Введение к работе
Актуальность проблемы Гистиоцитарные пролиферативные расстройства, или гистиоцитозы, - группа редких заболеваний, морфологической основой которых является патологическая пролиферация клеток гистиоцитарного ряда: тканевых макрофагов, моноцитов, дендритных клеток и их предшественников. Согласно современной классификации гистиоцитарных заболеваний, выделяют гистиоцитозы с вариабельным клиническим течением, основными представителями которых являются гистиоцитоз из клеток Лангерганса (ГКЛ) и гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз (ГЛГ), и злокачественные гистиоцитозы, к которым относят моноцитарные варианты острого миелобластного лейкоза, солидные опухоли из моноцитов и дендритных клеток и хронический миеломоноцитарный лейкоз (ХММЛ) (современный термин - ювенильный миеломоноцитарный лейкоз (ЮММЛ)) (B.Favara, 1998). Несмотря на различия в биологии этих заболеваний, рассмотрение гистиоцитозов как единой клинико-патологической группы обусловлено сходной клинической презентацией у детей раннего возраста, необходимостью дифференциальной диагностики и аналогией методов терапии. Настоящее исследование сосредоточено на принципиальных вопросах биологии, диагностики и терапии трех наиболее распространенных форм гистиоцитарных расстройств у детей: первичного гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза (ПГЛГ), ЮММЛ и ГКЛ.
ПГЛГ – врожденное расстройство иммунорегуляции, обусловленное генетическим дефектом механизмов клеточной цитотоксичности (G.Janka 2007, J-I.Henter 2002). Идентифицировано четыре гена, PRF1, UNC13D, STX и STXBP, герминальные мутации которых ведут к формированию клинического фенотипа ПГЛГ. Сходный клинический фенотип формируется у пациентов с Х-сцепленным лимфопролиферативным синдромом (Х-ЛПС) I и II типа и синдромом Грисселли, в основе которых лежат мутации в генах SH2D1A, XIAP и RAB27 соответственно (J.Pachlopnik Shmid, 2010). В отсутствие терапии ПГЛГ является смертельным заболеванием. Современная терапия ПГЛГ, основанная на последовательном применении иммуносупрессивной терапии (ИСТ) и аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК), позволяет излечивать около 50% пациентов (J-I.Henter, 2007). Своевременная верификация генетической природы ПГЛГ позволяет подтвердить показания к ТГСК, выполнить генетическое консультирование и пренатальную диагностику. Исследование генетической эпидемиологии ПГЛГ в популяции российских пациентов, анализ эффективности терапии ПГЛГ и разработка алгоритма клинической и лабораторной диагностики необходимы для улучшения диагностики и результатов лечения этого заболевания
ЮММЛ – заболевание, сочетающее черты миелодисплазии и миелопролиферации (M.Arico, 1997). В основе заболевания лежат соматические (реже - герминальные) мутации в генах PTPN11, NRAS, KRAS, CBL, NF1 (M.Loh, 2010). Результатом является гиперпролиферация миелоидных и моноцитарных предшественников, дисфункция костномозгового кроветворения и патологическая инфильтрация органов. Единственным методом, позволяющим излечивать пациентов с ЮММЛ, считается ТГСК. Выполнение ТГСК при ЮММЛ ассоциировано с 10-20% риском трансплантационной смертности и 30-40% риском рецидива заболевания (F.Locatelli, 2005). Нерешенным остается вопрос о месте нетрансплантационных методов терапии, таких как дифференцировочная терапия (ДТ) 13-цис-ретиноевой кислотой (13-RA) и высокодозная химиотерапия (ВХТ) (M.Loh, 2010). Разработка алгоритма молекулярно-генетического анализа и клинико-генетическое сопоставление необходимы для диагностики, определения показаний к ТГСК, мониторинга минимальной остаточной болезни и тестирования новых методик терапии. Анализ результатов ТГСК и альтернативной терапии необходим для оптимизации технологии ТГСК и определения перспективной тактики мультимодальной терапии.
ГКЛ – заболевание, в основе которого лежит клональная пролиферация миелоидных дендритных клеток, фенотипически сходных с эпидермальными клетками Лангерганса. Манифестация ГКЛ варьирует от локализованных очагов остеолизиса до диссеминированных форм с неконтролируемым злокачественным течением. Биологическая основа этих различий и природа ГКЛ в целом остаются нерасшифрованными (M.Egeler, 2010). Данные о роли мутации V600E в гене BRAF в патогенезе ГКЛ стали новым фактом, свидетельствующим в пользу неопластической природы заболевания (G.Badalyan-Very, 2010). Подтверждение этого факта может открыть новый этап понимания биологии заболевания и новые перспективы терапии. Современным стандартом лечения ГКЛ у детей является комбинированная терапия винбластином (Vbl) и преднизолоном (Prn) (M.Minkov, 2011). Одной из наиболее актуальных проблем является терапия пациентов группы «высокого риска» - пациентов с мультисистемным ГКЛ с вовлечением «органов риска» (МСОР+). Общая выживаемость в этой группе не превышает 70%, а в подгруппе пациентов, рефрактерных к стандартной терапии – 20% (M.Minkov, 2002, H.Gadner, 2001). В лечении резистентных форм ГКЛ наиболее перспективным представляется опыт интенсивной химиотерапии (ХТ) с использованием 2-хлор-дезоксиаденозина (2-CdA) в комбинации с цитозина арабинозидом (AraC) (F.Bernard, 2005). Таким образом, исследование молекулярного дефекта V600E BRAF при ГКЛ, анализ результатов терапии мультисистемного ГКЛ и разработка альтернативных программ терапии являются актуальным прикладным вопросом детской гематологии/онкологии и педиатрии.
Цель исследования
Разработка и внедрение современных принципов клинико-лабораторной и молекулярно-генетической диагностики и оптимизирующих программ терапии пациентов с первичным гемофагоцитарным лимфогистиоцитозом, ювенильным миеломоноцитарным лейкозом и гистиоцитозом из клеток Лангерганса.
Задачи исследования
-
Выполнить молекулярно-генетический анализ генов PRF1, UNC13D, STX, STXBP, SH2D1A, XIAP, RAB27 в группе российских пациентов с клиническим диагнозом ПГЛГ. Изучить клиническую презентацию и корреляцию генотип-фенотип при генетически детерминированном ГЛГ.
-
Разработать алгоритм клинико-лабораторной диагностики, молекулярно-генетической верификации и дифференциальной диагностики первичного гемофагоцитарного синдрома и его генетических субвариантов.
-
Провести анализ результатов лечения пациентов с ПГЛГ с использованием стандартных режимов программной иммуносупрессивной химиотерапии и алло-ТГСК. Разработать практические рекомендации по выбору тактики терапии.
-
Выполнить молекулярно-биологический анализ генов PTPN11, NRAS, KRAS и CBL в репрезентативной группе пациентов с ЮММЛ. Сопоставить клинические и лабораторные проявления с генетическими дефектами и разработать рациональную тактику генетической верификации диагноза и алгоритм клинико-лабораторной диагностики и дифференциальной диагностики ЮММЛ.
-
Провести анализ результатов алло-ТГСК, ВХТ и ДТ с использованием 13-RA и в группе пациентов с ЮММЛ. Разработать клиническую стратификацию на основании анализа клинических и лабораторных факторов риска. Разработать стратегию выбора терапии ЮММЛ в соответствии с клинико-биологичекой стратификацией.
-
Исследовать мутацию V600E в гене BRAF в патогистологических образцах пациентов с гистиоцитозом из клеток Лангерганса. Оценить потенциальное место исследования мутационного статуса BRAF в диагностике, выборе и мониторинге терапии ГКЛ.
-
Изучить непосредственные и отдаленные результаты стандартной терапии пациентов с ГКЛ. Разработать альтернативный подход к лечению пациентов с мультисистемным заболеванием на основе использования комбинированной ХТ 2-CdA и AraC. Провести сравнительный анализ результатов стандартной и альтернативной терапии. Разработать практические рекомендации по выбору терапии и тактике сопроводительной терапии ГКЛ в группе высокого риска.
Научная новизна
Впервые в репрезентативной выборке российских пациентов с ПГЛГ выполнено молекулярно-генетическое исследование всех известных генов (PRF1, UNC13D, STX, STXBP, SH2D1A, XIAP, RAB27), ассоциированных с фенотипом ПГЛГ. Выявлено уникальное распределение генетических вариантов ПГЛГ с преобладанием FHL3, отличное от популяций с другим этническим составом. Показано, что распространение в популяции мутаций c.2346_2349del и c.3037insG обусловлено «эффектом основателя». Не выявлена значимая корреляция клинического фенотипа с генетическим вариантом ПГЛГ. В работе проведен первый в России анализ результатов терапии пациентов с ПГЛГ и убедительно продемонстрирована необходимость выполнения ТГСК всем пациентам с ПГЛГ. Показано, что основным препятствием к успеху ТГСК является высокая трансплантационная смертность (54 ± 15%). Впервые в репрезентативной выборке российских пациентов с ЮММЛ выполнено молекулярно-генетическое исследование основных генов (PTPN11, NRAS, KRAS и CBL), ассоциированных с развитием ЮММЛ. В работе подтверждено характерное распределение генетических вариантов ЮММЛ и впервые выявлена корреляция клинического фенотипа с генотипом заболевания. Разработана программа лечения 13-RA и низкими дозами AraC при ЮММЛ. Продемонстрирован клинико-гематологический эффект ДТ и установлена корреляция исходных клинико-лабораторных показателей и генетического варианта ЮММЛ с ответом на ДТ. Подробно описан феномен стойкого ответа на ДТ, выявлена персистенция мутантного клона у пациентов в статусе полного ответа (ПО) и описано развитие поздних злокачественных (острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) и аутоиммунных (тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (ТТП)) заболеваний у пациентов с ПО на ДТ. Впервые в репрезентативной группе российских пациентов проведен анализ результатов ТГСК, 5-летняя общая выживаемость составила 38±13%, трансплантационная смертность - 28±12%, частота развития рецидива 31%. Выполнен анализ мутации V600E BRAF у пациентов с ГКЛ и подтверждена вероятная роль данного соматического генетического дефекта в патогенезе ГКЛ у 24% пациентов. Разработана оригинальная программа терапии для группы пациентов «высокого риска» на основе использования комбинированной терапии 2-CdA и AraC. Показана высокая эффективность терапии рефрактерных форм МСОР+ ГКЛ, рОВ = 66±15%. Показана высокая эффективность 2-CdA и AraC в лечении МСОР+ ГКЛ, рОВ = 88±9%, частота развития инвалидизирующих перманентных последствий – 0%. Описан необычный спектр инфекционных осложнений, включающий инфекции вакцинальным штаммом микобактерий M.bovis и тяжелые инфекции, вызванные респираторными вирусами.
Практическое значение
В работе на основании анализа генетической структуры ПГЛГ в группе российских пациентов разработан алгоритм клинико-лабораторной диагностики ПГЛГ, алгоритм молекулярно-гентического анализа и методика выявления наиболее распространенных мутаций в гене UNC13D. На основании анализа результатов ИСТ и ТГСК предложена стратегия выбора терапии, предусматривающая начало поиска донора в момент установления диагноза ПГЛГ и обязательное выполнение ТГСК не позднее 4 месяцев от момента установления диагноза. Разработан алгоритм молекулярно-генетического исследования при диагностике пациентов с клиническим диагнозом ЮММЛ, позволяющий верифицировать диагноз, осуществить рациональный выбор терапии и мониторинг заболевания после ТГСК. Разработан алгоритм выбора терапии в соответствии с клинико-биологической стратификацией пациентов. На основании анализа результатов ХТ и ТГСК предложена стратегия выбора терапии, предусматривающая начало поиска донора в момент установления диагноза ЮММЛ и обязательное выполнение ТГСК не позднее 6 месяцев от момента установления диагноза в группе пациентов, не ответивших на ДТ. Молекулярно-генетический анализ мутации V600E BRAF у пациентов с ГКЛ показал, что данная генетическая аномалия потенциально является диагностическим маркером заболевания и терапевтической мишенью. Разработана и внедрена в клиническую практику эффективная программа ВХТ на основе комбинации 2-CdA и AraC для лечения пациентов с рефрактерным течением ГКЛ МСОР+. Разработаны рекомендации по сопроводительной терапии.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Гистиоцитарные пролиферативные расстройства – гистиоцитозы – группа фенотипически родственных заболеваний, в основе которых лежит спектр врожденных либо приобретенных молекулярных дефектов, ведущих к аномальной пролиферации и регуляции функциональной активности клеток гистиоцитарного ряда. Новые данные о биологии гистиоцитозов диктуют необходимость разработки комплексного алгоритма диагностики, дифференцированной тактики терапии и диспансерного наблюдения пациентов с гистиоцитозами.
-
Мутации в гене UNC13D являются наиболее распространенным генетическим дефектом в популяции российских пациентов с ПГЛГ. Частота выявления мутаций в гене UNC13D составила 54%. Распространенность этих мутаций в исследованной группе обусловлена «эффектом основателя» - персистенцией в популяции мутаций c.2346_2349del и c.3037insG. Исследование гена UNC13D рекомендуется в качестве первого этапа молекулярно-генетической диагностики ПГЛГ в России.
-
Единственным методом терапии, обеспечивающим долгосрочную выживаемость пациентов с ПГЛГ, является ТГСК. 5-летняя рОВ в группе ПГЛГ составляет 37±14 % при выполнении ТГСК, 0±0% при выполнении только ИСТ, р = 0,0005. Неудачи ТГСК обусловлены высокой трансплантационной смертностью, рTRM = 54±15%, Идентификация и выбор донора являются приоритетными задачами наравне с генетической верификацией диагноза и началом иммуносупрессивной терапии. ТГСК должна быть выполнена не позднее 4 месяцев от начала ИСТ, так как частота реактивации заболевания составляет 95%, медиана реактивации – 5 месяцев.
-
Молекулярно-генетическое исследование генов PTPN11, NRAS, KRAS и CBL позволяет верифицировать диагноз у 70% пациентов с ЮММЛ. Относительная частота различных генетических дефектов составляет: PTPN11 - 35%, NRAS - 14%, CBL - 13%, KRAS - 11%. Стратификация пациентов на основании генетического варианта ЮММЛ (мутации в генах RAS и CBL), возраста манифестации (< 1 года) и содержания фетального гемоглобина (HbF) (< 10%) позволяет выделить прогностически благоприятную группу, не нуждающуюся в выполнении ТГСК в первой линии терапии. Пациентам этой группы показано проведение ДТ 13-RA + AraC, 5-летняя рОВ при проведении ДТ составляет 75±15%.
-
Пациенты группы высокого риска и пациенты, не ответившие на терапию 13-RA + AraC, нуждаются в выполнении ТГСК по витальным показаниям не позднее 6 месяцев от установления диагноза. ТГСК должна быть выполнена независимо от наличия полностью совместимого донора. 5-летняя рОВ при выполнении ТГСК составила 38±13%. Применение флударабина (Flu) в комбинации с бусульфаном (Bu) и мельфаланом (Mel) обеспечивает эквивалентную частоту приживления трансплантата (90% и 60%, р = 0.24) и общую выживаемость (рОВ 47±19% и 33±19%, р = 0.72) в сравнении с стандартным режимом кондиционирования: циклофосфамид (Cy) + Bu + Mel.
-
Мутация V600E BRAF выявляется у 24% пациентов с ГКЛ и, вероятно, принимает участие в патогенезе заболевания. Значимой корреляции статуса BRAF с клиническими и лабораторными проявлениями заболевания не выявлено. Мутация V600E BRAF потенциально является диагностическим маркером и терапевтической мишенью у пациентов с ГКЛ.
-
Комбинированная ХТ 2-Сda и AraC является эффективным методом лечения мультисистемного ГКЛ, резистентного к стандартной терапии, рОВ = 66±19%. Применение 2-Сda и AraC в терапии первой линии МСОР+ ГКЛ более эффективно в сравнении со стандартной терапией. Частота достижения полных ответов составила 100% vs. 33%, рБСВ = 88±9% vs 40±11%, частота формирования перманентных осложнений, 66% vs 0%. Достоверных различий рОВ не выявлено, что обусловлено высокой эффективностью терапии второй линии. Применение ВХТ 2-Сda + AraC ассоциировано с выраженной миелосупрессией и иммуносупрессией и высоким риском развития инфекционных осложнений. Характер иммуносупрессии определяет спектр инфекций, включающий вирусные инфекции и инфекции вакцинальным штаммом M.bovis.
Внедрение в практику
Результаты работы внедрены в практику молекулярной диагностики ПГЛГ в Медико-генетическом научном центре РАМН (зав. лабораторией профессор А.В.Поляков) и диагностики ЮММЛ в лаборатории молекулярной биологии ФНКЦ ДГОИ (зав. лабораторией к.м.н. Бобрынина В.О.). Алгоритмы диагностики и оптимизированные протоколы терапии используются в отделениях гематологии и трансплантации костного мозга РДКБ и в клинике ФНКЦ ДГОИ. Основные положения и выводы диссертации используются в курсе лекций и семинаров по детской гематологии/онкологии ФУВ РГМУ им. Н.И. Пирогова
Апробация диссертации
Материалы диссертации представлены в докладах на национальных и международных конференциях, в частности на конференции международного общества по изучению гистиоцитозов (Histiocyte Society) в 2005, 2008, 2009 гг., международного общества детских онкологов (SIOP) в 2010 г., европейской ассоциации гематологии (EHA) в 2010 году, европейского общества генетики человека (ESHG) в 2008, 2009, 2010 гг., российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» в 2011 году. Основные положения и выводы диссертации используются в курсе лекций и семинаров по детской гематологии/онкологии ФУВ РГМУ им. Н.И.Пирогова. Материалы диссертации опубликованы в составе 25 печатных работ, в том числе 10 в изданиях, рекоммендованых ВАК.
Апробация диссертации состоялась 15 марта 2011 г. на научно-практической конференции ФНКЦ ДГОИ.
Структура и объем диссертации
