилов в мазках крови и мокроты
- Этиология инфекционного процесса при обострении ХОБЛ в зависимости от возраста, курения, профессиональных вредностей и тяжести бронхообструкции
- Активность миелопероксидазы нейтрофипов при обострении ХОБЛ в зависимости от этиологии инфекционного процесса
Введение к работе
Актуальность проблемы. Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) - одна из важнейших проблем современного здравоохранения, причем это характерно для всего мира в связи с постоянно возрастающей распространенностью и смертностью от этого заболевания [Биличенко Т.Н., 1994; Siafaras N.M. et al., 1995; Wilson R., Rayner C.F., 1995; Barnes P.J., 1997, 2003; ХОБЛ, Федеральная программа, 1999; Жук Н.А. и соавт., 2000; Чучалин А.Г., 2000, 2001, 2003; Лещенко И.В., 2002; GOLD, 2003]. По данным Всемирной организации здравоохранения по наносимому экономическому ущербу ХОБЛ с 12-го места в 1990 году переместится на 5-е место к 2020 году, опередив все другие заболевания респираторной системы, в том числе и туберкулез легких [Anto J.M. et al., 2000; Чучалин А.Г., 2000; Шмелев Е.И., 2000, 2003].
В России приблизительно 11 млн человек страдают ХОБЛ [Чучалин А.Г., 1998; ХОБЛ, Федеральная программа, 1999; Айсанов З.Р. и соавт., 2001; Овчаренко СИ., 2003] и, по прогнозам специалистов, в будущем будет отмечен неуклонный рост данной патологии как в развитых, так и в развивающихся странах [Anto J.M. et al., 2000; Овчаренко СИ., 2003; Шмелев Е.И., 2000, 2003].
ХОБЛ приводит к инвалидизации в среднем через 10 лет после установления диагноза и более чем в половине случаев это лица моложе 50 лет [Кокосов А.Н., 1999; Чучалин А.Г., 2002].
Драматизм и актуальность проблемы определяется не только широкой распространенностью ХОБЛ, но и высокой смертностью. В условиях ухудшающейся экологии при сохраняющемся темпе расширения табакокурения к 2020 году ХОБЛ, как причина смерти, выйдет на 3-е место во всем мире [Chen Z.M., 1977; Peto R. et al, 1992; Johansen J.M. 1994; American Thoracic Society Standarts, 1995; Murrey C.J., Ьорея A.D., 1997; Авдеев C.H., Чучалин А.Г., 1997; Zin B.Q. et al., 1998; Miller N. et al., 2000].
8 В настоящее время доказано, что воспаление играет доминирующую
роль в патогенезе ХОБЛ, а основой прогрессирования является активизация
хронического воспаления в дыхательных путях при обострении ХОБЛ, что в
результате приводит к формированию основных морфологических
проявлений болезни [Jerrey Р.К., 1991; Bergman R. et al., 1994; Stockley R.A.,
1996; Rennard S., 1997; Wilders Р.1., Dekhuijzen P.N.R., 1997; Rhaman J.Mac
Nee W., 1998; Чучалинг А.Г., 1998, 1999, 2001; Peleman et al., 1999, Anto J.M.
et al., 2000; Bhowmik A. Et al., 2000; Garsia-Aumerick J. et al.; Stockley R.A.,
Bayley D.L., 2000; Voelker M.F., Tuder R., 2000; Go L.D., 2003].
Инфекции бронхиального дерева традиционно рассматриваются как ведущая причина обострения ХОБЛ [Bariffi F. et al., 1995; Crimi N. et al., 1995; Шмелев Е.И. и соавт., 1996; Calwerley P.N.A. et al., 1999, Бартлетт Д.Д., 2000; Международные рекомендации. Лечение обострений ХОБЛ, 2003; Авдеев С.Н., 2003].
Однако взгляды исследователей о вкладе инфекции в патогенез хронического воспаления при ХОБЛ колеблются в широком диапазоне: от мнения о том, что эта роль выдающаяся [Wilson R., 1994; Khair О.A. et al., 1996; Soler N. et al., 1999; Murphy T.F. et al., 1992, 2000; Woodhead M., Schaberg Т., 2000; Бартлетт Д.Д., 2000; Sethi S., 2001; Grossman R.F., 2003], до утверждения, что инфекция - это только эпифеномен [Speizer F.E., Tager J.B., 1975; Tager J.B., Speizer F.E., 1979; Bent S. Et al., 1995; Fagon J.Y., Chaster, 1996; Bates D.V., 1998].
Примерно в 40-50% всех случаев причиной обострения ХОБЛ могут быть неинфекционные факторы [Wilson R., 1995; Martinez J., 1997; Синопальников А.И. и соавт., 1999; Дворецкий Л.И., 2001; Чучалин А.Г., 2002; Шмелев Е.И., 2002; Авдеев С.Н., 2003]. Бактериальные патогены выявляются у 50-60% больных с обострением ХОБЛ [Gump D.W. et al., 1976; Ball P., 1995; Dorca J., 1995; Faytard A. et al., 1995; Cole P., 1997; Leeper K.V. et al., 1997; Коваленко В.Л. и соавт., 1998; Eller J. et al., 1998; Huchon G., Woodhead M., 1998; Anzuetto A., 1999; DelamonicaP., 1999; Donner C.F., 1999;
9 Fein A. et al., 1999; Grossman R.F., 1999; Mirawilles M. et al., 1999; Niederman M.S., 1999; Wilson R., 1999; Zuck P. et al., 1999; Sethi S., 1999, 2000; Авдеев C.H. и соавт., 2000; Богданов М.Б., Черненькая Т.В., 2000; Палеев Н.Р., 2000; Sethi S., Murphy T.F., 2001; Barkli F. et al., 2002], тогда как роль атипичных микроорганизмов до настоящего времени неизвестна, так как практически отсутствуют комплексные исследования, направленные на выявление микоплазменной, хламидийной и бактериальной эндобронхиальной инфекции при обострении ХОБЛ.
Имеются сведения о том, что микроорганизмы поддерживают хроническое воспаление не столько непосредственно, сколько опосредованно через активацию основных клеток эффекторов: нейтрофилов, макрофагов, лимфоцитов, продуцирующих целый спектр биологически активных веществ: эластаза, миелопероксидаза, фактор некроза опухолей а, интерлейкин-8, а2-макроглобулин и др. [Маянский Д.Н., 1991; Полосухин В.В., 1997; Коваленко и соавт., 1998; Hoffken G., 2000; Stockley R.A., 2000; Tobin Martin J., 2001; Шмелев Е.И., 2003].
Мы не встретили работ, где бы проводилось комплексное, системное изучение цито-биохимических и цитоморфологических маркеров воспаления при ХОБЛ в зависимости от наличия и характера инфекции, о влиянии инфекционного фактора на активность и выраженность воспаления у курящих и некурящих больных ХОБЛ.
Отсутствуют, либо имеются единичные сведения в отношении этиологии обострения ХОБЛ в зависимости от возраста, фактора курения [Raman A.S. et al., 1983; Riise G.S. et al., 1994], профессиональных вредностей, степени тяжести бронхиальной обструкции [Eller J. et al., 1998; Miravilles М. et al., 1999].
Для диагностики и оценки степени тяжести обострения ХОБЛ используются критерии обострения болезни, основанные на выраженности клинических симптомов [Anthonisen N. et al., 1987; Ball P., et al., 1995; Dorca J., 1995; Кокосов A.H., 1999; Чучалин А.Г., 1998; Wilson R., 1999; Авдеев
10 C.H., 2003; Овчаренко СИ., Лещенко И.В., 2003], что предполагает существование взаимосвязей между клиническими проявлениями болезни и воспалением в дыхательных путях. Это положение пока не подтверждено научными данными, позволяющими ответить на вопрос: насколько клинические симптомы обострения ХОБЛ связаны с активностью воспалительного процесса в бронхах?
Учитывая, что не менее чем у трети больных обострение ХОБЛ имеет неинфекционный характер, важным представляется выявление наследственных факторов в формировании восприимчивости и резистентности к инфекционным агентам у больных ХОБЛ. В связи с этим перспективным может быть изучение одного из генов генома человека NRAMP1, который показывает ассоциации с рядом инфекционных заболеваний [Пузырев В.П. и др., 2002; Пузырев В.П.и др., 2002; Никитин Д.Ю., 2000].
Однако значение этого гена относительно восприимчивости к инфекционным агентам, а также функциональная значимость полиморфизмов этого гена при ХОБЛ не изучена.
Цель исследования: Опредение цито-биохимических и цитоморфологических маркеров воспаления и их взаимосвязи с клинико-функциональными параметрами при обострении ХОБЛ в зависимости от наличия и характера инфекционного агента; оценка вклада полиморфных вариантов гена NRAMP1 в предрасположенности к развитию обострений ХОБЛ инфекционного генеза.
Задачи исследования:
1. Изучить этиологию инфекционного процесса при обострении ХОБЛ в зависимости от возраста, фактора курения, профессиональных вредностей, степени тяжести бронхиальной обструкции.
Определить цито-биохимические маркеры воспаления в крови и мокроте при обострении ХОБЛ в зависимости от наличия и характера инфекционного агента.
Определить цитоморфологические маркеры воспаления при обострении ХОБЛ в зависимости от наличия и характера инфекционного агента.
Оценить влияние инфекционного фактора на активность и выраженность воспаления у курящих и некурящих больных ХОБЛ.
Изучить взаимосвязи между клиническими симптомами, показателями функции внешнего дыхания и биологическими маркерами воспаления при обострении ХОБЛ инфекционного и неинфекционного генеза.
Изучить уровень ИЛ-8 и ФНО-а в крови и мокроте в зависимости от наличия и характера инфекционного фактора.
Изучить активность воспалительного процесса при обострении ХОБЛ в зависимости от стадии болезни.
Провести анализ взаимосвязи полиморфных вариантов гена NRAMP1 с обострением ХОБЛ инфекционного генеза.
Научная новизна:
Впервые изучена этиология инфекционного процесса при обострении ХОБЛ в данном регионе (г. Томск). Установлено, что наиболее частым этиологическим агентом является S. pneumoniae. Показана значительная роль в этиологии обострения внутриклеточных патогенов: С. pneumoniae и М. pneumoniae.
Впервые дана комплексная оценка воспалительного процесса по данным исследования активности МПО нейтрофилов, протеиназ, их ингибиторов, уровню цитокинов в крови и мокроте, а также по данным цитологического исследования ИМ и цитоморфологического исследования браш- и бронхобиоптатов при обострении и в фазу клинической ремиссии ХОБЛ.
Впервые дана характеристика воспаления у больных ХОБЛ при разной этиологии инфекционного процесса. Установлена большая выраженность воспалительной реакции и повреждения бронхиального эпителия при обострениях, ассоциированных с Н. influenzae и С. pneumoniae. Показано, что меньшим повреждающим действием на эпителий слизистой бронхов обладают S. pneumoniae и М. catarrhalis.
Впервые изучен цитокиновый профиль крови и мокроты в отношении уровней ФНО-ос и ИЛ-8 при разной этиологии инфекционного процесса у больных ХОБЛ. Установлено, что наиболее высокий уровень ФНО-а в мокроте характерен для Н. influenzae, а в периферической крови - для внутриклеточных патогенов.
Показано, что имеют место качественно разные типы структурных реакций бронхиального эпителия: при воспалительном процессе, ассоциированном с инфекцией, наблюдается высокий уровень пролиферативной активности эпителиоцитов с исходом в плоскоклеточную метаплазию, тогда как при воспалении неинфекционной этиологии -истощение регенераторных процессов с развитием атрофии в слизистой бронхов.
Впервые изучена выраженность воспалительного процесса при обострении ХОБЛ в зависимости от стадии болезни.
Впервые проведен анализ взаимосвязи полиморфных вариантов гена NRAMPl с развитием ХОБЛ и клинико-функциональными проявлениями заболевания. Установлена роль гена NRAMPl в формировании клинических особенностей течения болезни, а также его значимость в регуляции активности ингибиторов протеиназ.
Практическая значимость работы
Установлена значительная роль инфекционных агентов в этиологии обострения ХОБЛ. Показано, что инфекция является активным соучастником воспалительного процесса, как при обострении, так и в фазу клинической ремиссии ХОБЛ. Уже при II стадии ХОБЛ имеет место высокая активность
13 воспаления, которая увеличивается при более тяжелых стадиях болезни, что подтверждает значение воспаления в прогрессировании ХОБЛ.
Полученные данные вносят вклад в понимание роли инфекции в патогенезе ХОБЛ и обосновывают необходимость проведения вакцинации против основных возбудителей инфекционного процесса (S. pneumoniae, Н. influenzae) и применения лекарственных препаратов, обладающих противовоспалительным эффектом уже при II стадии болезни (фенспирид).
Полученные результаты генетического исследования позволяют рекомендовать использование методов молекулярной диагностики для обследования населения с целью формирования групп риска по развитию ХОБЛ и для прогнозирования клинических особенностей течения заболевания. Сведения о влиянии аллельных вариантов гена NRAMP1 на уровень активности ингибиторов протеаз могут быть использованы в проведении прицельной терапии ХОБЛ, направленной на устранение дисбаланса в повреждающих и защитных системах.
Основные положения, выносимые на защиту
Инфекция играет важную роль в этиологии обострения ХОБЛ. Наиболее частым этиологическим агентом является пневмококк. Значимая роль в этиологии обострения принадлежит внутриклеточным патогенам. Курение и профессиональные вредности влияют на этиологию обострения ХОБЛ.
Инфекция - не эпифеномен, а активный участник воспалительного процесса при обострении ХОБЛ. Большая выраженность воспаления имеет место при обострении ХОБЛ инфекционной этиологии. На характер и выраженность воспаления при обострении ХОБЛ влияют курение и активность аІПИ в мокроте.
Имеют место особенности воспаления при инфекционной и неинфекционной этиологии обострения, а также у курящих и некурящих больных ХОБЛ.
Характер и выраженность воспаления зависят от вида конкретного возбудителя инфекционного процесса. Наибольшая выраженность воспаления и большая степень повреждения бронхиального эпителия характерны для обострений ХОБЛ, вызванных Н. influenzae и С. pneumoniae. Наименьшим повреждающим эффектом обладают S. pneumoniae и М. catarrhalis, последняя - в большей степени.
В фазу клинической ремиссии ХОБЛ сохраняется активный воспалительный процесс в бронхах. Микроорганизмы, колонизирующие нижний респираторный тракт, влияют на выраженность воспаления и в фазу клинической ремиссии ХОБЛ.
Только при I стадии ХОБЛ обострение характеризуется меньшей выраженностью воспаления в бронхах. Уже, начиная со II стадии болезни, имеет место высокая активность воспалительного процесса, выраженность которого остается высокой и даже увеличивается при прогрессировании болезни. Обострение ХОБЛ приводит к выраженному повреждению и структурной перестройке бронхиального эпителия.
Сроки манифестации хронической обструктивной болезни легких ассоциируются с 1465-85G/A полиморфизмом гена NRAMP1, в то время как степень выраженности бронхообструкции связана с D543N полиморфизмом этого гена. Активность ингибиторов протеаз связана с полиморфизмами D543N и 469+14G/C гена NRAMP1.
Внедрение результатов исследования.
Результаты исследования используются в работе пульмонологического отделения МКЛПМУ «Городская больница № 3» и других лечебных учреждений г. Томска. Данные диссертационной работы используются в учебном процессе при преподавании внутренних болезней на педиатрическом факультете СибГМУ и в Томском военно-медицинском институте.
15 Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Областной пульмонологической конференции по хронической обструктивной болезни легких (2003, Россия, г. Томск), на Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (2003, Россия, г. Санкт-Петербург), на Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (2004, Россия, г. Москва), Европейском респираторном конгрессе (2004, Шотландия, г. Глазго), Международном конгрессе по биотехнологиям (2004, США, г. Майами), представлены на Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (2001, 2002, Россия, г. Москва), Российской конференции «Современные проблемы антимикробной химиотерапии» (2002, 2003, Россия, г. Москва), Европейском респираторном конгрессе (2002, Швеция, г. Стокгольм), Европейском респираторном конгрессе (2003, Австрия, г. Вена), Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным болезням (2003, Великобритания, г. Глазго), Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным болезням (2004, Чехословакия, г. Прага), Европейском конгрессе по генетике человека (2003, Великобритания, г. Бирмингем).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 60 научных работ, из них 15 в центральной и 18 - в зарубежной печати. Получены два патента на изобретение.
Работа выполнялась: на кафедре внутренних болезней педиатрического факультета (заведующая - профессор Л.И.Волкова), кафедре биохимии и молекулярной биологии (заведующий - профессор В.Ю.Серебров), кафедре патологической анатомии (заведующий - профессор В.М.Перельмутер), кафедре медицинской генетики (заведующий - академик РАМН, профессор В.П.Пузырев), центральной научно- исследовательской лаборатории (заведующий - профессор А.Н.Байков) Сибирского государственного медицинского университета (ректор - член-корр. РАМН, профессор В.В.Новицкий).
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 394 страницах машинописного текста, иллюстрирована 70 таблицами и 85 рисунками и содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, 5 глав, отражающих собственные результаты, обсуждение полученных результатов и выводы. Список использованной литературы содержит 584 наименования, из них: 152 отечественных и 432 иностранных источников.
Характеристика воспаления при обострении ХОБЛ по данным цитологического исследования индуцированной мокроты
В настоящее время доказано, что индуцирование мокроты -практичный и удобный метод, обеспечивающий стандартизацию получения материала из нижних дыхательных путей при ХОБЛ, что весьма ценно для оценки их воспаления. Недавними исследованиями была показана пригодность ИМ для количественной оценки воспалительного процесса в бронхах [Pizzichini Е., Pizzichini М.М. et al., 1997; Jatakanov A., Kharitonov S., Lim S. et al., 1999; Cosio F.J., Holz 0., Kips J. et al., 1999; Jagaram L., Parameswaran K. et al., 2000; Kips J.C., 2002].
Чрезвычайно важным представляется тот факт, что ИМ отражает состояние слизистой респираторного тракта не только центральных, но и периферических отделов легкого [Magnussen Н., Hargreave F.E., 2000]. Однако к настоящему времени имеется небольшое количество исследований по изучению характера изменений индуцированной мокроты при обострении ХОБЛ [Peleman et al., 1999; Kips et al., 1996; Pavord, 2002; Keatings, Barnes, 1997] и на сегодняшний день практически отсутствуют данные о характере и выраженности воспаления при обострении ХОБЛ в зависимости от этиологии инфекционного процесса, о влиянии инфекционного фактора на выраженность воспаления у курящих и некурящих больных ХОБЛ.
Использованию метода индуцированной мокроты для оценки воспалительного процесса в бронхах при ХОБЛ посвящено немало работ. Более 100 лет известны изменения клеточного состава спонтанно отхаркнутой мокроты при бронхиальной астме, которые заключаются в увеличении количества эозинофилов [Jayaram L. et al., 2000]. Разработка методов исследования окрашенных мазков мокроты, пригодных для использования в клинической практике, происходила в 1950-70-е г.г. Однако при исследовании спонтанно отхаркнутой мокроты наблюдалась низкая воспроизводимость, низкая достоверность результатов исследования мокроты, поэтому метод применялся не очень широко. В последнее время количественная оценка мокроты стала более успешной благодаря методу индуцирования путем ингаляции гипертонического раствора соли и совершенствованию методов лабораторного исследования мокроты.
В исследованиях Belda J., et al. (2000), Jayaram L. et al. (2000) было показано, что у здоровых людей в индуцированной мокроте преобладают макрофаги и нейтрофилы, а эозинофилы и лимфоциты единичны. В работе Peleman R.A. et al (1999) сопоставлялся клеточный состав индуцированной мокроты (ИМ) больных ХОБЛ и здоровых волонтеров. В ИМ больных ХОБЛ содержалось большее количество нейтрофилов, выраженное в процентах, в ИМ здоровых преобладали макрофаги, и, по данным авторов, эти клетки находились между собой в реципрокных отношениях. Повышение содержания нейтрофилов обнаружено у больных с более выраженной степенью бронхообструкции [Pavord I.D., et al., 2002].
Таким образом, подтверждается предположение о том, что нейтрофильное воспаление мелких бронхов - важный фактор в патогенезе сужения просвета бронхов при ХОБЛ [Peleman R.A., et al, 1999]. Мелкие бронхи и бронхиолы - это место наиболее выраженных изменений при ХОБЛ, поэтому воспалительные изменения в мелких бронхах и бронхиолах коррелируют со степенью бронхолимитации. Предполагается, что ИМ может содержать элементы из нижних отделов бронхов, поэтому метод ИМ может быть использован для определения выраженности воспалительного процесса при ХОБЛ [Peleman R.A. et al., 1999].
В исследовании Jayaram L. et al., (1999) были разработаны нормы для клеточного состава ИМ, отклонение от которых может характеризовать как различные типы воспаления, так и различные причины, его вызвавшие. Так, например, повышение нейтрофилов в ИМ происходит под воздействием курения, поллютантов, эндотоксинов, инфекции, при стероидрезистентной астме; повышение лимфоцитов - при саркоидозе, инфекции Chlamidia pneumoniae; эозинофилия характерна для неконтролируемой астмы, эозинофильного бронхита без астмы, после экспозиции аллергенами и химическими раздражителями.
Повышение эозинофилов в ИМ рассматривается как одна из характерных особенностей бронхиальной астмы, причем повышение возможно только у сенсибилизированных лиц. На фоне лечения стероидами при стероидозависимой астме происходит снижение их количества [Pizzichini М.М. et al., 1999]. Повышение количества эозинофилов в ИМ характерно для эозинофильного бронхита без астмы, который диагностируется у больных с хроническим кашлем, имеющих нормальные показатели спирометрии и нормальную бронхиальную реактивность по данным метахолинового и аденозинмонофосфатного тестов [Hagreave F.E. et al., 1994]. Считается, что эозинофильный бронхит может быть как транзиторным, так и персистирующим, в этом случае он требует постоянной стероидной терапии [Hagreave F.E. et al., 1994; Wong A. G. et al., 1996].
Среди причин нейтрофилии мокроты важное место занимает курение, особенно, если оно сопровождается хронической бронхолимитацией [Pizzichini Е. et al., 1996]. Увеличение количества нейтрофилов в мокроте может быть связано с действием поллютантов, эндотоксинов, либо инфекции [Keating V.M. et al., 1997; Barnes P.J. et al., 1998; Jayaram L. 1999]. Количество нейтрофилов в мокроте при ХОБЛ варьирует от 38 до 80% и коррелирует со снижением ОФВі [Peleman R.A. et al., 1999; Pavord I.D., et al., 2002], что подтверждает гипотезу о связи нейтрофильного воспаления и степенью бронхообструкции.
По данным J.Belda et al. (2000), в ИМ здоровых лиц по сравнению с больными ХОБЛ макрофаги являются преобладающими клетками. Выявленные в мокроте больных ХОБЛ макрофаги, по данным иммуноцитохимии, являются активированными [Яковлев М.Ю. и соавт., 1991; Lohmann-Matthes M-L., et al., 1994].
Цитохимическое определение активности миелопероксидазы нейтрофилов в мазках крови и мокроты
Титры IgM и IgG к Chlamydia pneumoniae определялись иммуноферментной тест-системой «Хлами Бест» ЗАО «Вентор-Бест», а к Mycoplasma pneumoniae - иммуноферментной тест-системой «Trynity biotex» США согласно рекомендациям производителя.
В основе метода - реакция связывания антитела со специфическими полисахаридами или белками возбудителя (антигеном), фиксированными на твердой фазе. Меченые антитела связываются с комплексом антиген-антитело, непрореагировавшие комплексы удаляются. Степень связывания оценивается по степени выраженности цветной реакции на спектрофотометре.
Использовали твердофазный иммуноферментный анализ на основе стандартного набора реагентов ProCon TNF-a ООО «Протеиновый контур» и тест-системы для определения ИЛ-8 000 «Цитокин» в соответствии с рекомендациями производителя.
Перед определением уровня цитокинов в указанных средах сыворотку крови дефибринировали, а в мокроте определяли белок микробиуретовым методом с помощью реактива Бенедикта [Кочетов Г.А.]. В пробирку помещали 400 мкл мокроты, добавляли 400 мкл дистиллированной воды, встряхивали, центрифугировали при 3000 об/мин 15 минут. Затем к надосадку приливали 800 мкл NaOH и 80 мкл реактива Бенедикта. Содержимое пробирки перемешивали и оставляли при комнатной температуре. Через 15 минут спектрофотометрировали при 330 нм. Концентрацию белка в мокроте определяли с помощью калибровочной кривой, используя стандартный раствор белка (70 г/л или 70 мг/мл). При расчете содержания белка в мокроте учитывали степень разведения мокроты. Концентрацию выражали в мг/мл, после чего уровень цитокинов в мокроте пересчитывали на 1 мг белка.
Проводилась ингаляция 3 - 5%-ного гипертонического солевого раствора в течение 3 -10 минут, во время или после которой пациенты откашливали мокроту.
До начала процедуры больными выполнялась ингаляция сальбутамола (200 мкг, 2 вдоха). До и после каждого сеанса ингаляции проводилось измерение объема форсированного выдоха за одну секунду (ОФВ]). Ингаляции проводились сеансами по 7 минут, общая продолжительность ингаляции не превышала 30 минут, для индукции мокроты использовался ультразвуковой небулайзер. Гипертонический солевой раствор готовился непосредственно перед исследованием. Каждые 7 минут ингаляции концентрацию гипертонического раствора повышали на 1 %, то есть последовательно использовали 3-, 4-, 5%-ные солевые растворы. При снижении показателя ОФВі на 10% концентрацию гипертонического раствора больше не повышали, при. снижении ОФВ1 на 20% или при появлении респираторных симптомов (удушье, свистящее дыхание) ингаляцию прекращали. После первого сеанса ингаляции и в дальнейшем после каждого последующего сеанса пациенты тщательно полоскали рот и глотку и откашливали мокроту в специальную посуду. При получении удовлетворительного образца мокроты процедуру прекращали. Исследование мокроты проводилось сразу после получения материала.
Качество материала оценивали на основании полученного объема мокроты и степени примеси к ней слюны. Наиболее подходящие для исследования слизистые слепки размерами 4,5 х 9 мм с минимальными примесями слюны использовались для дальнейшего исследования. На следующем этапе материал диспергировали и гомогенизировали 1%-ным раствором трипсина. Раствор трипсина готовили непосредственно перед исследованием и добавляли к мокроте в соотношении 1 мл трипсина на 1 мл мокроты. Далее смесь мокроты с трипсином инкубировали в термостате при температуре 37 С в течение 30 минут, по окончании инкубации смесь гомогенизировали при помощи магнитной мешалки в течение 10 минут, клеточную суспензию отмывали в физиологическом растворе, фильтровали через нейлоновую марлю и центрифугировали в течение 10 минут при 1500 об/мин. Затем в камере Горяева определяли число клеток, их жизнеспособность, готовили мазки, окрашенные по Романовскому - Гимзе. Цитологическое исследование окрашенных препаратов проводилось на светооптическом бинокулярном микроскопе "Биолам Ломо». При микроскопии цитологических препаратов подсчитывалось 400 клеток и определялось процентное содержание каждого типа клеток с последующим пересчетом на абсолютное значение. Цитограмма индуцированной мокроты включала следующие виды клеток: макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, лимфоциты.
Принцип метода основан на окислении бензидина системой перекись водорода - пероксидаза. Мазки крови и мокроты, высушенные на воздухе, фиксировали 40%-ным спиртовым раствором формалина в течение 50 секунд, затем промывали в проточной воде 1-2 минуты. После этого мазки на 5 минут помещали в свежеприготовленный пероксидазный реактив: 10 мг бензидина растворяли в 6 мл 96%-ного этилового спирта, добавляли 4 мл дистиллированной воды и 0,02 мл 3%-ного раствора перекиси водорода. Подготовленные таким образом мазки тщательно промывали в проточной воде, высушивали. Затем дополнительно окрашивали по методу Нохта - Максимова 10 минут [Меньшиков В.В., 1987]. В цитоплазме клеток, дающих положительную реакцию на пероксидазу, видны гранулы от желто-зеленого до коричневого цвета.
Результаты оценивали полуколичественным методом с использованием принципа Astaldi, основанном на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски [Astaldi G., Verga L., 1957]. Для количественного выражения результатов подсчитывали 100 сегментоядерных нейтрофилов, которые в зависимости от выраженности специфической окраски делили на 4 группы:
Этиология инфекционного процесса при обострении ХОБЛ в зависимости от возраста, курения, профессиональных вредностей и тяжести бронхообструкции
В научных источниках до настоящего времени существуют противоречивые мнения о роли инфекции при обострении ХОБЛ, что, вероятно, связано с отсутствием комплексных исследований, направленных на выявление вирусной, микоплазменной, хламидийной и бактериальной эндобронхиальных инфекций.
Роль вирусов в данной работе не исследовалась, но по литературным [Ball P. et al., 1995, 1998; Anzuetto А., 1998; Дворецкий Л.И., 2001, Fagon J.Y. et al., 1996, Paley et al., 2000] и собственным данным [Штейнгардт Ю.Н., Букреева Е.Б., 1988], вирусная инфекция в большинстве случаев встречается в ассоциации с бактериями, либо микоплазмами.
С целью изучения этиологии инфекционного процесса при обострении ХОБЛ было обследовано 103 больных, у которых обострение заболевания, кроме клинической картины, было подтверждено результатами цитологического исследования индуцированной мокроты и браш-биоптатов слизистой бронхов.
Этиологическая структура обострений ХОБЛ представлена на рис. 2. Инфекция как этиологический фактор обострения ХОБЛ выявлена у 72 больных (70%), а у 31 больного (30%) в нижнем респираторном тракте не обнаружена хламидийная, бактериальная или микоплазменная инфекция. В таблицах и далее в тексте для краткости мы использовали словосочетания «неинфекционный процесс», «неинфекционное обострение», хорошо понимая, что вопрос об отсутствии инфекции спорен, так как вирусная инфекция не исследовалась. Вместе с тем положение о том, что в 20-50% случаев причинами обострения ХОБЛ являются неинфекционные факторы, поддерживается рядом исследователей [Коваленко В.Л. и соавт., 1998;
Синопальников А.И. и соавт., 1999; Чучалин А.Г., 2002; Шмелев Е.И., 2002 -2003; Wilson R., 1995; Ball P., 1995; Niederman M.S., 1999; Sethi S., 1999, 2000; Barkli F. et al., 2002]. Таким образом, достоверно чаще имел место инфекционный характер обострений ХОБЛ с преобладанием моноинфекции (табл. 5).
При обострениях, ассоциированных с моноинфекцией, были выделены следующие этиологические агенты: S. pneumoniae - у 18 (38%), М. pneumoniae - у 14 (30%), С. pneumoniae - у 6 (13%), Н. influenzae - у 5 (11%), Enterobacter spp. - у 1 (2%), М. catarrhalis у 3 (6%) больных соответственно. Причем пневмококковая и микоплазменная инфекции статистически значимо преобладали над остальными (р 0,05). Этиология обострений ХОБЛ, ассоциированных с микстинфекцией, представлена в таблицах 6, 7. р 0,001 по сравнению с частотой встречаемости микоплазм. В 100%) случаев, достоверно чаще, по сравнению с другими возбудителями, был выявлен S. pneumoniae, приблизительно с одинаковой частотой в ассоциации с М. catarrhalis, С. pneumoniae и Н. influenzae. Тогда как М. pneumoniae в ассоциации с другими возбудителями встречалась достоверно реже, чем в моноинфекции, что совпадает с данными M.G. Tobin (1997).
С помощью критерия Крускала-Уоллеса была проанализирована частота встречаемости отдельных патогенов во всей группе инфекционных обострений ХОБЛ, то есть независимо от того, имела место микст-, либо моноинфекция. Достоверно чаще в качестве основного возбудителя обострений ХОБЛ был выявлен S. pneumoniae, что составило 41,7% (р 0,001), далее приблизительно с одинаковой частотой: С. pneumoniae (16,5%), М. pneumoniae (14,6%), Н. influenzae (14,6%) и М. catarrhalis (12,6%). обострениях ХОБЛ наиболее часто встречающимся возбудителем является S. pneumoniae, как в качестве единственного этиологического агента, так и в ассоциации с другими микроорганизмами. Н. influenzae, М. pneumoniae, С. pneumoniae и М. catarrhalis встречаются приблизительно с одинаковой частотой, однако М. pneumoniae достоверно чаще в качестве единственного патогена, тогда как остальные возбудители в виде микробных ассоциаций. У 30% больных инфекционную природу обострений ХОБЛ подтвердить не удалось.
В настоящее время принято выделять 2 формы сосуществования микроорганизма и хозяина при ХОБЛ: колонизация и инфекция [Чучалин А.Г., 1998; Бартлетт Д.Д., 2000; Murphy T.F. et al., 1992; Monso E. et al., 1995; Martinez J., 1997; Wilson R., 1998, 1999; De Bentzmann S. et. al., 2000; Stockley R.A. et al., 2000; Sethi S., 2001].
Под колонизацией понимают наличие микроорганизмов в нижнем респираторном отделе при стабильном течении ХОБЛ, то есть вне обострения. Для решения вопроса о частоте и характере колонизации при стабильном течении ХОБЛ обследовано 53 больных в фазу клинической ремиссии. В фазу клинической ремиссии микроорганизмы были выделены только у 41,5% больных, что достоверно реже, чем в период обострения ХОБЛ (р 0,001). Нижний респираторный тракт колонизируют практически те же микроорганизмы, которые были выделены при обострении ХОБЛ. Однако имеет место тенденция увеличения частоты выделения Н. influenzae и С. pneumoniae по сравнению с обострением ХОБЛ, хотя статистические различия не достоверны (табл. 8). Тогда как М. pneumoniae и S. pneumoniae были обнаружены достоверно реже, а М. catarrhalis не выделена ни в одном случае стабильного течения ХОБЛ.
В какой степени этиология обострений ХОБЛ зависит от возраста? В научных источниках нам не удалось найти сведений по данному вопросу. На рис. 3 представлены результаты исследования этиологии обострений ХОБЛ в различных возрастных группах. Значимые различия выявлены внутри группы 20-30 лет и 60-80 лет, а также между группой 20-30 лет и группами 45-59 лет и 60-80 лет, что позволило с определенной достоверностью утверждать, что у лиц до 30 лет частота обострений ХОБЛ, вызванных одним этиологическим агентом, выше, чем обострений, ассоциированных с микст-инфекцией (р 0,01). В то время как в возрастной группе 60-80 лет моноинфекция встречалась достоверно реже, чем инфекционный процесс, вызванный ассоциацией микроорганизмов (р 0,01). Кроме того, количество неинфекционных обострений увеличивается в старших возрастных группах (46-60 лет и 60-80 лет) и значимо различается по сравнению с возрастной группой 20-30 лет (р 0,01).
Общепринято, что наиболее важной причиной ХОБЛ является курение. Вместе с тем, имеются лишь единичные сведения об этиологии инфекционного процесса при обострении ХОБЛ в зависимости от фактора курения. Так, приводятся данные о том, что курение предрасполагает к инфицированию определенными видами микробов, а именно, S. pneumoniae [Raman A.S. et al., 1983] и H. influenzae [Riise G.C., 1998], а также, что характер инфекции определяется не только фактором курения, но и его интенсивностью [Lipsky В.А. et al., 1986].
Активность миелопероксидазы нейтрофипов при обострении ХОБЛ в зависимости от этиологии инфекционного процесса
Исходя из этого, мы провели сравнительный анализ этиологии инфекционного процесса в зависимости от наличия в анамнезе профессиональных вредностей и продолжительности их действия на больного.
При наличии профессиональных вредностей достоверно чаще имели место неинфекционные обострения ХОБЛ - у 40,6% больных по сравнению с 12,8%) больных, не имевших отягощенного профессионального анамнеза (р=0,02). Обострения ХОБЛ, ассоциированные с микст-инфекцией, встречались в обеих группах приблизительно с одинаковой частотой: 25,6% и 23,4% больных. При анализе частоты обострений, вызванных одним этиологическим агентом, значимые различия получены только в отношении S. pneumoniae, который был выделен у 33,3% больных без профессиональных вредностей в анамнезе и только у 7,8 % с отягощенным профессиональным анамнезом (р=0,0013).
Сопоставлена также этиология обострений ХОБЛ у пациентов с отягощенным профессиональным анамнезом в зависимости от его длительности: первая группа - профессиональный анамнез менее 15 лет и вторая группа — 15 и более лет. С увеличением длительности воздействия профессиональных вредностей достоверно увеличивается количество обострений, ассоциированных с микст-инфекцией: 6,2% больных первой группы и 28%о больных второй группы (р=0,048), тогда как частота неинфекционных обострений - 57,1%о и 36%о больных и обострений, обусловленных моноинфекцией - 35,7% и 36% больных, в обеих группах статистически достоверно не различались (р=0,13, р=0,64 соответственно).
Существует мнение, что имеется взаимосвязь между легочными функциями и вероятными патогенами, ответственными за обострение ХОБЛ. В двух недавних исследованиях [Miravilles М. et al., 1999; Eller J. et al., 1998] была установлена корреляция между типом бактерий, выделенных от больных в период инфекционного обострения, и степенью функциональных нарушений. Так, М. Miravilles и соавт. (1999) установили, что при инфекции Н. influenzae наблюдается большая степень нарушения легочных функций, которые оценивались по ОФВр Однако по данным J. Eller и соавт. (1998) частота обострений, ассоциированных с инфекцией Н. influenzae, была приблизительно одинаковой среди больных с различной степенью снижения ОФВі. Мы провели анализ ОФВі во всей группе обследованных больных ХОБЛ (п=103) в зависимости от наличия и характера инфекционного агента. Показатели ОФВі значительно не отличались как при инфекционном и неинфекционном обострении ХОБЛ (60,9±19,7% по сравнению с 52,0±19,3%, р=0,11), так и при моно- и микст-инфекции (61,2±18,9% по сравнению с 60,5±21,3%, р=0,84). Вместе с тем, статистически значимые различия ОФВі выявлены только в отношении трех возбудителей: так, наиболее низкие значения ОФВі имели место при инфекции Н. influenzae - 44,8±7,4% и С. pneumoniae -54,5±11,7%, а наиболее высокое при инфекционном процессе, вызванном М. catarrhalis - 74,9±7,4% (р=0,034, р=0,042 соответственно).
При обострениях, ассоциированных с другими этиологическими агентами, ОФВі достоверно не различался и составил, соответственно, при инфекции S. pneumoniae - 65,5±13,8% и М. pneumoniae - 63,7±10,4%. Также проведен сравнительный анализ этиологии обострений ХОБЛ в зависимости от тяжести бронхиальной обструкции, в первую очередь, в отношении частоты инфекционных и неинфекционных обострений. При I и II стадиях ХОБЛ (согласно GOLD, 2003) обострения, ассоциированные с инфекцией, имели место приблизительно в 3 раза чаще, чем неинфекционные обострения: при I стадии - у 74,5% и 25,7% больных (р=0,008), при II стадии - у 77,5% и 22,5% больных (р=0,0013). При ОФВ, менее 50%о от должного частота инфекционных и неинфекционных обострений ХОБЛ достоверно не различалась и составила при III стадии 52% и 48% (р = 0,62), а при IV стадии - 62,5% и 37,5% (р=0,31). Подводя итог результатов этой части исследования, можно констатировать, что в 70% случаев обострения ХОБЛ имеют инфекционную этиологию. Наиболее значимым этиологическим агентом является S. pneumoniae, тогда как обострения ХОБЛ, ассоциированные с Н. influenzae, либо внутриклеточными патогенами (М. pneumoniae, С. pneumoniae), встречаются практически в 3 раза реже. При этом М. pneumoniae по сравнению с С. pneumoniae выявляется достоверно чаще в виде моноинфекции, тогда как С. pneumoniae чаще в ассоциации с другими патогенами. Спектр микробов, колонизирующих нижний респираторный тракт в стабильную стадию ХОБЛ, практически тот же, что и при обострении болезни. Однако достоверно реже выделяются S. pneumoniae и М. pneumoniae и отсутствует М. catarrhalis, тогда как частота выделения Н. influenzae и С. pneumoniae статистически не отличается от таковой в период обострений ХОБЛ. Имеются существенные различия в этиологии обострений ХОБЛ в зависимости от возраста, курения, профессиональных вредностей и степени тяжести бронхиальной обструкции. Следующие разделы работы являются попыткой выявить особенности воспаления при обострении ХОБЛ в зависимости от наличия и характера инфекционного агента.
![Неинвазивные методы оценки воспаления в бронхах при бронхиальной астме и хронической обструктивной болезни легких [Электронный ресурс]](/i/i/4359/203421.png "Неинвазивные методы оценки воспаления в бронхах при бронхиальной астме и хронической обструктивной болезни легких [Электронный ресурс] Боярко Валентина Владимировна")
