Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 8
1.1 Систематика, морфология и биология дирофилярий 8
1.2 Эпизоотология дирофиляриоза собак 18
1.3 Распространение дирофиляриоза человека 26
1.4 Влияние дирофилярий на организм собак 29
1.5 Посмертная и прижизненная диагностика дирофиляриоза 32
1.6 Терапия и профилактика дирофиляриоза собак 41
2 Собственные исследования 49
2.1 Материалы и методы 49
2.1.1 Характеристика региона исследования 49
2.1.2 Объекты исследования 52
2.1.3 Эпизоотология дирофиляриоза собак в Краснодарском крае 53
2.1.3.1 Распространение дирофиляриоза собак в городской и сельской местности 53
2.1.3.2 Интенсивность инвазии, возрастная и сезонная динамика инвазированности собак дирофиляриями 54
2.1.3.3 Инвазированность собак дирофиляриями в зависимости от породы, пола, типа содержания и характера использования 54
2.1.4 Сезонная периодичность микрофиляриемии и видовой состав микрофилярий у собак Краснодарского края и Московской области 55
2.1.5 Клинические проявления дирофиляриоза собак, влияние степени инвазии на гематологические и биохимические показатели крови 55
2.1.6 Разработка иммунологической диагностики дирофиляриоза собак 56
2.1.6.1 Получение соматического фракционированного антигена из D. immitis и его физико-химическая характеристика 56
2.1.6.2 Разработка иммуноферментной реакции для диагностики дирофиляриоза собак на основе фракционированного соматического антигена 58
2.1.6.3 Диагностическая эффективность ИФР при дирофиляриозе собак 59
2.1.7 Испытание антигельминтных препаратов при дирофиляриозе собак 60
2.1.8 Статистическая обработка данных 60
2.2 Результаты исследований 61
2.2.1 Анализ данных по эпизоотологии дирофиляриоза собак в Краснодарском крае 61
2.2.2 Влияние дирофилярий на организм собак 83
2.2.3 Анализ результатов гематологических и биохимических исследований крови собак при дирофиляриозе 86
2.2.4 Характеристика соматического фракционированного антигена D. immitis 90
2.2.5 Анализ результатов по постановке и учету иммуноферментной реакции при дирофиляриозе собак с использованием соматического фракционированного антигена 96
2.2.6 Диагностическая эффективность иммуноферментной реакции при дирофиляриозе собак с соматическим фракционированным антигеном 102
2.2.7 Оценка эффективности ивомека и моксидектина при дирофиляриозе 105
3 Обсуждение полученных результатов 108
Выводы 116
Практические предложения 118
Список использованный литературы 119
Приложение 137
- Эпизоотология дирофиляриоза собак
- Посмертная и прижизненная диагностика дирофиляриоза
- Эпизоотология дирофиляриоза собак в Краснодарском крае
- Разработка иммуноферментной реакции для диагностики дирофиляриоза собак на основе фракционированного соматического антигена
Введение к работе
Актуальность проблемы. Дирофиляриоз широко распространенное заболевание собак и кошек. Возбудителями дирофиляриоза домашних животных служат круглые паразитические черви Dirofilana immitis, локализующиеся в правом желудочке и легочных артериях и Dirofllaria repens, паразитирующие в подкожной клетчатке. Паразитируя в сердце собак и кошек, дирофилярии вызывают расстройства кровообращения в результате механической закупорки желудочков сердца и сосудов, клинически проявляющегося расстройством сердечной деятельности. D. repens у животных проявляется поражением кожи.
Дирофиляриоз является трансмиссивным заболеванием. Развитие возбудителей дирофиляриоза происходит с участием промежуточного хозяина комаров родов Aedes, Culex, Anopheles.
Определенную опасность дирофилярии представляют для человека, у которого они не достигают половой зрелости. Неполовозрелые дирофилярии обнаруживаются в глазу и других жизненно важных органах человека. Для их удаления требуется хирургическое вмешательство.
Изучением дирофиляриоза плотоядных в нашей стране занимались И.А. Архипов и Д.Р. Архипова (2004).
Остаются недостаточно изученными вопросы эпизоотологии дирофиляриоза собак в южных районах России, Северном Кавказе, в том числе в Краснодарском крае, где он особенно широко распространен и иммунодиагностика этой инвазии, что явилось предметом наших исследований и определило цель работы.
Цель и задачи исследований. Целью нашей работы явилось изучение распространения дирофиляриоза в различных ландшафтно-климатических зонах Краснодарского края и разработка серологической диагностики дирофиляриоза.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
• Изучить распространение дирофиляриоза собак в городской и сельской местности Краснодарского края
• Определить сезонную периодичность появления микрофилярий в крови собак
• Установить влияние возраста, пола, породы, типа содержания собак на зараженность D. immitis
• Изучить влияние D. immitis на организм собаки, гематологические и биохимические показатели крови животных
• Приготовить соматический экстракт из половозрелых дирофилярий, провести его фракционирование и выделить наиболее эффективную диагностическую фракцию
• Провести электрофоретический анализ соматического фракционированного экстракта дирофилярий в ПААГ (полиакриламидный гель)
• Отработать параметры постановки иммуноферментной реакции и оценить диагностические качества фракционированного соматического антигена в ИФР (иммуноферментная реакция)
• Провести производственные испытания ИФР при дирофиляриозе собак
Научная новизна. Впервые в Краснодарском крае установлено распространение дирофиляриоза у собак городской и сельской местности. Максимальная инвазированность собак D. immitis установлена в возрасте 5-7 лет. Выяснено влияние пола, породы, условий содержания на зараженность собак дирофиляриями. Установлена сезонная динамика дирофиляриоза. Проведено фракционирование экстракта D. immitis и определена наиболее активная и специфичная фракция. Определена молекулярная масса белковых компонентов диагностически эффективной фракции соматического антигена из половозрелых D. immitis, которая составила 19,3 и 21,5 кДа соответственно. Впервые в России разработан серологический метод прижизненной диагностики дирофиляриоза собак на основе иммуноферментной реакции с использованием фракционированного соматического экстракта половозрелых дирофилярий. Установлена чувствительность и специфичность ИФР при дирофиляриозе собак - 84,0 и 86,46% соответственно. Оценена эффективность микрофилярицидного действия ивермектина в дозе 0,2 мг/кг массы (100%). Проведена оценка профилактического действия моксидектина в дозе 3 мкг/кг при дирофиляриозе собак в условиях Краснодарского края.
Практическая значимость. Результаты изучения эпизоотологии дирофиляриоза и усовершенствование методов диагностики в условиях Краснодарского края используются при разработке мер борьбы с этой болезнью.
По материалам диссертации разработан лабораторный регламент на выявление антител к дирофиляриям (D. immitis) у собак, одобренный секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (сентябрь 2006г.)
Апробация работы. 1. Заседания ученого совета ВИГИС (2003-2006гг.)
2. Материалы диссертационной работы доложены на научной конференции ВОГ «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (г. Москва, 2004, 2005)
3. Секция «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2006г.)
Основные положения, выносимые на защиту;
1. Эпизоотология, распространение дирофиляриоза собак в разных ландшафтно-климатических районах Краснодарского края;
2. Получение соматического фракционированного антигена из половозрелых D. immitis и его физико-химическая характеристика;
3. Разработка диагностической тест-системы на основе ИФА при дирофиляриозе собак с использованием соматического фракционированного антигена;
4. Оценка лечебного и профилактического действия ивермектина и моксидектина при дирофиляриозе собак в условиях Краснодарского края.
Публикации. По материалам исследований опубликовано 3 статьи:
1. Гаркави Б.Л., Медведев А.Ю. Распространение дирофиляриоза собак и человека в Краснодарском крае //Матер, докл. науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями», М.,2004.-Вып. 5.-С. 111-112.
2. Медведев А.Ю., Гаркави Б.Л. Распространение дирофиляриоза в Краснодарском крае. //Матер, докл. науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». - М., 2005. - С. 230-232.
3. Медведев А.Ю. Распространение дирофиляриоза собак в Краснодарском крае и серологическая диагностика инвазии. //Тр. Всерос. ин-та гельминтол. - 2006. - Т. 43. - С. 196-202.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах компьютерного текста. Состоит из введения, обзора литературы и собственных исследований, включающих материалы и методы, 7 глав, обсуждения, выводы, практические предложения. Список литературы содержит 197 источника, в том числе 67 отечественных и 130 иностранных. Работа иллюстрирована 16 таблицами, 7 рисунками и 3 фотографиями.
Эпизоотология дирофиляриоза собак
К дирофиляриозу восприимчивы кошки, домашние и одичавшие собаки, красный волк, рыжая лисица, койот, хорек, дикие кошки, которые являются дефинитивными хозяевами. Дирофиляриозом болеет и человек, который является факультативным хозяином, то есть это гельминтозоонозная инвазия (К.И. Скрябин, Н.П. Шихобалова, 1948).
Дирофиляриоз собак имеет повсеместное распространение. Среди факторов, объясняющих широкое распространение дирофиляриоза в мире за последние годы, основными являются: значительная миграция людей со своими домашними животными из одной страны в другую, увеличение численности собак, адаптация дирофилярий к разным промежуточным хозяевам и приспособленность личиночных стадий к развитию при разных температурных режимах.
Из анализа литературных данных следует отметить, что дирофиляриоз собак регистрируется во многих странах мира: Африка, Азия, Южная и Центральная Европа, США, Россия, Украина, Азербайджан, Среднеазиатских республиках. В сравнении с предыдущими годами, когда заболевание чаще всего отмечали в странах с теплым климатом, в настоящее время оно распространяется и на районы с умеренным климатом, где имеются условия для размножения промежуточных хозяев - комаров. Резервуаром для дирофиляриозной инвазии могут служить также дикие животные: волки, лисы, енотовидные собаки и т.д., таким образом, дирофиляриоз является природно-очаговой инвазией.
На территории бывшего союза первый случай обнаружения D. immitis зафиксировал Л.С. Гогель (1910) в Азербайджане, a D. repens впервые обнаружил и описал Н.И. Петропавловский (1904) в Харьковской области. Дирофиляриоз, вызываемый D. immitis, зарегистрирован в Абхазии (А.И. Блажин, 1937), Грузии (П.П. Бурджанадзе, 1943), Армении (В.В. Насилова, 1952), Узбекистане (Т.П. Худавердиев, Ш.М. Джафаров, 1979), Туркменистане (К.И. Скрябин, 1916; В.Л. Якимов, 1916), Крыму (А.И. Каденации, 1958). Дирофиляриоз, вызываемый D. repens, обнаружен в Ростовской области (Б.М. Гурвич, 1929), Уссурийском крае (A.M. Петров, 1931), Армении (В.В. Насилова, 1948, 1952), Грузии (П.П. Бурджанадзе, 1943), Киргизии (С.Л. Роберман,1941). A.M. Петров (1926) указывал на 20%-ную пораженность собак D. repens, 10,0% и 2,5% зараженность собак Амуро-Уссурийского края D. immitis и D. repens. По данным вскрытия А.И. Блажина (1937) в Абхазии установлена 24,0% и 4, 0% зараженность собак соответственно D. repens и D. immitis. На территории Азербайджанской ССР методом полных гельминтологических вскрытий обследовали 151 собаку и установили 15,2%-ную зараженность HXD. repens (А.Я. Демидова, 1937). При исследовании на дирофиляриоз 300 собак в Армянской ССР методом прижизненной и посмертной диагностики установили, что 22 из них инвазированы D. repens и 2- D. immitis (В.В. Насилова, 1948, 1952). СИ. Хижа (1958) также указывает на частое обнаружение D. repens у собак в Армянской ССР. А.Н. Каденации (1958) указал на 0,6% и 0,3% зараженность собак Крыма соответственно D. repens и D. immitis. Н.М. Матчанов (1961) изучал гельминтофауну собак Ташкентской области и установил 1,4%-ную зараженность собак D. repens. Распространение дирофиляриоза в Нахичеванской АССР изучали Т.П. Худавердиев (1976), Т.П. Худавердиев и Ш.М. Джафаров (1979). Они установили максимальную зараженность дирофиляриями D. repens в июне, июле в низменной зоне республике, где расположены обширные постоянные заболоченные участки. В горной зоне республики дирофиляриоз не обнаружен. Собаки породы немецкая овчарка заражены в большей степени, чем кавказские овчарки. Сильно поражены дирофиляриями собаки в возрасте старше 5 лет. У щенков до года дирофилярии не обнаруживали.
Зараженность собак дирофиляриями в г. Ростов-на-Дону достигала 30% (А.А. Артамонова, и др., 1997). М.А. Фисько (2006) изучал распространение дирофиляриоза в г. Новочеркасске. Из 421 собаки дирофилярии обнаружили у 190, что составляет 46% экстенсивности инвазии при средней интенсивности инвазии 2865 микрофилярий в 1 мл крови. По данным И.В. Левченко (1999) 11,2% собак, прибывших из Ростовской и Воронежской областей, Краснодарского и Ставропольского краев, Республики Кабардино-Балкарии, Северной Осетии, Чечни и из городов Южно-Сахалинск и Владивосток, оказались зараженными дирофиляриями. Дирофиляриоз обнаружили А.В. Кудинов и Л.В. Анникова (2002) у собак г. Саратова и Саратовской области. Из 470 исследованных животных у 60 (12,7%) в крови находили микрофилярий. При вскрытии трупов собак в сердце обнаруживали взрослых D. immitis. И.А. Архипов, Д.Р. Архипова (1994), анализируя литературные и собственные данные, сообщают, что этот вид распространен в Хабаровском крае, Узбекистане, Казахстане, Закавказье, Северном Кавказе.
И.А. Архиповым и др. (2002), Д.Р. Архиповой (2003) впервые на территории Республики Калмыкия у собак установлен дирофиляриоз, вызванный D. repens как в сельской местности, так и в городских условиях (г. Элиста). Экстенсивность дирофиляриозной инвазии у собак городской популяции составила 15,5, а у собак сельской популяции, в среднем 23,6%. Среднее количество микрофилярий D. repens в 20 мм3 крови у сельских собак было равным 247,3±26,8 у городских - 112,7±11,4 экз. и колебалось от 14 до 836 экз. Получена значительная разница в инвазированности дирофиляриями собак городской и сельской популяции по данным их вскрытия. Экстенсивность инвазии у собак городской популяции составила 18,9, сельской - 29,3%, а интенсивность - соответственно 8,2±1,6 и 15,1±2,4 экз. Плотность популяции D. repens в организме собак колебалась от 7 до 27 экз./гол. Таким образом, наибольшую зараженность дирофиляриями отмечали у собак сельской популяции, что обусловлено большей плотностью популяции комаров - промежуточных хозяев и лучшими условиями передачи инвазии в сельской местности.
Впервые в Краснодарском крае нематода D. repens зарегистрирована в одном из индивидуальных хозяйств по содержанию песцов в станице Елизаветинской (А.Я. Сапунов, М.И. Звержановский, 1980). Возраст песцов был от 1 до 2 лет. У зверей до убоя проявлялось беспокойство и зуд, наблюдалась потеря аппетита и упитанности. При обследовании подкожной клетчатки, особенно в области крупа, все четыре песца оказались инвазированными нематодой D. repens.
Посмертная и прижизненная диагностика дирофиляриоза
Посмертная диагностика. Осуществляется путем патологоанатомического вскрытия трупов погибших животных и обнаружения половозрелых нематод вида D. immitis. Их находят обычно в полости сердца, чаще в правом желудочке или в легочной артерии. Другой вид, D. repens, обнаруживается в подкожной клетчатке в области крупа и в других местах при зачистке кожи (мездры) животных. J.F. Fortin (1979) описывает случай интенсивного заражения собак D. immitis (более 50 экз.), при котором наблюдалось повреждение в области трехстворчатого клапана или сухожильных нитей. Дирофилярий могут активно мигрировать из легочной артерии в правый желудочек, правое предсердие и, изредка - в полую вену. Это может привести к острому «синдрому полой вены», который характеризуется внутрисосудистым гемолизом эритроцитов, диссеминированным внутрисосудистым свертыванием крови и шоком.
Патологоанатомические изменения в организме хозяина J.R. Raynaud (1990) связывает с повреждениями, которые вызывают половозрелые нематоды и ювенильные формы мигрирующих личинок. Половозрелые гельминты вызывают повреждения эндотелия кровеносных сосудов и эндокарда сердца. В легких отмечают серозно-катаральное или гнойно катаральное воспаление и тромбоэмболию сосудов. В печени венозный застой, белковую дистрофию: иногда выявляют водянку брюшной полости и гломерулонефрит.
При вскрытии собак, пораженных D. repens, половозрелых червей обнаруживают в подкожной клетчатки шеи, подгрудка вдоль позвоночного столба по обе стороны тела в области брюшной стенки и реже в области конечностей, а также головы (Поживил, Галат, 1998).
А.И. Поживил, В.М. Гаржеев (1999) отмечают иногда наличие большого количества прозрачной жидкости в брюшной полости животных. В соединительно-тканных волокнах таких животных, микроскопически наблюдается разволокнение, утолщение и наличие отечной жидкости, которая бедна клеточным составом и белком. Такая ткань окрашивается гематоксилин-эозином в светло-розовый цвет.
Е.И. Любченко, О.И. Вавилова (2000), Р.В. Рощина (2001) описывают паразитарные узелки размером от горошины до куриного яйца, на поверхности таких узелков образуются язвы. При пальпации припухлостей ощущается флюктуация, а при разрезе выделяется серозный или гнойный экссудат. В полостях таких припухлостей обычно обнаруживают от 1-5 нематод длиной 17-20 см, диаметром 1-1,8 мм. Иногда патологический процесс осложняется вторичной микрофлорой и возникает флегмона. Подкожная клетчатка в области узелков утолщена за счет отека и приобретает складчатость, регионарные лимфоузлы увеличены плотной консистенции, серого цвета. Слизистые оболочки анемичны.
Б.Л. Гаркави, В.М. Кравченко (2001) в условиях Краснодарского края описывают нематоду D. immitis, которая локализовалась в правом желудочке сердца и легочной артерии. Еще раньше о локализации нематоды в этих органах указывали иностранные авторы (W.L.Newton, 1968; J.M. Doby et al., 1968). Кроме посмертной диагностики имеется ряд методов прижизненной диагностики, о которых сообщают многие авторы (С.А. Нагорный, и др., 1997; D. De Lahitte et al.,1986; P.B. Рощина, 1999).
Прижизненная диагностика. Диагностика дирофиляриоза занимает ведущее место в системе мероприятий, направленных на предупреждение заболевания животных и людей. Наибольшего внимания заслуживают методы прижизненной диагностики, позволяющие предупредить распространение инвазии и существенно снизить затраты на содержание зараженных животных.
В настоящее время активно продолжается поиск эффективных и экологичных методов прижизненной диагностики для широкого использования не только в ветеринарии, но, в первую очередь, в сфере медицинского обслуживания.
К прижизненной диагностике относятся прямое исследование крови, методы концентрации, методы фильтрации, количественная диагностика, методы дифференциальной диагностики, иммунологические методы, радиография.
Одним из самых простых и быстрых методов обнаружения микрофилярий является метод прямого исследования мазка крови при малом увеличении микроскопа. Хорошие и быстрые результаты дает метод нативной капли, который, однако, приемлем, если в крови есть микрофилярий. При «скрытой» форме дирофиляриоза и низкой интенсивности инвазии этот метод бессмыслен. Недостатком этого метода также является невозможность провести идентификацию микрофилярий по видам (J.D. Kelly, 1973).
Методы концентрации. Центрифугирование крови позволяет максимально сконцентрировать микрофилярий в небольшом объеме крови. J.I. Knott (1939) предложил метод, сущность которого заключается в том, что в пробирку с 1 мл свежей крови добавляется 10 мл 2%-ного раствора формалина и смесь центрифугируется в течение 5 минут при 1000 - 1500 оборотах в минуту. Надосадочную жидкость удаляют, осадок смешивают в равных количествах с 0,1%-ным раствором метиленовой сини. Из окрашенного осадка делают влажный мазок и исследуют под микроскопом.
W.L. Newton, W.H. Wright (1956) усовершенствовали метод J.I. Knott (1939), а именно вместо влажного мазка 1 каплю окрашенного осадка помещали на предметное стекло, накрывали покровным и исследовали под микроскопом. Этот метод особенно эффективен при слабой степени инвазии, поскольку все микрофилярии концентрируется в небольшом количестве осадка, состоящего в основном из лейкоцитов и разрушенных гемолизированных эритроцитов. Он позволяет также легко измерить длину и ширину микрофилярии.
Методы фильтрации. Метод фильтрации через миллипоровые фильтры предложен J. P. Wylie (1970). В шприц набирают 1 мл крови, смешивают с гепарином и добавляют 10 мл лизирующего раствора. Полученный лизированный кровяной раствор из шприца пропускают через миллипоровый фильтр размером пор 8 ji. Затем через фильтр медленно пропускают 5 - 10 мл раствора толуидинового синего. Далее фильтр промывают 10 мл воды, отсоединяют от держателя и исследуют под микроскопом. Окрашенные микрофилярии можно дифференцировать. Этот метод не требует центрифуги.
Количественная диагностика. Для практикующих врачей в химиотерапевтических опытах необходимо проводить количественное выявление микрофилярии. При определении интенсивности инвазии следует использовать метод обогащенного мазка с 5% - ной уксусной кислотой. Кровь смешивают в объеме 0,1 мл (2 капли) с 1,5 мл 5%-ной уксусной кислоты, затем смесь и центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин. и из осадка готовят мазок, который фиксируют спиртом и окрашивают по Романовскому - Гимза (D. d Lahitte et al., 1986; F. Mizuno, T. Matsumura, 1981). J.R. Lindsey (1965) для подсчета микрофилярий предложил метод, при котором кровь набирают в шприц с гепарином, смешивают. Затем делают 3 мазка (2 мл), высушивают их и окрашивают раствором Гимза. Если в мазке обнаруживают, в среднем, менее 1 микрофилярий, то считают, что в 1 мл цельной крови меньше 50 микрофилярий.
Эпизоотология дирофиляриоза собак в Краснодарском крае
Распространение дирофиляриоза собак в городской и сельской местности в разных ландшафтно-климатических условиях края изучали на основании исследований проб крови методом концентрации. Всего обследовали 1192 собаки г. Краснодара и 234 собаки из разных районов Краснодарского края. Работу по распространению дирофиляриоза среди собак проводили в период 2003 - 2006 гг. в Краснодарском крае во все сезоны года. Диагностические исследования по обнаружению микрофилярий в крови собак проводили согласно модифицированному методу Knott (1939), а также по методу неполных гельминтологических вскрытий в разных районах Краснодарского края различных по ландшафтно-климатическим зонам. В объект исследования вошли Приморско-Ахтарский, Павловский, Лабинский, Славянский, Красноармейский, Тимашевский районы, г. Краснодар.
Для исследования крови на наличие микрофилярий использовали обычную стандартную пробирку и в нее добавляли 2-3 капли 20%-ного раствора лимоннокислого натрия. Пробы крови брали из подкожной вены предплечья собаки объемом 1-2 мл. После этого пробирку закрывали и переворачивали 3-4 раза для лучшего смешивания крови с противосвертывающим раствором. Исследовали пробы крови в первый день взятия, так как в это время личинки филярий наиболее подвижны.
Перед исследованием отстоявшуюся кровь тщательно перемешивали. В коническую центрифужную пробирку объемом 10 мл вносили 1 мл исследуемой крови и 9 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивали для лучшего лизирования эритроцитов. Пробирку закрывали плотной пробкой. Затем центрифужные пробирки с пробой помещали в центрифугу типа ОПн-8УХЛ4.2 и центрифугировали в течение 5 -7 минут при 1000 - 1500 об/мин. Пробирки с пробами вынимали из центрифуги и помещали в штатив. Надосадочную жидкость из пробирки сливали, оставляя до 1 мл. Оставшуюся жидкость частями выливали на предметное стекло и просматривали под малым увеличением микроскопа на наличие микрофилярий.
Интенсивность инвазии P. immitis среди собак изучали на основании гельминтологических вскрытий сердца, легочной артерии и подкожной клетчатки 26 трупов собак г. Краснодара и других районов края. При гельминтологическом вскрытии у каждого животного подсчитывали количество дирофилярий, определяли экстенсивность инвазии (ЭИ, %) и интенсивность инвазии (ИИ, экз./гол.).
Возрастную и сезонную динамику инвазированности собак дирофиляриями изучали в условиях Краснодарского края в 2003-2005 гг. по результатам исследований проб венозной крови 31 щенка в возрасте до года, а также 44, 47, 28, 24 собак в возрасте соответственно 1-3, 4-6, 7-9, 10 лет и старше. У собак различных возрастных групп брали кровь в разные сезоны года и исследовали методом концентрации.
Влияние породы, пола и типа содержания на инвазированность дирофиляриями изучали на 770 собаках разного возраста. После изучения распространения и сезонно-возрастной динамики инвазированности собак дирофиляриями проводили анализ зараженности их с учетом пола, породы и назначения: домашнего содержания (мелкие и служебные породы), дворовые, бродячие.
Сезонную периодичность появления микрофилярий P. immitis в крови изучали на 508 спонтанно инвазированных собаках. У собак брали пробы крови из подкожной вены предплечья в разное время года и устанавливали наличие микрофилярий методом концентрации по Knott (1939).
Дифференциальное окрашивание личинок и видовой состав микрофилярий собак Краснодарского края изучали путем окрашивания личинок кислой фосфатазой (L. Chalifoux, R.D. Hunt, 1971). Всего исследовано 50 проб крови с микрофиляриями. Сначала микрофилярий отмывали от эритроцитов. Затем личинки инкубировали в субстрате, состоящем из мединалового буфера, парарозалинилинового красителя и ASR нафтола, 1 час при 37 С. Далее промывали в дистиллированной воде и помещали в 1% метиленовый зеленый. Через 2-3 минуты отмывали снова дистиллированной водой. Дегидротировали сначала в 95% спирте, затем в чистом этиловом спирте и промывали в ксилоле. В опыте использовали 10 собак, спонтанно инвазированных D. immitis, и 10 собак, свободных от дирофилярий и другой инвазии. После постановки диагноза у собак брали пробы крови для гематологических и биохимических исследований. Пробы крови брали в специальные пробирки для данных исследований. Гематологические показатели определяли общепринятыми методами: эритроциты и лейкоциты подсчитывали при помощи счетной камеры Горяева, гемоглобин при помощи гемоглобинметра «МИНИГЕМ 540», гематокрит определяли, используя гематокритные капилляры и центрифугу при 2000 об./мин. в течение 5-7 минут, СОЭ -микрометодом в капилляре Панченкова. Для подсчета лейкоцитарной формулы мазки крови красили по Романовскому-Гимза и подсчитывали по 100 клеток, а затем выводили процентное соотношение отдельных видов лейкоцитов.
Биохимические показатели крови собак исследовали на анализаторе «Clima МС 15» с определением уровня аспартат-трансаминазы (ед./л), аланин-трансаминазы (ед./л), щелочной фосфатазы (ед./л), креатинина (ед./л), билирубина (мкмоль/л), прямого билирубина (мкмоль/л), мочевины (моль/л), глюкозы (моль/л), общего белка (г/л) и альбумина (г/л), а-амилазы (ед./л.), натрия (ммоль/л), калия (ммоль/л), кальция (ммоль/л). Кроме того, у этих собак учитывали общие клинические показатели по общепринятым методам.
Разработка иммуноферментной реакции для диагностики дирофиляриоза собак на основе фракционированного соматического антигена
В процессе длительного изучения эпизоотологии гельминтозов и организации противогельминтозных мероприятий известный отечественный гельминтолог, д.в.н., проф. Е.Е. Шумакович пришел к заключению в 1963 г.: «Эпизоотология одного и того же гельминтоза в разных зонах имеет существенное отличие и разработка мер борьбы с гельминтозами в настоящее время невозможна без предварительного изучения их эпизоотологии».
Знание закономерностей течения эпизоотического процесса, как известно, помогает разрабатывать систему противоэпизоотических мероприятий, позволяющую изменять естественный ход, предупреждать его активацию и прерывать этот процесс на отдельных территориях. Эти позиции были взяты нами за основу при изучении эпизоотологии дирофиляриоза собак в Краснодарском крае. По результатам исследований проб крови собак на дирофиляриоз мы установили, что он регистрируется во всех обследуемых районах края, причем как в сельской местности, так и в городских условиях (г. Краснодар). По нашим данным экстенсивность инвазии достигает у сельских собак 19,04-69,6% (в среднем 34,35%), у городских - 28,02% (табл. 2). Впервые на основе анализа результатов наших исследований была установлена высокая зараженность собак D. immitis в плавневой зоне Краснодарского края (Западная дельтовая зона, г. Приморско-Ахтарск). При гельминтологическом вскрытии сердца и крупных сосудов сердца у собак установлена 42,85%-ная экстенсивность дирофиляриозной инвазии в сельской местности Краснодарского края и 53,3%-ная - в городской .
В районах, расположенных в плавневой зоне: Приморско-Ахтарском, Красноармейском и Славянском (Анапо-Таманская зона), исследовали 77 проб крови собак, из них микродирофилярии найдены в 32 пробах (41,5%). В районах, расположенных в степной зоне: Тимашевском (Центральная зона) и Павловском (Северная зона) и в г. Краснодаре, при исследовании 1304 проб крови микродирофилярии найдены в 367, что составляет 28,14%. В предгорной зоне в Лабинском районе (Южно-Предгорная зона) из 45 исследованных проб микрофилярии были обнаружены в 16 пробах (35,5%).
Наибольшую экстенсивность инвазии собак регистрировали в плавневой зоне края - 41,5% - местности отличающейся значительным количеством открытых водоемов (Западная дельтовая и Анапо-Таманская зоны). Несколько ниже, но также достаточно высокий процент зараженных собак оказался в степной и предгорной природно-климатических зонах края (Центральная и Южно-Предгорная зоны) (табл. 4).
Судя по нашим исследованиям наибольшая зараженность микрофиляриями отмечена у собак сельской популяции и плавневой зоны (Западная дельтовая и Анапо-Таманская зоны), что, на наш взгляд, обусловлено большей плотностью популяции комаров - промежуточных хозяев и лучшими условиями передачи инвазии. Немаловажным условием для развития промежуточных хозяев - комаров является высокая среднегодовая температура и влажность воздуха. Она благотворно влияет на развитие личинок в промежуточном хозяине и на развитие самих промежуточных хозяев. Таблица З Экстенсивность инвазии D. immitis в организме городских и сельских собак
Результаты исследований проб крови собак в разные сезоны года, проведенные в условиях Краснодарского края, свидетельствуют о существенной разнице в экстенсивности микрофиляриозной инвазии в разное время года. Максимальную экстенсивность инвазии отмечали у собак летом в июне-52,08% и осенью в октябре-53,12%, в среднем за лето ЭИ достигала 42,02%, осенью-42,56%. В зимний период ЭИ снижалась в среднем до 17,52% (табл. 5; рис.3).
Результаты гельминтологических вскрытий сердца собак (табл. 6) значительно отличаются от результатов исследований крови в разные сезоны года (табл. 6). По результатам вскрытия трупов собак нами не отмечена значительная разница в экстенсивности и интенсивности дирофиляриозной инвазии. Экстенсивность инвазии составила зимой - 66,6%, весной - 38,46%, летом - 66,6% и осенью - 50% при интенсивности инвазии, равной соответственно 23,75; 31; 37; 36,6 экз/гол., а в среднем, ЭИ была равной 55,41% и ИИ - 32,08 экз./гол. (табл. 6; рис. 2).
На наш взгляд, наиболее объективными являются результаты гельминтологических вскрытий трупов собак, показавшие отсутствие значительной разницы в ЭИ и ИИ в разные сезоны года. Значительные колебания в экстенсинвазированности собак и наличие микрофилярий в периферической крови, вероятно, обусловлены сезонной периодичностью микрофиляриемии в крови собак, что напрямую связано с биологией промежуточных хозяев - комаров. Пик микрофиляриемии отмечается летом-осенью в период активности большей численности комаров -промежуточных хозяев, что позволяет в природе осуществить передачу и дальнейшее распространение инвазии.
