Неинвазивные методы оценки воспаления в бронхах при бронхиальной астме и хронической обструктивной болезни легких [Электронный ресурс] Боярко Валентина Владимировна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 12

1.1. Исследование индуцированной мокроты - неинвазивный метод мониторинга воспаления при БА и ХОБЛ. 12

1.1.1. Цитологический состав индуцированной мокроты у здоровых, больныхБАиХОБЛ... .;... .12

1.1.2. Изменения цитологического состава индуцированной мокроты при БА и ХОБЛ на фоне лечения. 16

1.1.3. Сопоставимость методов индуцированной мокроты, брашби-опсий, бронхоальвеолярного лаважа... 17

1.2. Окись азота - маркер воспаления при заболеваниях дыхательных путей 19

1.2.1. История исследования и биосинтез оксида азота. 19

1.2.2. Биохимия синтезаN0 и его источники в легких человека...21

1.2.3. N0 как маркер активности воспаления воздухоносных путей при бронхиальной астме ..22

1.2.4. Изменения выдыхаемого N0 при ХОБЛ ...23

1.2.5. Методы оценки активности синтезаЖ) в легких 24

Глава 2. Материал и методы исследования. 28

2.1. Материал исследования. 28

2.2. Методы исследования. ...31

2.2.1. Клинико-функциональная оценка больных 31

2.2.2. Индуцирование мокроты и цитологическое исследование мазков мокроты 32

2.2.3. Бронхоальвеолярный лаваж и цитологическое исследование бронхиальных смывов 33

2.2.4. Определение NO в индуцированной мокроте, бронхиальных смывах, конденсате паров выдыхаемого воздуха спектрофотометрически с реактивом Грисса 34

2.2.5. Статистическая обработка данных .36

Глава 3. Результаты собственных исследований ..37

3.1. Сравнение цитологического состава индуцированной мокроты и бронхиальных смывов у больных БА и ХОБЛ.. 37

3.1.1. Цитологический состав индуцированной мокроты у больных БА, взаимосвязи между разными показателями клеточного состава 37

3.1.2. Цитологический состав индуцированной мокроты у больных ХОБЛ, взаимосвязи между разными его составляющими .43

3.1.3. Сравнение цитологического состава индуцированной мокроты и бронхиальных смывов у больных БА и ХОБЛ 47

3.2. Изменения цитологического состава индуцированной мокроты у больных БА и ХОБЛ на фоне лечения. ... 52

3.2.1. Изменения цитограмм индуцированной мокроты и: клинико-функционального состояния на фоне лечения у больных БА . ..52:

3.2.2. Изменения цитограмм индуцированной мокроты и клинико-функционального состояния на фоне лечения у больных ХОБЛ 53

3.3. Сравнение содержания метаболитов NO в конденсате паров выды хаемого воздуха, индуцированной мокроте, бронхоальвеолярных смывах у здоровых и больных БА и ХОБЛ. 63

3.3.1. Содержание метаболитов NO в конденсате паров выдыхаемого воздуха у больных БА ..63

3.3.2. Содержание метаболитов N0 в конденсате паров выдыхаемого воздуха у больных ХОБЛ по сравнению с БА ...66

3.3.3. Сравнение содержания метаболитов N0 в конденсате паров выдыхаемого воздуха, индуцированной мокроте и бронхоальвнолярных смывах у больных БА и ХОБЛ 69

3.3.4. Содержание метаболитов NO в конденсате паров выдыхаемого воздуха у больных БА и ХОБЛ на фоне медикаментозной терапии.. 72

3.4. Корреляционные связи между клеточным составом индуцированной мокроты, бронхоальвеолярных смывов и уровнем N0 в конденсате паров выдыхаемого воздуха, индуцированной мокроте и лаважной жидкости..—79

3.4.1. Взаимосвязи между клеточным составом индуцированной мокроты и бронхоальвеолярных смывов и уровнем метаболитов NO в конденсате паров выдыхаемого воздуха, индуцированной мокроте, жидкости бронхоальвеолярного лаважа при БА.. 79

3.4.2. Взаимосвязи между клеточным составом индуцированной мокроты и бронхоальвеолярных смывов: и уровнем метаболитов NO в конденсате паров выдыхаемого воздуха, индуцированной мокроте, жидкости бронхоальвеолярного лаважапри ХОБЛ. .80

3.5. Значимость цитологических показателей индуцированной мокроты и бронхоальвеолярных смывов и содержания метаболитов в конденсате паров выдыхаемого воздуха, индуцированной мокроте и бронхоальвеолярных смывах для дифференциальной диагностики БА и ХОБЛ .85

Глава 4. Обсуждение результатов исследования .96

Выводы 106

Практические рекомендации 107

Список литературы

• Изменения цитологического состава индуцированной мокроты при БА и ХОБЛ на фоне лечения.
• Клинико-функциональная оценка больных
• Цитологический состав индуцированной мокроты у больных БА, взаимосвязи между разными показателями клеточного состава
• Изменения цитограмм индуцированной мокроты и: клинико-функционального состояния на фоне лечения у больных БА

Введение к работе

Актуальность проблемы: По данным мировой статистики, заболеваемость бронхиальной астмой и хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) неуклонно растут. Отмечается так же утяжеление течения этих заболеваний [7-9]. По современным представлениям БА и ХОБЛ характеризуются как хроническое воспаление слизистой бронхов [42,43,45,153]. Поэтому целью многих современных исследований является поиск маркеров воспаления для оценки степени тяжести и эффективности противовоспалительной терапии этих болезней.

До последнего времени бронхиальное воспаление определялось путем исследования клеточных и биохимических составляющих бронхоальвеоляр-ного лаважа, брашбиопсий, биопсийного материала слизистой бронхов. Однако эти процедуры не могут повторяться многократно [1]. Следовательно, неинвазивные методы, и, в частности, исследование индуцированной мокроты, могут служить альтернативой для изучения воспаления в бронхах [122]. ИМ может быть использована для изучения клеточных и неклеточных показателей воспаления и, т. о. служить для оценки интенсивности воспаления при острых и хронических заболеваниях легких (БА, ХОБЛ) [1,84,92,105,161-164]. Она, по мнению ряда исследователей, отражает картину воспаления в бронхах и удобна для мониторинга этого воспаления [161-164]. Однако к настоящему времени имеется сравнительно небольшое количество исследований, посвященных изучению ИМ при ХОБЛ. Нет четких критериев оценки ее клеточного состава при разных формах БА как в период обострения, так и во время ремиссии. Разноречивы данные о взаимосвязи клеточного состава ИМ, БАЛ, ББ. Эти вопросы требуют дальнейшего изучения, поскольку они имеют практическое значение.

Особую роль в развитии воспаления воздухоносных путей при БА играет окись азота (N0) [6,39,48,57,202]. Имеющиеся на сегодняшний день экспериментальные данные позволяют предполагать, что синтез N0 эпителиальными клетками в воздухоносных путях является специфичным по отно-

, 7 шению к атопическому воспалению [23,24,87]. С тех пор, как установлено,

что уровень N0 в выдыхаемом воздухе больных БА значительно выше, чем у здоровых, определение N0 стало использоваться для оценки активности воспаления и эффективности противовоспалительной терапии при БА [6,39,57,58].

Несмотря на то, что уже существует коммерческое оборудование и разработаны практические рекомендации по оценке NO, результаты исследований относительно роли и места NO в клинической практике продолжают оставаться неоднозначными. Это связано не только с условиями определения, но и с неднородностью самого показателя у больных БА [21,57]:

Т. о., изучение цитологического состава ИМ и уровня NO при БА и XOBJIj исследование их роли в диагностике и дифференциальной диагностике этих заболеваний, имеет важное теоретическое и практическое значение.

Цель исследования: Изучение возможности использования клеточного состава индуцированной мокроты и метаболитов N0 в конденсате выдыхаемого воздуха, индуцированной мокроте, бронхиальных смывах в оценке активности воспаления в бронхах и эффективности терапии при бронхиальной астме и хронической обструктивной болезни легких.

Задачи исследования:

1. Изучить цитологический состав индуцированной мокроты у больных бронхиальной астмой и ХОБЛ, его изменения на фоне медикаментозной терапии и сопоставимость с цитологическим составом бронхоальвеоляр-ных смывов.

2. Изучить содержание оксида азота в индуцированной мокроте, бронхиальных смывах и конденсате паров выдыхаемого воздуха и его динамику на фоне медикаментозной терапии при бронхиальной астме и ХОБЛ.

''.-.".'. ⁸

3. Оценить взаимосвязи между клинико-функциональными параметрами:,
уровнем метаболитов NO^fи клеточным составом индуцированной мокро
ты и бронхоальвеолярных смывов.

4. Оценить диагностическую и дифференциально-диагностическую значи
мость показателей цитологического состава ИМ и содержания метаболи-
tobNOb конденсате паровшыдыхаемого воздуха при БА и ХОБЛ;

Научная новизна работы

Настоящее исследование позволило уточнить и дополнить имеющиеся? представления о характере воспалительных изменений в бронхах при бронхиальной астме и хронической обструктивной болезни легких.

Впервые одновременно' исследованы уровни метаболитов NO в конденсате паров выдыхаемого воздуха, индуцированной мокроте и бронхиальных смывах у больных бронхиальной астмой и ХОБЛ. Установлены взаимосвязи между содержанием^; нитритов^ в КИВВ; ИМ¹ и БО и такими^ клинико-функциональными показателями у больных Б А иХОБД как степень тяжести, уровеньОФВ і и; срок болезни. Установлены взаимосвязи между уров-немметаболитов^ОвКПВВ;;ЙЩБС с такими эффекторными клетками-ИМі: и БС,какімакрофаги, эозинофилы при ЭкБА, нейтрофилы при ЭнБА. У больных ХОБЛ такая связь обнаружена с нейтрофилами; и лимфоцитами ИМ и БЄ. Этопозволяет рассматривать содержание метаболитов NO в исследованных жидкостях, как критерий выраженности воспаления в бронхах при БА и ХОБЛ.

Проведено параллельное исследование изменений- в* клеточном составе ИМ и уровне нитритов в КПВВ при БА и^ ХОБЛ на фоне медикаментозной терапии; Обоснована возможность использования ИМ и определения уровня' метаболитов N0 в КНВВ в качестве маркеров обострения и критерия эффективности противовоспалительной терапииприБА и ХОБЛ.

9 Внедрение результатов исследования:

Результаты исследования внедрены в практику лечебной деятельности пульмонологического и терапевтического отделений городской больницы № 3 г.Томска. Полученные данные используются в лекционном материале по внутренним болезням для студентов лечебных факультетов СибГМУ и слушателей ТВМедИ.

Апробация работы:

Материалы диссертации доложены на XV Европейском респираторном конгрессе (2005 г, Копенгаген), итоговой научно-практической конференции Томского военно-медицинского института (2005 г., г. Томск). Материалы работы представлены на VIII Международной конференции (2002 г., Турин), научно-практической конференции «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (2005 г., Красноярск). Диссертация апробирована на заседании кафедры внутренних болезней педиатрического факультета (2006 г., г. Томск).

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Практическая значимость работы

Выявленные различия в клеточном составе индуцированной мокроты больных БА и ХОБЛ позволяют использовать метод ИМ, как дополнительный объективный критерий для диагностики и дифференциальной диагностики этих заболеваний и для оценки выраженности воспалительного процесса в бронхиальном дереве при этих заболеваниях и эффективности медикаментозной терапии.

Определение метаболитов NO в конденсате паров выдыхаемого воздуха может быть использовано как дополнительный неинвазивный и доступный критерий диагностики Б А и контроля эффективности противовоспалительной терапии при БА и ХОБЛ.

10 Полученные данные, свидетельствующие о вовлечении в воспалительный процесс бронхиального дерева не только в фазу обострения, но и в фазу ремиссии БА и ХОБЛ расширяет наши представления о патогенезе и обосновывают необходимость длительной противовоспалительной терапии.

Положения, выносимые на защиту:

3. Клеточный состав индуцированной мокроты близок к таковому в бронхоальвеолярных смывах по содержанию эффекторных клеток и отражает воспалительный процесс в бронхах при бронхиальной астме и ХОБЛ.

4. Оксид азота (N0) является маркером интенсивности воспаления в бронхиальном дереве при бронхиальной астме. Уровень метаболитов в конденсате паров выдыхаемого воздуха, индуцированной мокроте и бронхоальвеолярных смывах зависит от выраженности обструкции, степени тяжести и длительности болезни.

5. При обострении ХОБЛ, в отличие от бронхиальной астмы, имеет место более низкая концентрация метаболитов N0 в конденсате паров выдыхаемого воздуха, супернатанте индуцированной мокроты и бронхоальвеолярных смывов. Содержание метаболитов N0 зависит от степени тяжести ХОБЛ.

4. На фоне лечения ИКС в цитограммах индуцированной мокроты
больных бронхиальной астмой снижается количество эозинофилов, лимфо
цитов и нейтрофилов, увеличивается доля макрофагов, уменьшается цитоз. В
клеточном составе индуцированной мокроты при ХОБЛ на фоне медикамен
тозного лечения увеличивается доля макрофагов, снижается цитоз, количест
во нейтрофилов и лимфоцитов. Уровень метаболитов N0 в конденсате паров
выдыхаемого воздуха на фоне лечения ИКС значительно снижается уже че
рез 1,5 месяца даже у больных, не достигших клинической ремиссии заболе
вания, и продолжает снижаться через 3 месяца. В фазу ремиссии у больных
ХОБЛ происходит снижение концентрации метаболитов N0 в конденсате

11 паров выдыхаемого воздуха, которая приближается через 3 месяца к показателям контроля.

5. В диагностике разных форм бронхиальной астмы достоверно значимыми оказались следующие показатели идуцированной мокроты - содержание эозинофилов, нейтрофилов, макрофагов; в бронхоальвеолярных смывах — уровень нейтрофилов, макрофагов, бронхиальных эпителиоцитов с признаками дистрофии, плоскоэпителиальных клеток, бокаловидных клеток, лимфоцитов. Для дифференциальной диагностики бронхиальной астмы и ХОБЛ высоко информативным оказалось определение метаболитов N0 в конденсате паров выдыхаемого воздуха, индуцированной мокроте, бронхоальвеолярных смывах, а также составляющие цитограмм индуцированной мокроты -эозинофилы, нейтрофилы, макрофаги и бронхоальвеолярных смывов - те же клетки и бронхиальный эпителий нормального строения. :

Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 39 таблиц, 2Г рисунок, состоит из введения и следующих глав: обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждения, выводов и практических рекомендаций: Библиографический указатель содержит 46 отечественных и 172 зарубежных источника.

12 " ' ГЛАВА!

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Исследование индуцированной;мокроты- неинвазивный метод мониторинга воспаления при Б А и: ХОБ Л.

1.1.1. Цитологический;состав индуцированной⁵мокроты у здоровых, больных БА и ХОБЛ:

Исследование мокроты является одним из наиболее достоверных диагностических- методов; используемых в клинике легочных заболеваний; Неоспоримым; достоинством^ является^ относительная простота, забора- материала; для исследования и получения информации о возбудителях, инфекции, а также природе и; выраженности воспалительного процесса в дыхательных путях [1]^;.

До последнего-времени бронхиальное воспаление определялось путем_; исследования клеточных и биохимических составляющих БАЛ-иББ. Однако;эти процедуры не всегда хорошо переносятся,больными, не;рекомендуются при;, обострении заболевания, при выраженной бронхиальной обструкции j не:могут повторяться многократно [1,85].

Следовательно, неинвазивные методы, такие, как исследование HMj могут служить альтернативой дляшзучения воспаления в бронхах, механизмов обострения и ремиссии; эффективности проводимого лечения [163-165]. Метод впервые был предложен для диагностики рака легких и туберкулеза в. 60-е годы, а в 80-е годы-получил широкое; применение для диагностики ифекции Pneumocystis carinii [1]. Кроме того, в настоящее время метод ИМ широко используется, в диагностике цитомегаловирусной инфекции, токсо-^: плазмоза, а также для диагностики банальных бронхолегочных инфекций [1].

Индуцирование мокроты проводится 3-5 % гипертоническим расг TBopoMNaGl. По данным; литературы, таким методом удается получить мокроту в 76-100 % случаев* в томчислеу здоровых людей [168]. Механизм повышения продукции мокроты после ингаляции гипертонического раствора не

із ".,''

вполне ясен. Возможной причиной является осмотический эффект повышения притока жидкости в просвет дыхательных путей вследствие осмотического градиента, повышения сосудистой проницаемости, стимуляции секреторной активности слизистых желез, мукоцилиарного клиренса [1,85,96].

Кроме выявления инфекционных агентов, наиболее интересным является, пожалуй, то, что ИМ может быть использована для изучения клеточных и неклеточных факторов воспаления (маркеров воспаления), содержащихся в дыхательных путях и т.о. служить для оценки интенсивности воспаления при острых и хронических заболеваниях легких (БА, ХОБЛ и др.), их активности и тяжести. Использовать ИМ с этой целью предложили Pin J. и коллеги в 1992 г [210].

Piccichini и коллеги в своих исследованиях доказали, что метод ИМ является неинвазивным, надежным и достоверным [126,127,195]. Наибольшее число работ по изучению процессов воспаления при помощи ИМ проведено у больных БА, в последние годы опубликованы данные таких исследований при ХОБЛ. Не смотря на относительно большое количество исследований, данные о цитологическом составе мокроты у разных авторов значительно отличаются. Во все работах, посвященных описанию клеточного состава ИМ при БА, указывается на высокое содержание в ней макрофагов, эо-зинофилов, нейтрофилов, относительно низкое - лимфоцитов. В тоже время уровень эозинофилии значительно отличается в разных исследованиях и колеблется от 3,8 до 39,4 %. Процент нейтрофилов также весьма вариабелен — 7,5 и 30,5 % по данным разных авторов [130,141,149,170,179]. Содержание лимфоцитов в ИМ больных БА выше, чем у здоровых, но по сравнению с другими клетками воспаления - низкое. Заметной особенностью клеточного состава ИМ у больных ХОБЛ, по данным разных авторов является - нейтро-филия (до 80 %), содержание эозинофилов от менее 1 до 2-3 % [170,179,196]. Т.е. уточнение клеточного состава при БА и ХОБЛ требует дальнейших исследований.

14 Исследований, посвященных изучению клеточного состава^ ИМ при

хронических заболеваниях легких, к настоящему времени проведено относительно большое количество, в связи с этим возникла необходимость.ее изучения у здоровых, таких работ очень немного и данные отличаются у разных авторов значительно. Клеточный состав ИМ у здоровых отличает высокое содержание макрофагов, довольно высокое - нейтрофилов и низкое, менее чем по одному проценту - эозинофилов и лимфоцитов [114,123,124,127,130,156,157,172]. Высокая нейтрофилия стала:объектом изучения некоторых авторов; Вначале ее связали с самой процедурой индуцирования- но в последних работах получены данные об отсутствии:ее влияния на состав.ИМ [170]. Кроме того, появились исследования, говорящие о; естественном* преобладании нейтрофилов в верхних дыхательных путях с постепенным снижением их содержания к периферическим бронхам. Т. е. нейтро- филия - может служить доказательством происхождения - ИМ преимущественно из крупных бронхов [62,157]. Всеми авторами подчеркивается необходимость дальнейшего исследования ИМ у здоровых, это необходимо для^ стандартизации методики: и^ разработки нормальных показателей клеточного состава ИМ:.

В ряде исследований изучалась возможность использования ИМ; для диагностики формы БА, степени тяжести, стадии. Получены противоречивые результаты. По данным EujimotO/И др. число и процент эозинофилов в ИМ при¹ тяжелой астме значительно выше, чем при;легком,течении (39,4 и 9,2 %, соответственно^ р<0,05) [106]. Ronchi и соавторы показали, что эози-нофилы ИМ могут быть использованы для выявления больных БА, т. к. количество эозинофилов в мокроте астматиков.больше, чем у здоровых и больных ХОБЛ [93,118-121]. Однако для верификации степени тяжести БА их использование ограничено. Даже у больных с легкой астмой имеется активный воспалительный процесс в бронхах, который находит свое- отражение в по- вышенном числе эозинофилов в ИМ [93,106,139;152,192].

В ряде исследований было показано, что степень активации эозинофилов более адекватно отражает воспалительный процесс в дыхательных путях, чем общее число или процент эозинофилов [35,200]. Наиболее изученными гуморальными факторами ИМ при БА являются высокоосновные протеины,.высвобождающиеся из гранул эозинофилов, в частности — эози-нофильный катионный протеин (ЕСР). В исследовании Ronchi и др. выявлена слабая, но достоверная корреляционная связь между концентрацией ЕСР в мокроте и исходным уровнем ОФВі_; а гиперреактивность бронхов коррелировала и с ЕСР индуцированной мокроты^ и с ЕСР сыворотки крови [93,106,109^214]. Это исследование показало: во-первых, что активированные эозинофилы являются источником ЕСР в мокроте, при том, что уровень ЕСР коррелирует с числом эозинофилов; во-вторых, взаимосвязи данных исследования ИМ с бронхиальной обструкцией имеют глубокий клинический смысл; в-третьих, подтверждено предположение о том, что ни эозинофилы, ни:ЕСР не отражают точно клиническую тяжесть. БА [152Д93]. Кроме того показано, что исследование уровня эозинофилови ЕСР в ИМ посравнению с их:содержанием в.периферической крови у больных БА, является более чувствительным И' специфическим методом оценки воспаления; в дыхательных путях [93,111,112,128,131,132]. .

При обследовании больных хронической обструктивной патологией легких одним из ключевых вопросов является дифференциальная диагностика между БА и ХОБЛ. Сегодня не вызывает сомнений тот факт, что как патогенез, так и терапевтические подходы к этим заболеваниям существенно различаются. На современном этапе эти заболевания рассматриваются' как хронические воспалительные процессы дыхательных путей; Если при астме организация воспалительного процесса в значительной мере связана с эозино-филами, то для ХОБЛ характерен нейтрофильный тип воспаления. Центральное место в патогенезе: Х0БЛ; принадлежит полиморфноядерным лейкоцитам, альвеолярным макрофагам и лимфоцитам [188-190]. Нейтрофилы и макрофаги являются эффекторными клетками ответственными за тканевое по-

. ,._ri '.., ....' ,-. .:. . , . 16 .

вреждение при ХОБЛ^! [14,15]. Нейтрофилы под влиянием, различных стимулов активируются и секретируют в слизистой бронхов ^больных ХОБЛ большое количество протеаз, в частности , эластазы. Избыток и повышенная активность нейтрофильной эластазы при ХОБЛ приводят к повреждению бронхиальной стенки, гиперсекреции слизи и нарушению мукоцилиарного клиренса [104, 188,189].

Повышенное количество-Т-лимфоцитов в слизистой бронхов находят, как при БА, так и при ХОБЛ, что свидетельствует о ранней и постоянной их активации при воспалении. При ХОБЛ' показано увеличение числа лимфоцитов (CD3H-, CD8+, GD25+, VbA-1-f, HLA-DR+) и повышение числа OD8+ в настоящее время считают биологическим маркером ХОБЛ [12,27,28];

К настоящему времени проведено сравнительно небольшое количество¹ исследований, посвященных изучению ИМ: при: ХОБЛ: У' больных ХОБЛ в ИМ' отмечается значительное повышение числа и процента нейтро-филов по; сравнению: со здоровыми лицами и больными БА. Это показано в исследованиях Keatings, Peleman и др [141,179]. Была выявлена корреляционная связь между процентным содержанием нейтрофилов'в ИМ*и степенью; бронхиальной обструкции, оцениваемой по показателю ОФВ\. Кроме того, Peleman пишет, о том, что при-индуцировании мокроты удаетсяіполучить материал из нижних дыхательных путей, т. е: методика может быть, использована для изучения бронхиального воспаления при: ХОБЛ- [179]; В. качестве гуморальных маркеров воспаления в ИМ, отражающих активность нейтро-фильного воспаления, чаще всего используются миелопероксидаза (МПО), человеческий нейтрофильный липокаин (ЧНЛ), интерлейкин-8 (ИЛ-8) и фактор некроза опухоли-а^: (TNF- а). Уровень этих факторов у больных ХОБЛ оказался существенно повышенным в ИМ, по сравнению со здоровыми лицами и пациентами с БА, при чем у курящих ИЛ-8 был достоверно выше, чем у некурящих [170; 194,198,202]. Особый интерес вызывают свидетельства об участии эозинофилов в процессах воспаления при ХОБЛ-[56]. В.исследовании Keatings и др. [141] в ИМ наблюдалось повышение абсолютного числа

17 эозинофилов приХОБЛ по, сравнению со здоровыми лицами, хотя и менее

выраженное, чем при БА. Кроме того, в ИМ также было обнаружено повышение уровня основных эозинофильных белков — ЭКП и ЭПО, их тесная корреляция с числом эозинофилов [141,213].

1.1.2. Изменения цитологического состава индуцированной мокроты при БА и ХОБЛ на фоне лечения.

В немногочисленных исследованиях, где ИМ использовалась, как критерий оценки эффективности противовоспалительной терапии, получены противоречивые данные. В одних описывается достоверное снижение выраженности эозинофилии в ИМ на фоне лечения ИКС, в других не обнаружено разницы в цитограммах ИМ [1,23,37,47,60,67-71,89,171,175,195,205,211]. Работы некоторых зарубежных авторов показали, что эозинофилы ИМ более чувствительны по сравнению с уровнями эозинофилов крови, ЕСР сыворотки и даже выдыхаемого оксида азота (NO) [115,125,178]. Клиническое улучшение наступает раньше, чем появляются изменения в клеточном составе ИМ и наоборот, выраженность эозинофилии ИМ возрастает и опережает клиническое ухудшение состояния больных астмой [63,65,93,95]. Это может свидетельствовать о том, что исследование цитологического состава ИМ более достоверный критерий эффективности лечения и выраженности воспалительного процесса в бронхах [136-138,140,142,148,150,155,161,181,182]. Кроме того, в ряде работ изучается значимость уровня эозинофилии ИМ, как прогностического критерия ответа на терапию ИКС и пероральными гормонами [72,73,95,96]. В них показано, что больные с изначально высоким уровнем эозинофилов ИМ (выше 3 %), лучше отвечают на такую терапию, чем пациенты с низким содержанием эозинофилов или отсутствием их. Не все обнаруживают такую зависимость [102,110,174]. Такую разноречивость полученных данных, вероятно, можно связать с малочисленностью групп наблюдения (от 7 до 18 человек), небольшими сроками наблюдения. Все авторы подчеркивают необходимость дальнейшей работы в этом направлении.

18 ,.

1.1.3. Сопоставимость методов индуцированной мокроты, бронхиальной брашбиопсии, бронхиальной биопсии и бронхоальвеолярного лаважа.

Безопасность и неинвазивность метода ИМ позволяет рассматривать его как альтернативу бронхоскопическим методам для мониторинга воспаления_;в бронхах. В этой связи в последнее время появились работы, посвященные-информативности и сопоставимости метода ИМ, ББ, БББ и БС. Эти работы единичны и результаты их неоднозначны [74,75]. По данным большинства авторов ИМ^; больных БА по сравнению БС содержит большее число эозинофилов и нейтрофилов, и меньшее — лимфоцитов и макрофагов [1,38,41,68,84,85].

В^ исследовании; Fahy и: др. показано,; что ИМ отличается от БС и; жидкости БАЛ более высоким содержанием неэпителиальных клеток и ЭКП [102]. Количество эозинофилов и ЕСР в ИМ более тесно коррелировало с их уровнем в БС, чем в жидкости БАЛ; Это исследование выявило, что в-ИМ; более высокое содержание бронхиального секрета, и высокая; концентрация клеток воспаления [102]. Другое исследование также подтвердило близкий качественный состав клеточных элементов ИМ- БС, жидкостшБ А Л: и ББ [85]. Эта работа подтвердила близкий качественный состав клеточных элементов в ; ИМР и материалах, полученных: при помощи бронхоскопии [134,135]. Обнаружены корреляционные связи между эозинофилами^ ИМ; БС и жидкости БАЛ, а также - лимфоцитами ИМ и жидкости.БАЛ: [86].

Mbodley с соавторами [170] заинтересовал вопрос: не является* ли повышенное, по сравнению с жидкостью БАЛ, количество нейтрофилов в ИМ следствием ингаляции гипертонического раствора поваренной соли? Сделаны выводы, что более высокое содержение нейтрофилов.в ИМ зависит, главным образом, от того «вклада», который вносится в этот относительно большой нейтрофилез ИМ, нейтрафилами трахеи и проксимальных бронхов. Местное же воздействие гипертонического раствора, если и повышает уровень нейтрофилов'в слюне, то незначительно, и не может влиять на уровень нейтрофилов в ИМ [170]. Другие исследования взаимосвязей между ИМ и

БАЛ либо не обнаруживают, либо выявляют лишь тенденции к положительным корреляциям [157].

Если же говорить о ХОБЛі то до настоящего; времени практически, не исследованы; параллели между маркерами воспаления в ИМ- БАЛ и ББ. при этом заболевании. В немногочисленных исследованиях отмечается, что в ИМ выше процент нейтрофилов и ниже - макрофагов и лимфоцитов по сравнению .с жидкостью БАЛ [46,64^66,76,82,83,86]. Процент сквамированных эпителиальных клеток в жидкости БАЛ выше, а цитоз,. напротив, выше по; сравнению с ИМ, [76,114,133,162,197,198;218]: Ни в;одном исследовании, не обнаружено корреляционных связей?между клеточным составом: БС, жидкости БАЛ и ИМ-при ХОБЛ: Кроме TorOj в этих исследованиях былшмалочисленные группы (7 — 10 человек). Малое число таких-сравнительных^исследований вызывает необходимость, дальнейшей работы; в этом направлении: Это? важно: для поиска¹ неинвазивного метода мониторинга- воспаления' в бронхиальном: дереве и ответа:на вопрос: может ли служить метод ИМ альтернативой БА.ЩББ и БББшр№ бронхиальной астме и ХОБЛ: .-.-'

1.2. Окись азота-маркер воспаления*, при заболеваниях дыхательных

'.Путей... . ;

1.2.1. История исследования и биосинтез оксида^азота:.

Особуюроль в развитии* воспаления воздухоносныхпутей приБА^^ играет окись азота.(ЪЮ) [40,59]: Окись азота — газ,.один из оксидов азота, обна-руживаемый в атмосфере в концентрации от 1 до 600 ppb [6]. Исследования; последних лет выяснили, что N0 - один из важнейших биологических ме-диаторовг в организме человека [5;6,20,21,40]: Хотя эмпирически доноры окиси азота используются в медицине более века (W. Murrell использовал нитроглицерин для лечения стенокардии в: 1879 г.) [6], только последние 10-15 лет стали более ясными механизмы участия: окиси азота во многих физиологических и патофизиологических процессах: большинства систем организма: сердечно-сосудистой (регуляция тонуса и структуры сосудов, антитром-

20 ботическое действие), дыхательной (бронхорасширяющее действие), нервной (участие в регуляции гладких мышц сосудов, бронхов, пищеварительной и мочеполовой систем, возможный медиатр функции памяти и болевой рецепции), иммунной (регуляция воспаления и иммунной защиты) [40,49,59,101]. В 1991 г. Gustafsson и др. обнаружили окись азота в выдыхаемом воздухе у животных и здоровых людей, с этого времени началась «новейшая история» исследования NO в медицине [113]. В дальнейшем Харитонов, Alving с помощью хемилюминесцентного анализатора выявили повышенные уровни NO в выдыхаемом воздухе у больных с БА и с бронхоэкта-зами [40,51,98,129]. Что позволило думать, что неинвазивный метод определения N0 в выдыхаемом воздухе можно использовать для диагностики, а возможно, и мониторинга активности воспаления при хронических заболеваниях легких [51,58,59,61,163,164,203].

В организме NO является продуктом 5-электронного окисления одного химического эквивалента гуанидинового азота L-аргинина ферментом

NO-синтазой [6].

Семейство NO- синтаз (NOS) состоит из трех основных изоформ. Функционально выделяют конститутивные и индуцибельные NO-синтазы. Конститутивные: нейрональная NO-синтаза (nNOS), выделенный из мозга Са-зависимый фермент (тип І) в основном экспрессируется в центральной и периферической нервной системе, но также обнаружен в других тканях, таких как поперечно-полосатые мышцы, плацента; эндотелиальная NO-синтаза (eNOS, тип Ш), которая также является Са - зависимой, обнаруживается в клетках эндотелия сосудов [5,18,21,79,196]. Индуцибельная изо-форма (iNOS, тип П) не присутствует постоянно, но синтезируется de novo в различных типах клеток, таких как макрофаги, гладкомышечные клетки, кардиомиоциты и клетки микроглии'под действием воспалительных стимулов, iNOS является Са- независимой, она источник больших количеств NO [87].

21 Изоферменты NO-синтаз являются сложными гемопротеинами, содержащими две идентичные, функционально независимые субъединицы, каждая из которых имеет молекулярную массу. Каждая изоформа имеет одинаковое строение каталитических доменов: карбоксиредуктазная часть с центрами связывания ФАД, ФМН и НАДФН, и аминооксигеназная часть, с которой связан кальмодулин, необходимый для перехода электронов с редуктазного на оксигеназный домен. Важным отличием eNO-S и nNG-S ОТ iNO-C, является то, что конститутивные ферменты связывают кальмодулин и активируются при физиологических изменениях концентрации Са²⁺, тогда как iNO-C уже связана с кальмодулином и активируется при крайне низких кон-центрацияхСа in vivo [18,169].

1.2.2. Биохимия синтеза N0 и его источники в легких человека.

Источником оксида азота в легких здорового человека являются, по всей видимости, эпителиальные клетки бронхов и альвеолоциты [6,18-22,40]. Эти клетки способны к экспрессии эндотелиальной и нейрональнои NO-синтаз. которые являются конститутивными. Применение селективного ингибитора индуцибельной NO-синтазы - аминогуанидина у здоровых добровольцев не приводит к снижению уровня оксида азота в выдыхаемом воздухе, однако оказывает значительный супрессивный эффект на уровень выдыхаемого оксида азота у больных бронхиальной астмой [6]. Применение системных и ингаляционных кортикостероидов у больных бронхиальной астмой приводит к снижению уровня N0 до нормальных показателей, тогда как применение преднизолона у здоровых добровольцев не ведет к изменению концентрации N0 в выдыхаемом воздухе [6]. Эти данные указывают на то, что у здоровых людей основным источником синтеза оксида азота является конститутивная NO-синтаза, тогда как у больных бронхиальной астмой -преимущественно индуцибельная, которая экспрессируется в макрофагах, эпителиальных клетках, нейтрофилах, эозинофилах [22,113]. Различные исследования показывают, что клеточный источник N0 в нижних дыхательных

22'. . _i .,.

путях не до конца ясен. Выдыхаемый NO, вероятнее всего образуется на по
верхности альвеол. Эпителиоциты дыхательных путей также содействуют
образованию N0 в нижних отделах респираторного тракта, экспрессйруя как
eNOS^ так и' nNOS [6,40]. Уровни NO- в носу и носоглотке выше, чем регист-
- рируемые при дыхании через. рот, т. е. верхние дыхательные; пути являются
главным источником NO, по крайней мере у здоровых- но часть NO даже у
здоровых людей образуется в нижних отделах респираторного тракта. Про
дукты метаболизма NO, нитриты и- нитрозотиолы, присутствуют в БАЛ у
здоровых людей' [18i24j25]. Прямое измерение уровня NO в трахее и главных
бронхах при БФЄ у пациентов с астмой показало также его повышение, как и
при:измерении во; рту. Т.о:, при БА>. повышается образование N0 в нижних
дыхательных путях. Имеется; жесткажкорреляция- между уровнями NO;. изме
ренными в бронхах и:во рту [143-145]. . .

1.2.3; NO^,;какмаркер активности воспаления воздухоносных путей;при

бронхиальной астме. ..:

Определение выдыхаемого N0 используется как способ оценки актив-. ности воспаления и эффективности противовоспалительной терапии при . бронхиальной; астме [58-61]. Обнаружена тесная корреляционная связь между уровнем выдыхаемого NOh бронхиальной гиперреактивностью в тесте с метахолином' и относительным содержанием эозинофилов в индуцированной мокроте [117,146,178]. В- ряде работ было показано; что повышенные уровни оксида.азота в выдыхаемом воздухе связаны с выраженностью клинических симптомов астмы и наличием контакта с аллергеном [77,97,113]. Применение ингаляционных и системных кортикостероидов, антилейкотриеновых препаратов при бронхиальной астме приводит к значительному снижению содержания NO в- выдыхаемом воздухе больных, что коррелирует с клиническим улучшением, [6,40^48^59,146,147]. Определение активности синтеза, оксида азота в дыхательных путях может быть полезным средством в диагностике кашлевого варианта бронхиальной астмы. У пациентов с хроническим каш-

' ²³ '.'.'

лем, являющимся следствием бронхиальной; астмы, содержание N0^; в выдыхаемом воздухе значительно выше, чем у пациентов с кашлем неастматического происхождения [42]. Исследования синтеза NO при проведении провокационной пробы; с причинно-значимым: аллергеном показали, что содержание оксида азота повышается в позднюю фазу астматического ответа и не меняется при ингаляции гистамина [31,173]. Данные наблюдения? подтверждают взаимосвязь повышенной продукции NO и атопического воспаления^ имеющегоместопри»бронхиальной астме.

Известно, что* выделение NO увеличивается; при обострении астмы, в позднюю фазу ответа.на аллерген, когда противовоспалительные; цитокины вызывают экспрессию-iNOS [6Д8,40,57,187]. Иод влиянием;противовоспалительной терапии глюкокортикоидамирег os или ингаляционно происходит снижение уровня N0 до нормального [147,164,178,203,209]: При?; уменыне-нишдозы ИКС уровни.Ш); возрастают, при чем" динамика NO опережает изменения других функциональных тестов [178]. Повышенные: уровни, выдыхаемого N0 уменьшаются в течение 48 часов от начала'терапии метилпред-низолона* [40]; Пока точно не выяснено, является* ли повышенное образованием)' только маркером цитокин-опосредованного воспаления;или оно способствует сужению бронхов.,

Хотя не вызывает сомнения тот факт, что NO является/маркером» активности воспалительного процесса при БА, в ряде работ не получено убедительных данных о тесных связях между уровнем экспирируемого NOj степенью гиперреактивности бронхов и симптомами заболевания [158Ц59]. Противоречивость результатов обнаруживает необходимость дальнейших исследований в этой области!

Г.2.4. Изменения выдыхаемого N0 при ХОБЛ;

. Применение измерения уровня выдыхаемого N0: для оценки воспаления в бронхах при-ХОБЛ еще предстоит установить. По данным некоторых

авторов NO не повышается в стабильную ф азу ХОБЛ [ 144]. Объясняется это несколькими причинами, включая хроническое курение и окислительный стресс [48,144]. Значительно более низкие уровни выдыхаемого и назального NO обнаруживались у курящих по сравнению с некурящими [143,184]; Это может быть объяснено частично?необратимым подавлением NO-синтазы экстрактом сигаретного >дыма, или превращением;N0 в.пероксинитрит, высвобождаемый нейтрофилами [48,144]. .

Выдыхаемый; NO- может играть роль в распознавании пациентов с; тяжелой, неконтролируемой ХОБЛ; которые имеют повышенный уровень N0 в выдыхаемом воздухе [100-185]; Это можно; объяснить выраженным; нейтро-фильным воспалением и микробной инфекцией,у пациентов с тяжелой ХОБЛ' [92]: .

Известно, что эозинофилы присутствуют в мокроте при; хроническом бронхите и ХОБЛ; в частности .во время- обостренийг[;г14]; По данным Rutgers, выдыхаемый N0 коррелирует с процентным содержанием эозино-филовш мокроте при ХОБЛ¹ [167]. Однако; в отличие от астмь^ тканевые эозинофилы, встречающиеся; при ХОБЛ^ не дегранулируют и не связаны с повышеннойэкспрессией-интерлейкина-5 [108; 114]. Возможно, разные уровни; NO при стабильной: и тяжелой* ХОБЛ обусловлены разными легочными механизмами, этот вопрос еще требует изучения; Разные авторы получают противоречивые результаты относительно уровня NO при ХОБЛ, что возможно связано с разными; методологическими подходами авторов, разнородностью изучаемых групп больных, а также это может быть связано с вариабильно-стью симптомов ХОБЛ у обследуемых пациентов¹ [108, Г44Д 67].

1.2.5. Методы оценки активности синтеза NO в легких.

Наличие NO в выдыхаемом воздухе было впервые продемонстрировано в 1981г., с тех пор; основным способом оценки активности синтеза оксида азота в дыхательных путях является хемилюминесцентный метод, основан-

" " -.* ²⁵ ''.'

ный на взаимодействии N0 с озоном, генерируемым анализатором, образуется молекула диоксида азота (NO2) с высокоэнергетическим электроном, впоследствии испускающая фотон, регистрируемый датчиком [6,143]. Этот метод в настоящее время является наиболее используемым в клинических и экспериментальных исследованиях. Концентрации оксида азота, определяемые в выдыхаемом воздухе, составляют около 1 части на биллион (400 пМ), что существенно ниже реально синтезируемых количеств NO [6,40]. Кроме того этот метод достаточно дорог, требует специального оборудования, поэтому мало доступен в клинической практике [17]. В связи с этим, были предложены другие способы оценки активности синтеза оксида азота, в частности, определение концентрации нитритов в индуцированной мокроте и дыхательном конденсате, слюне [2,13,33]. Методы, оценивающие конечные метаболиты N0, по мнению ряда авторов, являются более адекватными при оценке активности синтеза оксида азота, поскольку N0 обладает низким периодом полужизни в кислородсодержащих водных растворах и очень быстро метаболизируется до нитритов и нитратов [18,29,30]. При отсутствии в растворах высоких концентраций ионов металлов с переменной валентностью, гемоглобина нитриты являются терминальной стадией восстановления N0 [18]. Было продемонстрировано, что в ряде случаев оценка нитритов в дыхательном конденсате может быть более адекватным показателем активности синтеза оксида азота, чем прямое определение N0 в выдыхаемом воздухе [2,91]. По мнению ряда авторов эти тесты могут быть более чувствительными и воспроизводимыми, чем хемилюминесцентный анализ [88,91]. В конденсате паров выдыхаемого воздуха как правило определяют суммарное содержание метаболитов NO (нитритов/нитратов). Сумму конечных продуктов N0 в биологических жидкостях определяют с помощью реактива Грисса (1% сульфаниламид, 0,1% нафтилендиамин, 2,2% фосфорная кислота), а абсорбцию раствора измеряют при длине волны 540 нм [13,16,18,33]. У здоровых людей имеются возрастные особенности уровня метаболитов NO в КПВВ. Так, у детей концентрация нитритов/нитратов выше и составляет около

'. 26-2,8 мкмоль/л,-у взрослых примерно 1,5: мкмоль/л. Staintom[204]fH: Green [53]

разработали методики определения метаболитов N0:в разных биологических жидкостях (кровь, смывы, конденсат) у здоровых людей. НІВ; Кулакова.и др. спектрофотометрически с: помощью реактива: ІГрисса изучали; метаболиты. НОв^бронхоальвеолярной жидкости [3];

Кроме определения выдыхаемого N0 оценивают концентрацию N0* В полости носа (назальный N0) при^ прямом: заборе: образца. Основным источником N0в полости носа является эпителий:придаточных пазух,.который экспрессирует NO-синтазу, близкую по- своим; характеристикам: к. индуци-бельной; но нечувствительную і к кортикостероидам [99; 144] I Предполагается, что активный синтез; N0 в придаточных пазухах является одним из мехат низмов, обеспечивающих местную антибактериальную и противовирусную защиту. В'- последних работах, посвященных изучению назального NO, вы-двигается гипотеза обаутокринной роли оксида азота, синтезируемого віпри-даточных пазухах [103]; Вероятно; аутоингаляцияїМЕ) изїполости носа обёс- . ;, печивает ряд специфических, связанных с оксидом; азота, зффектовщі слизиг стощбронховь [36;43Ц03]; В: многочисленных экспериментах показано;, что* назальный NO -повышаетсяшри: атонической астме также как и 'выдыхаемый* N0;

Были предложены различные варианты оценки активности: синтеза* N0;^J В^;' качестве, мониторинга синтеза; N0« предложено* определение: нитритов* и нитратов в дыхательном конденсате [2,13,91,204]. Таких исследований? проведено немного^ в основном они? посвящены определению: нелетучих макро-молекулярных нелетучих соединений, присутствующих в; бронхиальном: секрете дистальных отделов респираторного* тракта - протеины, липиды, окси-дантьБ т нуклеотиды. В: конденсате паров*выдыхаемогоs воздуха; определяют ЩОг, 8-изопростан; нитротирозин; серотонищ лейкотриеньг [91]. Определению N0^? в КИВВ; индуцированной- мокроте шжидкости; БАЛ у больных ВМ посвящено мало работ. Хотя такие исследования; позволяют оценить источники NO^;b дыхательных путях, степень.вовлечения<в процесс всехэлементов.

27 легких, особенно дистальных, мало доступных для изучения. Проведенные

исследования, в большинстве своем свидетельствуют о повышенном содержании метаболитов NO в КПВВ у больных БА, которое зависит от тяжести течения, периода болезни и используемой противовоспалительной терапии [3,10,13]. Учитывая неиинвазивность и простоту получения КПВВ, определение медиаторов воспаления, в том числе, NO в нем требует дальнейшего изучения.

Индуцированная мокрота в большинстве исследований рассматривается, как материал для цитологического исследования и изучения гуморальных факторов, присутствующих в мокроте. Это касается, в основном, высокоосновных протеинов, высвобождающихся из гранул эозинофилов [84,85^90]. Исследования посвященные биохимическому тестированию ИМ единичны. Е.Н. Коновалова с соавторами [4] изучали содержание метаболитов NO и а-кислого гликопротеина в супернатанте ИМ. Их исследование показало, что содержание метаболитов NO в ИМ у больных БА повышается в период обострения и снижается в период ремиссии. В этом же исследовании обнаружено повышенное содержание метаболитов N0 в ИМ у больных ХОБЛ, достоверно меньшее, чем при астме.

Бронхоальвеолярные смывы привычно используются в большинстве исследований для цитологического и бактериологического исследования, как материал для определения уровня N0 в дистальных отделах бронхиального дерева используется мало. Есть данные о содержании N0 в бронхоальвео-лярных смывах у здоровых [3]. Было установлено, что уровень, нитритов/нитратов в бронхоальвеолярных смывах у здоровых в среднем составляет 0,8 нмоль/мл. Есть данные о том, N0 в БС у больных БА прямо коррел-лрует с эозинофилами БС [144]. Работы по поводу определения N0 в БС при БА единичны, что же касается ХОБЛ, то в доступной литературе таких таких исследований нет. Все это говорит о необходимости дальнейших исследований в этой области.

Изменения цитологического состава индуцированной мокроты при БА и ХОБЛ на фоне лечения.

В немногочисленных исследованиях, где ИМ использовалась, как критерий оценки эффективности противовоспалительной терапии, получены противоречивые данные. В одних описывается достоверное снижение выраженности эозинофилии в ИМ на фоне лечения ИКС, в других не обнаружено разницы в цитограммах ИМ [1,23,37,47,60,67-71,89,171,175,195,205,211]. Работы некоторых зарубежных авторов показали, что эозинофилы ИМ более чувствительны по сравнению с уровнями эозинофилов крови, ЕСР сыворотки и даже выдыхаемого оксида азота (NO) [115,125,178]. Клиническое улучшение наступает раньше, чем появляются изменения в клеточном составе ИМ и наоборот, выраженность эозинофилии ИМ возрастает и опережает клиническое ухудшение состояния больных астмой [63,65,93,95]. Это может свидетельствовать о том, что исследование цитологического состава ИМ более достоверный критерий эффективности лечения и выраженности воспалительного процесса в бронхах [136-138,140,142,148,150,155,161,181,182]. Кроме того, в ряде работ изучается значимость уровня эозинофилии ИМ, как прогностического критерия ответа на терапию ИКС и пероральными гормонами [72,73,95,96]. В них показано, что больные с изначально высоким уровнем эозинофилов ИМ (выше 3 %), лучше отвечают на такую терапию, чем пациенты с низким содержанием эозинофилов или отсутствием их. Не все обнаруживают такую зависимость [102,110,174]. Такую разноречивость полученных данных, вероятно, можно связать с малочисленностью групп наблюдения (от 7 до 18 человек), небольшими сроками наблюдения. Все авторы подчеркивают необходимость дальнейшей работы в этом направлении. ,.

Сопоставимость методов индуцированной мокроты, бронхиальной брашбиопсии, бронхиальной биопсии и бронхоальвеолярного лаважа.

Безопасность и неинвазивность метода ИМ позволяет рассматривать его как альтернативу бронхоскопическим методам для мониторинга воспаления;в бронхах. В этой связи в последнее время появились работы, посвященные-информативности и сопоставимости метода ИМ, ББ, БББ и БС. Эти работы единичны и результаты их неоднозначны [74,75]. По данным большинства авторов ИМ; больных БА по сравнению БС содержит большее число эозинофилов и нейтрофилов, и меньшее — лимфоцитов и макрофагов [1,38,41,68,84,85].

В исследовании; Fahy и: др. показано,; что ИМ отличается от БС и; жидкости БАЛ более высоким содержанием неэпителиальных клеток и ЭКП [102]. Количество эозинофилов и ЕСР в ИМ более тесно коррелировало с их уровнем в БС, чем в жидкости БАЛ; Это исследование выявило, что в-ИМ; более высокое содержание бронхиального секрета, и высокая; концентрация клеток воспаления [102]. Другое исследование также подтвердило близкий качественный состав клеточных элементов ИМ- БС, жидкостшБ А Л: и ББ [85]. Эта работа подтвердила близкий качественный состав клеточных элементов в ИМР и материалах, полученных: при помощи бронхоскопии [134,135]. Обнаружены корреляционные связи между эозинофилами ИМ; БС и жидкости БАЛ, а также - лимфоцитами ИМ и жидкости.БАЛ: [86].

Mbodley с соавторами [170] заинтересовал вопрос: не является ли повышенное, по сравнению с жидкостью БАЛ, количество нейтрофилов в ИМ следствием ингаляции гипертонического раствора поваренной соли? Сделаны выводы, что более высокое содержение нейтрофилов.в ИМ зависит, главным образом, от того «вклада», который вносится в этот относительно большой нейтрофилез ИМ, нейтрафилами трахеи и проксимальных бронхов. Местное же воздействие гипертонического раствора, если и повышает уровень нейтрофилов в слюне, то незначительно, и не может влиять на уровень нейтрофилов в ИМ [170]. Другие исследования взаимосвязей между ИМ и БАЛ либо не обнаруживают, либо выявляют лишь тенденции к положительным корреляциям [157].

Если же говорить о ХОБЛІ то до настоящего; времени практически, не исследованы; параллели между маркерами воспаления в ИМ- БАЛ и ББ. при этом заболевании. В немногочисленных исследованиях отмечается, что в ИМ выше процент нейтрофилов и ниже - макрофагов и лимфоцитов по сравнению .с жидкостью БАЛ [46,64 66,76,82,83,86]. Процент сквамированных эпителиальных клеток в жидкости БАЛ выше, а цитоз,. напротив, выше по; сравнению с ИМ, [76,114,133,162,197,198;218]: Ни в;одном исследовании, не обнаружено корреляционных связей?между клеточным составом: БС, жидкости БАЛ и ИМ-при ХОБЛ: Кроме TorOj в этих исследованиях былшмалочисленные группы (7 — 10 человек). Малое число таких-сравнительных исследований вызывает необходимость, дальнейшей работы; в этом направлении: Это? важно: для поиска1 неинвазивного метода мониторинга- воспаления в бронхиальном: дереве и ответа:на вопрос: может ли служить метод ИМ альтернативой БА.ЩББ и БББшр№ бронхиальной астме и ХОБЛ: .-.-

Клинико-функциональная оценка больных

Для оценки функционального состояния дыхательных путей использовали показатели спирографии и пикфлоуметрии, проводимых в динамике.

Для ежедневного мониторинга бронхиальной проходимости применялись индивидуальные пикфлоуметры (Mini-Wright фирмы "Clement Clarke", Великобритания; Clean фирмы "Jaeger", Германия) с регистрацией пиковой скорости выдоха (ПСВ) в утренние и вечерние часы. Подсчитывались следующие показатели - процентное значение ПСВ от должного значения (ПСВ, %), суточная и недельная вариабельность ПСВ. Для определения значения вариабельности ПСВ брались недельные измерения ПСВ определялись их наименьшее и наибольшее значения и вариабельность вычислялась по формуле:

Исследование функции внешнего дыхания проводилось путем анализа кривой «поток-объем» и показателей спирометрии с использованием программного обеспечения SpiroVision IIі Spirometry System, USA. Терапия сим-патомиметиками прекращалась за 8 часов, антихолинергическимщ антигис-таминными препаратами и теофиллинами короткого и пролонгированного действия; за; 24 часа до? начала исследования. Всем больным проводилась проба с бронхолитиком. Для этого использовались сальбутамол, беротек,. ат-ровент. Осуществлялась компьютерная обработка полученных данных, вычислялись должные величины. Визуальное изображение в реальном- времени позволяло контролировать выполнение пациентами дыхательных маневров и вносить коррективы. Все измерения объёмов регистрировались, в системе BTPS: Пациенты были подробно проинструктированы о порядке проведения процедуры и обучены выполнению дыхательных маневров. Анализировались следующие- показатели:, жизненная емкость легких (ЖЕЛ), форсированная-жизненная емкость легких (ФЖЕ Л), объем форсированного выдоха за; 1 секунду (ОФВ Г), отношение. ОФВ1/ФЖЕЛ, форсированный среднеэкспиратор-ный поток (МОС25-75)3 форсированные экспираторные потоки- на различных уровнях ЖЕЛ (M0G25, МОЄ50, MOG75)- Для интерпретации полученных показателей; использовались рекомендации. Европейского1 сообщества.стали;и угля [34].

Индуцированную мокроту получали после ингаляций стерильного раствора натрия хлорида через- компрессорный небулайзер. Исследования повторяли в динамике. До начала процедуры,и по ходу ее замерялась величина ПСВ. Премедикация включала ингаляцию (3-адреномиметика; (сальбутамола или беротека) за 20 мин. до начала процедуры. Для вдыхания использовался раствор Nad нескольких концентраций. Первая» ингаляция проводилась-3% раствором и длилась 7 минут, после чего больного просили прополоскать рот и откашлять мокроту в специальную емкость. При получении необходимого для исследования объема мокроты (не менее 2 мл, со слизисто-гнойными. включениями) процедура завершалась. При отсутствии мокроты или недостаточном ее количестве, больной выполнял ингаляции с 4% и 5% раствором NaCl с перерывом в 5 мин. Общее время, затрачиваемое на получение материала, составляло от 10 до 40 минут. Мокрота подвергалась лабораторной обработке не позднее чем через 2 часа после ее получения. Общие количество клеток подсчитывалось в камере Горяева. Обработка включала инкубацию смеси мокроты и 1% раствора трипсина в термостате и ее механическую гомогенизацию на магнитной мешалке, центрифугирование и отмывание мокроты с помощью раствора Хенкса. Из полученного осадка готовились мазки в количестве 3-4 от одного больного. Препараты фиксировались раствором метанола и окрашивались по Романовскому-Гимза. Просмотр препаратов осуществлялся под иммерсией с использованием светооптического микроскопа «Биолам Ломо». Проводился дифференцированный подсчет 400 клеток, среди которых учитывались эозинофилы, нейтрофилы, альвеолярные макрофаги, лимфоциты и плазматические клетки. Примесь плоского эпителия, имеющего происхождение из ротовой полости, у больных БА и ХОБЛ не превышала 20% от общего числа клеток. Определялось процентное содержание каждого типа клеток с последующим пересчетом на абсолютное значение [1,93,114,130].

Цитологический состав индуцированной мокроты у больных БА, взаимосвязи между разными показателями клеточного состава

Анализ взаимосвязей между клетками в цитограммах ИМ у больных ХОБЛ выявил ряд достоверных корреляций. Эти данные представлены в таблице 10. Оказалось, что цитоз прямо коррелирует с содержанием нейтрофилов и лимфоцитов, с макрофагами обнаружена отрицательная корреляционная связь. Между содержанием макрофагов, нейтрофилов и лимфоцитов также связь отрицательная. Более низкое содержание нейтрофилов и лимфоцитов и связанное с этим более высокое количество макрофагов в ИМ (и наоборот), отражает выраженность воспалительного процесса в бронхах при ХОБЛ. Обратная корреляционная связь связывает нейтрофилы и эозинофи-лы. Количество эозинофилов при ХОБЛ очень невелико по сравнению с Б А, но небольшое их количество присутствует в цитограммах ИМ больных ХОБЛ.

Цитограммы ИМ и БС у больных БА представлены преимущественно иммунокомпетентными клетками - макрофагами, эозинофилами и лимфоцитами и нейтрофилами. Эти данные представлены в таблице 11. Обращает на себя внимание большое содержание в БС клеток бронхиального эпителия нормального строения и с признаками дистрофии, бокаловидных клеток, в то время как в ИМ бронхиальный эпителий встречается в единичных пробах в очень небольшом количестве (около 1%). Стимуляция альвеолярных макрофагов приводит к выработке таких медиаторов воспаления как тромбоксан, фактор активации тромбоцитов, эти вещества определяют позднюю фазу аллергической реакции, а в настоящее время особую роль в этом отводят эози-нофилам, доля которых оказалась большей в мокроте (16,2 ± 3,7 и 5,5 ± 1,8 % соответственно). Цитоз оказался достоверно выше в БС (1,9 ± 0,2 и 1,5 ± 0,2 х106/мл соответственно). Выявлено практически одинаковое количество макрофагов и лимфоцитов в БС и ИМ (29,7 ± 2,1; 30,4 ±1,3 и 8,6 ± 1; 7,6 ± 2,5 % соответственно), а доля нейтрофилов оказалась большей в мокроте.

Цитограммы ИМ больных ХОБЛ (таблица 12) представлены преимущественно клетками воспаления - нейтрофилами, лимфоцитами, эозино-филами (70,2±4,3; 8,9±1Д; 3,4±1,0 % соответственно). В БС наряду с клетками воспаления выявлено, также как при астме, значительное количество бронхиальных эпителиоцитов нормального строения и с признаками атрофии, дистрофии, метаплазии, бокаловидных клеток. В ИМ бронхиальный эпителий определялся лишь у 3 больных, в количестве менее 2 %. Достоверного различия цитоза в ИМ и БС не выявлено. Цитограммы ИМ и БС характеризуются нейтрофильным лейкоцитозом, при этом ИМ отличалась достоверно большим количеством нейтрофилов, чем БС (70,2 ± 4,3 и 58,4 ± 1,7 соответственно). Повышение доли нейтрофилов в исследуемых средах свидетельствует о наличии в бронхах воспалительного процесса, выраженность которого зависит от функциональной активности этих лейкоцитов и степени защитных свойств слизистой оболочки бронхов. Количество лимфоцитов в БС и ИМ больных ХОБЛ достоверно не отличалось (9,1 ± 0,8 и 8,9 ± 1,1 % соответственно), а доля эозинофилов оказалась большей в мокроте (2,7 ±1,0 и 0,85 ± 0,1% соответственно). Содержание макрофагов в ИМ достоверно меньше, чем в БС (16,8 ± 1,4 и 29,3 ± 1,1%), но и в мокроте и в БС у больных ХОБЛ встречались в основном активно фагоцитирующие клетки.

Различия цитологического состава ИМ и БС у больных БА и ХОБЛ вероятно связано с тем, что мокрота представляет собой интегральный материал из всех отделов бронхиального дерева, БС собираются из дистальных отделов бронхов.

Корреляционный анализ показал наличие прямых корреляционных связей между нейтрофилами (г=0,82; р 0,001), макрофагами и лимфоцитами (г=0,59; р 0,01 и г=0,64, р 0,001 соответственно) ИМ и БС у больных БА. При ХОБЛ выявлено наличие прямых корреляционных связей между нейтрофилами (г=0,68; р 0,001) и лимфоцитами (r=0,58; pOjOl) ИМ и БС.

Т.е., несмотря на ряд отличий, можно сказать, что клеточный состав ИМ близок к таковому в БС по содержанию эффекторных клеток и отражает воспалительный процесс в бронхах. Но метод ИМ в связи с неинвазивностью предпочтителен, т.к. может быть использован, как уже отмечалось выше, даже у больных с тяжелыми нарушениями функции внешнего дыхания. Исследование может повторяться в динамике неоднократно, соответственно его можно использовать для мониторинга воспаления в бронхиальном дереве и для контроля результатов лечения.

Изменения цитограмм индуцированной мокроты и: клинико-функционального состояния на фоне лечения у больных БА

Показатели содержания метаболитов NO в КПВВ у больных БА на фоне лечения; представлены на рис.14. Через 1,5 месяца лечения ИКС уровень нитритов в КПВВ снижается по сравнению с обострением заболевания, но остается выше, чем в группе контроля (3,9 ± 0,8 и 0,8±0,1 мкмоль/л соответственно, р 0,001).

Данные о содержании NO в КПВВ на фоне медикаментозной терапии, при разных степенях тяжести Б А представлены в таблице 21.

Если оценивать изменения этого показателя в разных группах, в зависимости от степени тяжести, то оказывается, что при тяжелом, среднетяже-лом и легком течении Б А уровень N0 достоверно снижается, не достигая контроля.

Через 3 месяца регулярного лечения ИКС в общей группе больных БА уровень метаболитов NO снизился до 2,6 ± 0,6 мкмоль/л, что достоверно ниже показателя через 1,5 месяца, но все еще достоверно выше, чем в группе контроля. В группе с легкой БА показатели приблизились к контрольным (1,3±0,3; 0,8 ± 0,1 мкмоль/л соответственно).

Не выявлено достоверных различий в динамике концентрации метаболита N0 в КПВВ пациентов, принимающих различные; ИКС, а именно флутиказона.пропионат, беклометазонадипропионат и будесонид.. Эти данные представлены в таблице 22. Дозы ИКС соответствовали рекомендациям ступенчатой терапии БА, от 600 до 1500мкмоль, длябекламетазона дипро-пионата и будесонида, от 250 до?750 мкмоль для флутиказона пропионата;

Достоверная корреляционная связь между содержанием NO в КПВВ и уровнем ОФВі при БА сохраняется через; 1,5 и 3 месяца на"фоне медикамен тозной терапии(г= -0,55;-р 0;01 ;.г= -0;37; р 0 01). \ . . Выраженное: ингибирующее влияние ИКС на секрецию NO в дыхат тельных путях больных БА может быть обусловлено их способностью тормозить все.фазы аллергического ответа, активировать апоптоз эффекторных клетокь подавлять синтез ИЛ-1, ИЛ-5 и ФНОа..

Больные ХОБЛ не получали стандартной противовоспалительной» терапии, но все они получали антибиотики, бронходилататорьі: в виде беродуа-ла черезнебулайзер, атровента, коротких. 3-адреномиметиков (сальбутамол, . фенотерол), мукорегуляторы (бромгексин; амброксол); После купирования обострения больные ХОБЛ продолжали прием бронходилататоров (атровент, сальметерол, сальтос).

Показатели изменения уровня NO на фоне медикаментозной терапии у больных ХОБЛ представлены нарис. 15. Через 1,5 месяца уровень метабо-лита-NO в КПВВ-больных ХОБЛ достоверно снизился по сравнению с обострением (5,2 ± 2,3; 1,3 ± 0,5 мкмоль/л, соответственно; р 0;,01) и почти достиг показателей в контрольной группе. Через 3 месяца содержание нитритов хотя достоверно не изменилось, но все же еще больше приблизилось к контрольному (1,1 ± 0;3;и 0:,8 ± 0,1 мкмоль/л соответственно).

При оценке динамики метаболитов NO в КПВВ на фоне медикаментозной терапии в зависимости от стадии болезни, оказалось, что через 1,5 ме сяца при всех стадиях содержание нитритов достоверно снизилось (р 0,001).

При I и II стадиях полученные показатели достоверно не отличались от группы контроля. В группе с тяжелой степенью (III стадия) ХОБЛ показатели остались достоверно более высокие, чем в контроле.

Через 3 месяца лечения у больных ХОБЛ при всех стадиях не произошло достоверного изменения уровня NO в КПВВ. Низкий уровень NO у больных ХОБЛ в период ремиссии вероятно обусловлен несколькими причинами, включая хроническое курение и окислительный стресс.

Корреляционные связи между клеточным составом индуцированной мокроты, бронхоальвеолярных смывов и уровнем NO в конденсате паров выдыхаемого воздуха, индуцированной мокроте и лаважной жидкости

Взаимосвязи между клеточным составом индуцированной мокроты и бронхоальвеолярных смывов и уровнем метаболитов N0 в конденсате паров выдыхаемого воздуха, индуцированной мокроте, бронхоальвеолярных смывах при бронхиальной астме.

Проведенный корреляционный анализ выявил определенные взаимосвязи между цитологическим составом ИМ и уровнем нитритов в КПВВ у больных БА. Эти данные представлены в таблице 24.

Оказалось, что содержание NO в КПВВ прямо коррелирует с клеточно-стью (цитозом) ИМ, эта взаимосвязь прослеживается как в стадию обострения, так и в последующем, через 1,5 и 3 месяца.

Взаимосвязи обнаружены между макрофагами мокроты и NO КПВВ, между ними выявлена положительная связь, чем. выше содержание макрофагов, тем выше показатели N0. При чем, это касается и процентного соотношения и абсолютного числа макрофагов. Надо отметить, что на фоне лечения в ИМ увеличивается процент макрофагов, а в КПВВ уменьшается уровень N0, т.е. эти процессы параллельны и отражают снижение активности воспаления в бронхиальном дереве (табл. 24).

Особый интерес, конечно, вызывал вопрос о наличии взаимосвязей уровня N0 в КПВВ и эозинофилами мокроты, в общей группе БА таковых не было обнаружено. Но анализ корреляций в зависимости от формы БА выявил прямую корреляционную связь между процентным соотношением эозинофи-лов в ИМ и уровнем N0 в КПВВ у больных с экзогенной формой БА, что косвенно может говорить о связи уровня NO с атопией. Кроме того, выявлена прямая корреляционная связь содержания N0 в КПВВ и долей лимфоцитов в ИМ. Прослеживаются, в той или иной степени выраженные связи с большинством эффекторных клеток ИМ и уровнем NO в КПВВ.

Похожие корреляционные связи прослеживаются между NO в КПВВ и; цитологическим составом БС. Вчастности, обнаружена прямая связь между содержанием N0 в КПВВ, цитозом и абсолютным; числом эозинофилов БС. Кроме,- того, прямые корреляции обнаружены с эпителиальными; клетками БС, с процентом и- абсолютным числом ПЭК и содержанием N0 в КПВВ (таблица 25).

Данные, полученные при корреляционном анализе содержания нитритов в;ИМ и клеточным составом ИМ, представлены в таблице 26.

Уровень нитритов в ИМ при БА так же, как и в KIIBBj прямо связан с цитозом и абсолютным содержанием лимфоцитов в мокроте.

Прослеживается слабая корреляционная связь уровня N0 и содержанием эозинофилов в ИМ (r=0;27j р=0,052). В группе ЭкБА (атопической) эта связь более значима (г=0,48; р 0,05).

Разнообразные связи выявлены между уровнем N0 в БС и его цитологическим составом. Прямая корреляционная-связь обнаружена между цитозом БС и уровнем NO. Не обнаружено достоверной связи;NO в БС и эозино-филами. Но довольно выраженная положительная связь выявлена между нитритами и нейтрофилами БС. Из большого количества эпителиоцитов БС, прямая связь обнаружена только с ПЭК (таблица 27).

Похожие диссертации на Неинвазивные методы оценки воспаления в бронхах при бронхиальной астме и хронической обструктивной болезни легких [Электронный ресурс]

Оценка диагностической значимости метода компьютерной дермографии и эффективности применения тинростима-СТ у больных хронической обструктивной болезнью легкихПетраковская Вера Александровна

Апоптоз клеток воспаления и морфологические изменения бронхов при бронхиальной астмеКашинцева Татьяна Валерьевна

Вербальные характеристики одышки у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких, бронхиальной астмой и гипервентиляционным синдромомТрушенко Наталья Владимировна

Новые биомаркеры - среднелетучие метаболиты в конденсате выдыхаемого воздуха при бронхиальной астме и хронической обструктивной болезни легкихАнохина, Татьяна Николаевна

Клинические особенности и состояние бронхиального дерева больных бронхиальной астмой и хронической обструктивной болезнью легких в сочетании с гипероксалурией [Электронный ресурс]Шайлиева Люаза Османовна

Клинико-диагностическое значение туссографии и спектральной туссофонобарографии у больных бронхиальной астмой и гастроэзофагеальной рефлюксной болезнью [Электронный ресурс]Овсянников Евгений Сергеевич

Амбулаторное лечение больных с сочетанием хронической обструктивной болезни легких и бронхиальной астмыПешкова Ольга Александровна

Адаптационные реакции организма и их коррекция у больных бронхиальной астмой и хронической обструктивной болезнью легкихГлушко Мария Александровна

Маркеры активации и гибель клеток индуцированной мокроты при бронхиальной астме и хронической обструктивной болезни легкихПазыч Светлана Анатольевна

Диагностика и лечение легочно-артериальной гипертензии у больных бронхиальной астмой и хронической обструктивной болезнью легкихБеднаржевская Татьяна Витальевна