Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1. Полимеразная цепная реакция как один из методов генодиагностики 11
1.1.1. Принцип метода 11
1.1.2. Преимущества полимеразной цепной реакции как метода диагностики инфекционных, инвазионных заболеваний животных и человека 15
1.1.3. Задачи в современной инфекционной и инвазионной патологии, которые можно решать с помощью полимеразной цепной реакции ...18
1.1.4. Практические требования к подбору условий проведения полимеразной цепной реакции 19
1.1.4.1. Основные требования к компонентам полимеразной цепной реакции 19
1.1.4.1.1. Фермент Taq-полимераза 19
1.1.4.1.2. ДНК 21
1.1.4.1.3. Олигонуклеотидные праймеры 23
1.1.4.1.4. Концентрация ионов MgiT 26
1.1.4.1.5. Дезоксинуклеотидтрифосфаты (дНТФ). 27
1.1.4.2. Выбор режима проведения полимеразной цепной реакции 27
1.1.5. Регистрация результатов полимеразной цепной реакции 29
1.1.6. Предупреждение ложноположительных и ложноотрицательных результатов полимеразной цепной реакции 30
1.2. Современные модификации полимеразной цепной реакции 34
1.3. Альтернативные ПЦР-методы амплификации нуклеиновых кислот 37
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 40
2.1. Материалы и методы 40
2.1.1. Материалы ..40
2Л.1.1. Штаммы и ДНК микроорганизмов, эукариотичексие ДНК, использованные при разработке ПНР тест-систем для идентификации Toxoplasma gondii, Neospora caninum 40
2.1 Л .2. Лабораторные животные 41
2.1Л .3. Клинический и патологический материал 41
2.1 Л .4. Оборудование и химические реактивы 41
2.1.2. Методы : 45
2.1.2.1. Полимеразная цепная реакция , 45
2.1.2Л.1. Выделение хромосомной ДНК из культур клеток Toxoplasma gondii, Neospora caninum, Sarcocystis sp.; сыворотки крови, образцов тканей глаз, головного и спинного мозга, сердца, легких, печени, селезенки, почек, мышечной ткани 45
2.1.2.1.2, Определение концентрации ДНК 46
2Л .2 Л .3. Выбор и синтез специфических олигонуклеотидных праймеров для проведения полимеразной цепной реакции (ПНР) 47
2 Л .2Л .4. Условия проведения полимеразной цепной реакции .47
2.1.2.1.5. Регистрация результатов полимеразной цепной реакции 48
2Л.2Л.6. Предупреждение ложноположительных и ложноотрицательных результатов полимеразной цепной реакции
48
2.1.2.2. Определение чувствительности разработанных ПНР тест-систем для диагностики протозойных заболеваний животных 49
2.1.2.3. Разработка контрольных ПЦР-позитивных образцов ДНК нового типа 49
2.1.2.4. Моделирование острой токсоплазмозной инвазии на лабораторных животных 50
2.1.2.5. Проведение иммунологических методов диагностики 51
2.1.2.5.1. Иммуноферментный анализ (ИФА) 51
2.1.2.5.2. Реакция непрямой иммунофпюоресценции (РНИФ) 51
2.2. Результаты исследований и их обсуждение 52
2.2.1. Генетическое типирование близкородственных паразитических простейших Toxoplasma gondii, Neospora caninum и Sarcocystis sp. методом полимеразной цепной реакции с помощью универсальных праймеров .52
2.2.2. Разработка ПЦР"- тест-системы для диагностики токсоплазмоза животных 57
2.2.2.1. Подбор оптимальной методики выделения ДНК из культур клеток Toxoplasma gondii, Neospora caninum, Sarcocystis sp ..57
2.2.2.2. Выбор и синтез специфических олигонуклеотидных праймеров для проведения полимеразной цепной реакции 58
2.2.2.3. Подбор оптимальных условий проведения ПЦР-анализа 59
2.2.2.4. Проверка таксономической специфичности ПЦР тест-системы для идентификации Toxoplasma gondii 68
2.2.2.5. Определение чувствительности ПЦР тест-системы для идентификации Toxoplasma gondii 71
2.2.2.6. Разработка программы постановки полимеразной цепной реакции для данной тест-системы в быстром режиме амплификации 73
2.2.3. Разработка ПЦР тест-системы для диагностики неоспороза животных 74
2.2.3.1. Выбор и синтез специфических олигонуклеотидных праймеров для проведения полимеразной цепной реакции 74
2.2.3.2. Подбор оптимальных условий проведения ПЦР-анализа 76
5
2.2.3.3. Проверка таксономической специфичности ПЦР тест-систем 1 и 2 для идентификации Neospora caninum 85
2.2.3.4. Определение чувствительности ПЦР тест-систем 1 и 2 для идентификации Neospora caninum 92
2.2.4. Разработка контрольных ПЦР позитивных образцов ДНК нового типа в ПЦР тест-системах "Токсоплазма ампли-тест", "Неоспора ампли- тест" ...98
2.2.5. Апробирование ПЦР тест-системы "Токсоплазма ампли-тест" на клиническом и патологическом материале 101
2.2.5.1. Подбор оптимальной методики выделения ДНК из сыворотки крови, образцов тканей глаз, головного и спинного мозга, сердца, легких, селезенки, почек, мышечной ткани ; 101
2.2.5.2. Выявление возбудителя токсоплазмоза методом полимеразной цепной реакции при моделировании острой инвазии на лабораторных животных 101
2.2.5.3. Выявление возбудителя токсоплазмоза методом полимеразной цепной реакции в клиническом и патологическом материале от естественно инвазированных животных 112
3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 118
4. ВЫВОДЫ ..,..125
5. ПРАКТРЇЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 126
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 127
7. ПРИЛОЖЕНИЕ 143
- Полимеразная цепная реакция как один из методов генодиагностики
- Современные модификации полимеразной цепной реакции
- Материалы и методы
Введение к работе
Актуальность проблемы. Конец 90-х годов ознаменовался широким использованием новых методических подходов в диагностике заболеваний человека и животных. Среди них ведущее место заняли молекулярно-генетические методы исследования. Они позволили по новому подойти к решению ряда основных вопросов инфекционной и инвазионной патологии, и даже предложить новые подходы для контроля лечения заболеваний. Принципиальный шаг в диагностике, который уже сделан и который получает свое дальнейшее развитие как в прикладном, так и в фундаментальном аспекте связан с амплификационными методами выявления генетического материала инфекционных и инвазионных агентов, а именно методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод полимеразной цепной реакции позволяет с помощью определенной ферментативной реакции in vitro за два-три часа в миллион раз размножить специфический фрагмент ДНК любого возбудителя и на основании этого сделать заключение о возможности его нахождения в исследуемом образце.
Токсоплазмоз и неоспороз - это паразитарные заболевания животных, вызываемые близкородственными облигатными внутриклеточными простейшими Toxoplasma gondii и Neospora caninum (семейство Sarcocystidae, тип Apicomplexa), характеризующиеся повсеместным распространением, сходными клиническими признаками, общим широким кругом инвазированньгх животных.
Токсоплазмоз как тяжелое паразитарное заболевание животных и человека был описан в 1908 г. французскими исследователями Ch. Nicolle и L. Manceaux и в дальнейшем достаточно хорошо изучен. Неоспороз - это относительно недавно идентифицированное протозойное заболевание, которое до 1988 г. ошибочно диагностировалось как токсоплазмоз. Только в 1988 г. американские исследователи J.P. Dubey, J.L. Carpenter, C.A. Speer et al. впервые выделили Neospora caninum из тканей собаки, инвазированной в естественных условиях, описали данное простейшее и доказали его отличие от Toxoplasma gondii.
Статистические данные показывают, что суммарный ущерб наносимый данными протозойными заболеваниями значителен (Вершинин И.И., 1996; Dubey J.P., 1999). Однако, точная оценка наносимого ущерба каждым из этих заболеваний возможна только при наличии высоко специфичных диагностических подходов. Кроме того, необходимость разработки современных методов диагностики обусловлена также значительным полиморфизмом и одновременно сходностью неспецифических клинических проявлений при токсоплазмозе и неоспорозе животных. Разнообразный характер течения болезни практически исключает возможность постановки диагноза только на основании клинической картины, в связи с чем возрастает роль лабораторных исследований, включающих паразитологические и иммунологические методы. Применяющиеся в настоящее время традиционные методы диагностики характеризуются значительной продолжительностью, трудоемкостью, большой себестоимостью, не всегда надежны и, в большинстве случаев, не позволяют провести в короткие сроки скрининговые обследования животных. В связи с этим важной задачей является разработка нового ускоренного, высокочувствительного и специфического молекулярно-генетического метода диагностики, основанного на возможности выявления в исследуемом материале специфических фрагментов нуклеиновых кислот диагностируемых организмов.
Разработка ПЦР тест-систем для диагностики токсоплазмоза и неоспороза животных является актуальной задачей, призванной дополнить традиционную диагностику точным, быстрым, недорогим методом, позволяющим в короткий срок осуществлять дифференциальную диагностику заболеваний и проводить скрининговые обследования животных.
Цель и задачи исследований. Основной целью нашего исследования было разработать диагностические ГЩР тест-системы для выявления возбудителей токсоплазмоза и неоспороза животных.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Провести исследование по сравнению структуры геномов близкородственных паразитических простейших Toxoplasma gondii, Neospora caninum и Sarcocystis sp.
Подобрать специфические олигонуклеотидные праймеры для выявления ДНК Toxoplasma gondii и Neospora caninum.
Отработать условия проведения полимеразной цепной реакции на чистых культурах идентифицируемых возбудителей, включающие подбор методики выделения ДНК, концентраций компонентов реакционной смеси, выбор температурного режима, схемы постановки и условий регистрации результатов анализа,
Проверить таксономическую специфичность разработанных ГЩР тест-систем.
Определить чувствительность последних.
Апробировать диагностические ПНР тест-системы на клиническом и патологическом материале от лабораторных животных при моделировании острой инвазии.
Апробировать диагностические ПНР тест-системы на клиническом и патологическом материале от естественно зараженных животных.
Научная новизна
Разработаны ПЦР тест-системы для диагностики токсоплазмоза и неоспороза животных.
Подобраны методики выделения ДНК из культур клеток простейших организмов, различного клинического материала.
Модифицирована методика выделения ДНК из различного патологического материала.
Разработанные ПЦР тест-системы могут быть использованы для дифференциации чистых культур близкородственных простейших -возбудителей токсоплазмоза, неоспороза и саркоцистоза животных.
Разработанная ПЦР тест-система для выявления ДНК Toxoplasma gondii "Токсоплазма ампли-тест" позволяет идентифицировать возбудителя заболевания на различных стадиях развития инвазионного процесса.
Проведено генетическое типирование близкородственных празитических простейших Toxoplasma gondii, Neospora caninum и Sarcocystis sp. методом полимеразной цепной реакции с помощью универсальных праймеров с наибольшей наглядностью подтверждающее близкое родство, но не полную идентичность их геномов.
Практическая значимость
По материалам диссертационной работы разработаны: "Инструкция по применению тест-системы для выявления ДНК Toxoplasma gondii методом полимеразной цепной реакции ("Токсоплазма ампли-тест")", "Наставление по применению тест-системы для выявления ДНК Neospora caninum методом полимеразной цепной реакции ("Неоспора ампли-тест")".
Результаты исследований могут быть использованы в ветеринарной практике для прижизненной и посмертной диагностики токсоплазмоза и неоспороза животных.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы доложены на:
1.3-й Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика в современной медицине" (Москва, 25 -27 января 2000 г.). XXVII межвузовской научно-практической конференции, посвященной дню рождения академика Е.Н. Павловского (Санкт-Петербург, 23-25 января 2000 г.).
Всероссийской междисциплинарной научно -практической конференции "Внутриутробные инфекции плода и новорожденного" (Саратов, 29-31 мая 2000 г.).
П-ой международной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, 18-19 октября 2000 г.).
Сессии Российской ассоциации медицинской лабораторной диагностики (РАМЛД) и учебного центра "Ниармедик-Плюс" при НИИЭиМ им. Н.Ф. Гамалеи "Генодиагностика в инфектологии. Место ПЦР-анализа в комплексе лабораторных диагностических тестов" (Москва, 23-25 января 2001 г.).
Объединенных сессиях Координационного совещания по ветеринарной паразитологии центрального совета Общества гельминтологов РАЛ и секции "Инвазионные болезни животных" РАСХН, проводившихся 26.05.00, 01.06.00, 20-22.02.01 (Москва).
7. Заседаниях Ученого Совета ВИГИС (1998-2001 гг.). Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ и
4 работы приняты к публикации.
Основные положения, выносимые на защиту:
Высокая специфичность, чувствительность и быстрота получения результатов разработанных ПЦР тест-систем для идентификации Toxoplasma gondii, Neospora caninum позволяют использовать их в скрининговых обследованиях хозяйств и комплексной диагностике протозойных заболеваний животных.
Испытания разработанной ПЦР тест-системы "Токсоплазма ампли-тест" для диагностики токсоплазмоза животных показали ее большую чувствительность и эффективность по сравнению с иммунологическими тестами.
Разработанная ПЦР тест-система "Токсоплазма ампли-тест" позволяет установить локализацию Toxoplasma gondii в сыворотке крови и органах животных на различных стадиях развития инвазионного процесса.
Генотипирование близкородственных паразитических простейших Toxoplasma gondii, Neospora caninum и Sarcocystis sp. выявило близкое родство, но не полную идентичность анализируемых геномов.
Объем и структура диссертации. Материал диссертации изложен на 150 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, включающего: материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения, список литературы и приложение. Список литературы включает 130 источников, в том числе 66 отечественных и 64 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 8 таблицами, 3 диаграммами и 19 рисунками.
Полимеразная цепная реакция как один из методов генодиагностики
Генодиагностика - это относительно новый раздел диагностики, представляющий собой комплекс методов, которые позволяют обнаруживать гены или последовательности нуклеиновой кислоты, специфичные для определения вида возбудителя инфекционных, инвазионных заболеваний животных и человека.
Становление и совершенствование генодиагностики было возможно только на основе знаний о структур е наследственного аппарата любого живого организма. Начиная с 1953 г., когда Д. Уотсон и Ф. Крик опубликовали работу, посвященную структуре ДНК, стало ясно, что основной принцип, лежащий в основе всего живого - принцип комплементарности. С этих пор данный принцип стал широко и успешно использоваться для решения проблем, связанных с диагностикой заболеваний, вызываемых различными организмами.
До конца 80-х годов реакция гибридизации ДНК с ДНК была основой диагностики. Для проведения этой реакции необходимо было располагать клонированной последовательностью ДНК, которую использовали в качестве молекулярного зонда. Молекулярный зонд представляет собой фрагмент ДНК тестируемого организма, желательно кодирующего синтез одного из факторов патогенности. Использование молекулярного зондирования позволило в значительной степени изменить ряд представлений о диагностике инфекционных и инвазионных заболеваний (Бадакшеева А.Г., Кнорре Д.Г., 1991; Белохвостое А.С., 1995; Щербо С.Н., Макаров В.Б., 1998; Erlich Н.А., 1989). Было доказано, что тестирование факторов патогенности во многих случаях более информативно по сравнению с исследованием различных фенотипических свойств, которые далеко не всегда отражают корреляционные связи с вирулентностью исследуемого организма (Аксенов М.Ю., Гинцбург А.Л., 1993; Шагинян ИА., Гинцбург А.Л., 1995).
Однако метод генодиагностики, основанный на реакции гибридизации ДНК с ДНК, не отличается высокой чувствительностью и позволяет обнаруживать 10 -10 мишеней (это могут быть бактериальные клетки, вирусные частицы и тому подобное или очищенная нуклеиновая кислота) в пробе. В связи с этим данный подход является мало информативным при диагностике состояний при которых концентрация идентифицируемого организма ниже порога чувствительности метода.
Следующим шагом фундаментальной науки - молекулярной биологии гена - было создание способа исследования поистине революционизировавшего молекулярную генетику, медицинскую и ветеринарную диагностику, получившего название полимеразной цепной реакции (ПЦР) (рисунок 1).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была разработана американским биохимиком фирмы "Cetus" К. Mullis США в 1985 г. (Saiki R.K. et al., 1985; Mullis K.B., Faloona F.A., 1987). В 1993 г. К. Mullis был награжден за это открытие Нобелевской премией.
ПЦР - это метод амплификации in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить (амплифицировать) определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в 108 раз (Сайки Р. и др., 1990). Применение данного метода возможно только при знании полной нуклеотидной последовательности идентифицируемого организма или отдельных ее участков.
Современные модификации полимеразной цепной реакции
Новая технология горячего старта в полимеразной цепной реакции В последнее время широко используется такой простой прием, как новая технология "горячего старта" в полимеразной цепной реакции. Сущность которого заключается в предварительном прогревании реакционной смеси при температуре 95 С в течение 3-5 минут до добавления какого-либо существенного для реакции компонента (фермента Taq-полимеразы, MgCl2, праймеров, дезоксинуклеотидтрифосфатов или ДНК). Наиболее часто применяется добавление фермента Taq-полимеразы уже в прогретые реакционные пробирки. Такой прием предупреждает амплификацию неспецифических ДНК-фрагментов вследствие низкотемпературного, неспецифического спаривания праймеров (Вартапетян А.Б., 1991; Рыбалкин И.Н. и др., 1996; Федоров Н.А. и др., 1996; Дубинина И.Г. и др., 1997; Щербо С.Н., Макаров В.Б., 199 8; Гребенникова Т.В. и др., 1999). Другой способ реализации "горячего старта" заключается в использовании восковой перегородки, разделяющей компоненты реакционной смеси. При достижении 55 С происходит плавление воска и смешивание реагентов. К недостаткам обоих методов можно отнести необходимость неоднократного открывания реакционных пробирок, что повышает вероятность взаимного загрязнения образцов (Kwok S. et al., 1989).
И.Н. Рыбалкин с соавторами (1996) предложили для решения данной проблемы использовать моноклональные антитела, способные ингибировать активность термофильной полимеразы при температурах ниже 65С. При нагревании реакционной смеси до температуры выше 70 С антитела денатурируют, и полимеризующая активность фермента полностью восстанавливается. При этом происходит подавление амплификации неспецифических фрагментов ДНК и увеличение выхода специфического продукта. "Nested-PCR"
Дополнительные возможности повышения специфичности и чувствительности полимеразной цепной реакции позволяет "Nested-PCR", проводимая с использованием двух пар праймеров: "внешних" и "внутренних".
В данном случае вначале пара "внешних" праймеров запускает синтез первого ампликона, затем после нескольких циклов пара "внутренних" праймеров, комплементарная внутренним последовательностям первого ампликона, запускает синтез второго, меньшей длины (Куличенко А.Н. и др., 1996; Федоров Н.А. и др., 1996; Дубинина И.Г. и др., 1997; Щербо С.Н., Макаров В.Б., 1998; Гребенникова Т.В. и др., 1999).
Материалы и методы
Для разработки ПЦР тест-системы для идентификации возбудителя токсоплазмоза животных мы использовали культуру клеток Toxoplasma gondii . штамм RH, любезно предоставленную к.м.н. Л.И. Грачевой (НИИЭиМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН) в концентрации 2,3х107 кл/мл. Культура Toxoplasma gondii штамм RH была выделена в 1941 г. американским ученым A. Sabin из головного мозга ребенка, погибшего от энцефалита. В 1956 г. этот штамм был получен из Копенгагена и с этих пор поддерживается в лаборатории протозойных инфекций НИИЭиМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Штамм является высокопатогенным для людей и многих видов теплокровных ж ивотных. Токсоплазмы имеют форму полумесяца или долек апельсина, размеры их — 2-4 х 4-7 микрон.
Для разработки ПЦР тест-системы для идентификации возбудителя неоспороза животных мы использовали культуру клеток Neospora caninum штамм NC-1, любезно предоставленную д.б.н. В.Т. Заблоцким (ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко) в концентрации 1,3x107 кл/мл. Культура клеток Neospora caninum штамм NC-1 была выделена в 1988 г. американскими исследователями J.P. Dubey, A.L. Hattel, D.S. Lindsay, MJ. Tropper из головного мозга естественно зараженной неоспорозом собаки. Для проверки таксономической специфичности разрабатываемых ПЦР тест-систем использовали ДНК различных видов организмов, большая часть из которых получена из коллекции лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов НИИЭиМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН; культура клеток Sarcocystis sp. - любезно предоставлена д.б.н. М.Д. Новак (Костромская государственная сельскохозяйственная академия) (таблица 1). Нами были собраны сыворотки крови, из которых затем были выделены методом R. Boom et al. (1989) эукариотические ДНК человека и 10 видов животных: козы, кошки, кролика, крупного рогатого скота, лося, лошади, мыши, овцы, свиньи, собаки.
