Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы
2.1. Исторический обзор заболевания 10
2.2. Восприимчивость 15
2.3. Жизненный цикл 21
2.4. Патогенез 22
2.5. Исследование иммунитета 28
2.6. Серологические методы диагностики бабезиоза собак 35
3. Собственные исследования
3.1. Материалы и методы 37
3.2. Результаты исследования
3.2.1. Выбор штамма возбудителя и определение его видовой принадлежности 42
3.2.2. Определение условий, влияющих на степень переболевания и выраженность паразитемии у зараженных бабезиозом собак 46
3.2.3. Опыты с неспленэктомированными собаками 47
3.2.4. Опыт со спленэктомированными щенятами 49
3.2.5. Опыт с подсосными 3-4 недельными щенками 50
3.2.6. Способ приготовления антигена для РДСК 52
3.2.7. Способ приготовления позитивной и негативной сыворотки для РДСК
3.2.7.1. Способ приготовления позитивной и негативной сывороток от собак 54-56
3.2.7.2. Способ приготовления позитивной сыворотки от иммунизированных бабезийным антигеном кроликов 56-58
3.2.8. Сравнительное изучение активности нативных и высушенных антигенов, положительных и отрицательных сывороток в РДСК 59-65
3.2.9. Методика постановки РДСК 66-71
3.2.10. Динамика паразитемии и комплементсвязывающих антител у экспериментально зараженных бабезиозом собак 72 - 74
3.2.11. Результаты серологических исследований на бабезиоз собак из разных регионов России 74 - 81
4. Обсуждение 82 - 88
5. Выводы 88-89
6. Практические предложения 90
7. Список использованной литературы 91-107
8. Приложение 108-117
- Серологические методы диагностики бабезиоза собак
- Определение условий, влияющих на степень переболевания и выраженность паразитемии у зараженных бабезиозом собак
- Способ приготовления позитивной сыворотки от иммунизированных бабезийным антигеном кроликов
- Динамика паразитемии и комплементсвязывающих антител у экспериментально зараженных бабезиозом собак
Введение к работе
Бабезиоз - остро протекающее заболевание собак, вызванное паразитированием в эритроцитах животного простейших из отряда Piroplasmida, и сопровождающееся высокой температурой тела, угнетением, анемичностью и желтушности слизистых оболочек, гемоглобинурией, нарушением сердечной деятельности и нередко приводящим к летальному исходу.
В настоящее время трудно представить себе жизнь человека без общения с четвероногими.
Собака является слугой и другом, она преданный член семьи, компаньон в играх и помощник на охоте. Собака - помощник в повседневной жизни и спасатель в экстремальных ситуациях. Собака - символ статуса, престижа и моды. Собака служит в армии и милиции. О собаке говорят, что она создаёт комфорт и является близким товарищем. Собака - первое животное, одомашненное человеком, оно следует за ним по всему миру от Арктики до Антарктики. Приручив это животное, человек взял на себя обязанность заботы о его здоровье, охраны его от воздействия патогенных факторов.
Бабезиоз - грозное заболевание, именуемое также пироплазмоз, характеризуется трансмиссивностью, природной очаговостью и проявляется лихорадкой непостоянного типа, глубокой анемией, кахексией (Davis J.W., Anderson R.C. 1971;
Кровопаразитарные болезни животных. 1995; Jacobson L.S. et al.,1996).
В России переносчиками бабезиоза является клещ Dermacentor marginatus, а за рубежом отмечены клещи: Rhipicephalus sanguineus, Haemaphysalis Ieachi (Марков A.A. и др. 1935; Uilenberg G. et al., 1989; Hauschild S. et al., 1995). Многими исследователями отмечена трансовариальная передача клещами возбудителя бабезиоза, а если учитывать, что восприимчивыми животными к заражению B.canis являются и дикие плотоядные семейства собачьих (Canis) (Велю Г. 1930; Якимов В.Л. 1931; Button С, 1979), то они, следовательно, могут служить и природными резервуарами (Henning M.W., 1956). Заболевание обладает ярко выраженной весенней и осенней сезонностью (Sanders D.A., 1937; Matthewman L.A. et al., 1993; Zahler M. et al. 1998; Sanders D.A. et al., 2002). Срок носительства после переболевания отмечен более 130 дней (Botros В.A.M. et al., 1975; Yonamine H. et al., 1984).
. Заболевание широко распространено во всех регионах земного шара, чаще в тропической зоне (Марков А.А. и др, 1935; Uilenberg G. et al., 1989; Hauschild S. et al., 1995).
Несмотря на профилактическую обработку против клещей, смертность остается значительной. Это обусловлено отсутствием надежной диагностики при массовом обследовании животных и выявлении природных очагов.
Диагностика бабезиоза собак основана на учете эпизоотического состояния, сезона года, клинических признаков, патоморфологических изменений и результатов микроскопического исследования мазков крови. Решающими в диагнозе являются положительные результаты микроскопического исследования мазков крови. При окраске мазков крови по Романовскому-Гимза
Babesia canis может иметь различную форму: грушевидную, овальную, округлую, амебовидную, но в основном находят парногрушевидную форму паразита (Паразитология и инвазионные заболевания с/х животных., 1956; Протозойные болезни с/х животных., 1982; Паразитология и инвазионные заболевания животных., 1998; Балагула Т.В., 2000. Walter S. et al., 2002;). Все формы могут различно ассоциироваться в одном эритроците (Якимов В.Л., 1931).
Ограниченные возможности световой микроскопии сдерживают своевременное проведение лечебных и других мер борьбы с болезнью. Трудности в идентификации бабезий, и особенно при паразитоносительстве, вызвали необходимость изыскивать специфические и более эффективные средства диагностики, такие как серологические.
Для предотвращения распространения бабезиоза необходима современная диагностика заболевания.
Все вышеизложенное свидетельствует об актуальности исследований по серологической диагностике бабезиоза собак. 1.2. Цель и задачи исследования:
Учитывая необходимость своевременного выявления заболевания, основной целью работы явилось - усовершенствовать существующие методы диагностики, освоить и разработать производство новых, более чувствительных тест-систем.
Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:
- отработать оптимальные режимы для получения высокой паразитемии бабезий у неспленэктомированных и спленэктомированных щенят, щенят в подсосный период с целью использования высокоактивных антигенов в РДСК. установить периоды появления и исчезновения бабезийных антител у экспериментально зараженных щенят в РДСК.
- провести выборочное серологическое исследование на бабезиоз собак в разных городах России. 1.3. Научная новизна
Разработан метод приготовления высокоактивных антигенов для серологической диагностики бабезиоза собак, включающий получение высокой паразитемии у животных -доноров после спленэктомии.
Впервые доказана возможность экспериментального заражения бабезиозом щенят в подсосный период.
С помощью РДСК изучена динамика антителогенеза у экспериментально зараженных бабезиозом животных и уточнена эпизоотическая ситуация по бабезиозу собак в разных городах России.
1.4.Практическое значение работы
Предложена и разработана методика получения бабезийного антигена B.canis для серологических реакций РДСК.
Предложена комплексная схема получения позитивной и негативной сыворотки собак и её высушивания.
Предложена схема получения антигена B.canis от экспериментально зараженных интактных щенят, от спленэктомированных и потом зараженных, и от щенят в подсосный период.
По результатам проведенных исследований разработаны «Методические рекомендации по приготовлению и контролю антигенов из B.canis для РДСК», рассмотренные и утвержденные на заседании Ученого Совета ВИЭВ 10 августа 2004года.
1.5. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на:
• 11 Московском международном ветеринарном конгрессе 17-19 апреля 2003 г. Москва.
• «Современные достижения и проблемы клеточной биотехнологии и иммунологии в ветеринарной медицине». 15-16 мая 2003 г. Москва.
• Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 110-летию со дня рождения проф. А.А.Маркова. Москва 2002 г.
• Заседание ученого совета ВИЭВ, Москва, 2003.
• Межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ, Москва, 2005.
1.6. Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 6 работ в журналах «Ветеринарная медицина», «Ветеринарный консультант» и «Ветеринарная патология».
1.7. На защиту выносятся
1. Отработка оптимального режима получения высокой паразитемии бабезий у неспленэктомированных и спленэктомированных щенят, щенят в подсосный период с целью использования высокоактивных антигенов в РДСК.
2. Метод приготовления высокоактивных антигенов для серологической диагностики бабезиоза собак, включающий получение высокой паразитемии у животных - доноров после спленэктомии.
3. Материалы по заражению бабезиозом подсосных щенят.
4. Материалы по изучению периода появления и исчезновения комплементсвязывающих антител у экспериментально зараженных бабезиозом щенят.
5. получения Метод положительных сывороток крови от зараженных бабезиозом щенят и от паразитоносителей.
6. Метод получения положительной сыворотки от иммунизированных бабезийным антигеном кроликов.
7. Метод лиофилизации сывороток и антигенов. Материалы по их титрации.
8. Материалы по изучению динамики антителогенеза у экспериментально зараженных бабезиозом животных с помощью РДСК и уточнения эпизоотической ситуации по бабезиозу собак в разных городах Европейской части РФ.
9. Оптимизация режима постановки реакции длительного связывания комплемента для диагностики бабезиоза собак.
1.8. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 117 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Список использованной литературы включает 142 наименования, из них 102 иностранных автора. Работа иллюстрирована 19 таблицами, 5 рисунками. В приложении представлен документ, подтверждающий наиболее важный результат исследования и его практическую ценность.
Серологические методы диагностики бабезиоза собак
Метод световой микроскопии эффективен для постановки диагноза в большинстве случаев заболевания собак, но менее эффективен в исследовательских целях. Поэтому большинство исследователей склоняются к постановке серологических реакций. Основные серологические методы исследования это метод иммунофлюоресценции, ELISA и его модификации. Методом иммунофлюоресценции установили небольшую специфичность между B.canis и Ehrlichia canis (Matthewman L. A., et al. 1993). Исследования Yamane I. et al., (1993), показали малую специфичность метода непрямой иммунофлюоресценции. Они изучали перекрёстный иммунитет в ИФА, а так же оптимальный титр для B.gibsoni. Авторы исследования считают, что паразит B.gibsoni стимулирует продукцию антител, способных реагировать с различными частями или схожими антигенами других протозойных паразитов (ссылаясь на то, что подобный феномен был зарегистрирован в перекрестной реакции с Plasmodium sp.) (Yamane I.etal. 1972). Методом ИФА проводили исследования ученые из Израиля Baneth G. et al., (1998). Их исследования выявили, что 75% собак сероположительны к антигенам B.canis. Это они объясняют тем, что после субклинического переболевания собака остаётся носителем. Сыворотка крови собак так же реагировала и с антигенами B.gibsoni, хотя данный паразит не зарегистрирован на территории Израиля. Исследователи считают, что это связано с перекрёстной реакцией с антителами к B.canis (Baneth G. et al. 1998). Adachi K. et al., (1993), ставили ELISA на микропластинах
Все выше изложенное свидетельствует об активности исследований по серологической диагностике бабезиоза собак. Исследования по серологической диагностики кровопаразитарных болезней животных проводится в лаборатории протозоологии ВИЭВ с 1959 г. с помощью РСК, РДСК. Поэтому из вышеперечисленных методов нами выбрана РДСК. Настоящая работа выполнялась в 2001 - 2003 гг. в лаборатории протозоологии Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко. Опыты приготовления антигена, сывороток их лиофилизация и постановка РДСК проводились совместно с научным руководителем главным научным сотрудником Х.Георгиу. В опытах была использована 23 собака в возрасте от 3 недель до 4 месяцев (в 1-ом опыте использовали -3, во 2-ом - 17, и в 3-ом -3 собаки) и 11 кроликов 6-7 месячного возраста. Для заражения животных использовали штаммы Babesia canis из ветеринарных клиник города Москвы и Московской области. Для изучения эпизоотической ситуации по бабезиозу собак необходимый материал был доставлен из питомников различных областей РФ. Всего исследовали 56 проб сывороток крови собак. Исходным материалом для получения бабезиозного антигена послужила кровь от собак, больных бабезиозом с пораженностью эритроцитов от 20-35% и более. Заражение животных проводили подкожным введением крови от больных животных. Обычно паразитемия у собак сравнительно невысока: 10-15%. Кровь с подобной паразитемией не может использоваться в качестве исходного материала для приготовления антигена. В связи с этим для получения большей паразитемии мы использовали спленэктомированных животных. Были проведены три опыта с использованием 23 собак, 4 из которых были сначала спленэктомированы, а затем заражены. У остальных селезенка не была удалена. Спленэктомия собак проводилась согласно методическим указаниям, рекомендованным ГУВ МСХ СССР от 24 ноября 1975 года, учитывая видовую специфику подопытных животных. За сутки до операции собак мыли, вечернее кормление ограничивали. Утром в день операции животных не кормили, но поили вволю. Поле операции (сверху от остистых отростков поясничных позвонков до начала крестца, сзади — до маклока, спереди до третьего последнего ребра и вниз на 6... 10 см) тщательно выстригали. Затем мыли тёплой водой с мылом, подсушивали стерильной ватой или марлей и обрабатывали дважды 5...10% спиртовым раствором йода.
Определение условий, влияющих на степень переболевания и выраженность паразитемии у зараженных бабезиозом собак
Для получения иммунной сыворотки от кроликов и отработки методов серологических исследований животным вводили бабезиозный антиген. С целью выявления возможности использования таких серологических реакций как РДСК с сывороткой крови кроликов и получения иммунной сыворотки на антиген B.canis, было поставлено два опыта с использованием 11 кроликов. Животным вводили бабезиозный антиген. В опытах использовали кроликов 6-7 месячного возраста массой 2,5 - 3,0 кг. В первом опыте использовали 5 животных, которых разделили на две группы. В первой группе 3-м кроликам ввели внутримышечно антиген B.canis в рабочем разведении. Во второй группе два кролика служили контролем. Титр антител у кроликов первого опыта первой группы видны в табл. 6. Как видно из таблицы 6, титр антител был в пределах 1:20...1:80. Второй опыт ставили с целью уточнения полученных результатов первого опыта. Для этого использовали шесть кроликов, которых разделили на две группы. Одной группе ввели антиген, а вторая группа служила контролем, как и в первом опыте. Титр антител у кроликов второго опыта первой группы видны в табл. 7. Для изучения иммунологических реакций организма на введение бабезиозного антигена сыворотку их крови исследовали на наличие антител к бабезиям в реакции длительного связывания комплемента (РДСК). Таким образом, в сыворотках крови кроликов, которым вводили бабезиозный антиген, комплементсвязывающие антитела выявляли в Гом и 2 0М опытах в высоких титрах — от 1:20...1:80. Следовательно, в качестве отрицательных и положительных сывороток могут быть использованы в наборах для РДСК не только сыворотки крови собак, но и кроликов. С целью длительного сохранения, бабезийный антиген, а также необходимые для реакции сыворотки, высушивали.
Для этого серии антигенов, полученных от неспленэктомированных щенят, смешали в одном флаконе, создавая при этом одну серию. Тоже самое сделали и с остальными сериями полученных антигенов от спленэктомированных и подсосных щенят, получив при этом три серии антигенов. Далее серии антигенов титровали в РДСК (табл. 8). Перед лиофилизацией приготовленные серии бабезийного антигена смешивали с защитной средой в соотношении 1:1. Последняя состоит из равных частей 0,5%-го раствора карбоцил- метил-целлюлозы (КМЦ), (Н.И.Степанова, В.А.Горбатов, В.В.Петровский). Полученную смесь разливали стерильно в ампулы по 2 мл, позитивные и негативные сыворотки разливали также по 2 мл, но без защитной среды. В наших опытах использовали и защитную среду №3 ВГНКИ: 100 мл НгО, 8 г сахарозы и 2 г. желатины. В дальнейшем, для высушивания бабезийного антигена, к 100 мл антигена добавляли 50 мл среды №3. Полученную смесь разливали стерильно в ампулы по 2 мл, позитивные и негативные сыворотки также по 2 мл, но без защитной среды. Затем помещали в морозильную камеру с температурой минус 40-50С и выдерживали в ней не более двух часов. После этого материал переносили в сушильную камеру аппарата и включали вакуум-насос. Включение вакуум-насоса считают началом сушки. Продолжительность цикла сушки препарата в ампулах с фасовкой 2 мл не более 48 часов, причем сублимация должна быть в пределах 50-60% общего времени. Величина вакуума в период сублимации должна быть не более 0,3 мм. рт. ст. (13,3 Па).
Примерный режим сушки антигена в ампулах с фасовкой 2,0 мл: общая продолжительность сушки 32-40 часов, в том числе: продолжительность сушки при изменении температуры препарата Определение массовой доли влаги проводили по ГОСТу 24061-80. Она должна быть в пределах 1-3%. Вакуум в ампулах устанавливали аппаратом типа Д Арсонваль. Фиолетово-синее свечение в ампулах и характерное потрескивание указывают на наличие вакуума. Лиофилизированный антиген хранили в бытовом холодильнике (при +4С). После лиофилизации антиген разводили в 2 мл физиологического раствора и вновь титровали в сравнении с нативным (табл. 9). После высушивания, как видно из таблицы 9, антигены хотя и снижали титры вдвое против нативных, но сохранили свои достаточно высокие значения: 1-ая серия - 1: 16; 2-ая серия - 1: 64; 3-я серия - 1: 32. Защитные среды КМЦ + сахарозы и №3 ВГНКИ дали одинаковые результаты. Специфичность метода РДСК подтверждена при исследовании сыворотки крови собак, больных чумой, трипаносомозом и бруцеллезом табл. 10.
Способ приготовления позитивной сыворотки от иммунизированных бабезийным антигеном кроликов
Третий опыт поставили с целью изучения периода появления и исчезновения комплементсвязующих антител. Заражение животных проводили путем подкожного введения в область лопатки в дозе 0,5 мл цитратной крови от собаки с острой формой бабезиоза (паразитемия 3 - 5%). Начало выявления комплементсвязующих антител в среднем приходился на 10... 15 день после заражения (табл. 16). Затем уровень антител повышался, достигая максимума на 1:20...1:40 к 20...25 дню. После этого, наблюдалось постепенное снижение уровня антител, и к 35 дню заражения они выявлялись в среднем в разведении сыворотки 1:5 в 2+ и 3+ (срок наблюдения, табл. 16). Параллельно с исследованием сыворотки крови с целью выявления комплементсвязывающих антител проводилась также микроскопия периферических мазков крови.
По времени обнаружение паразитов не совпадало с появлением комплементсвязывающих антител. У собак бабезий в периферической крови стали появляться раньше, чем комплементсвязующие антитела. Более того, пик выработки комплементсвязующих антител наблюдался после угасания паразитемии и начала восстановления показателей крови (табл. 16). Динамика антителообразования изучалась у спленэктомированных щенков и у щенков, зараженных в подсосный период жизни. Комплементсвязывающие антитела не обнаружены ни у первой, ни у второй группы, несмотря на то, что уровень паразитемии у них был высокий (табл. 16). Как видно из таблицы 16, комплементсвязывающие антитела в основном выявлялись только у зараженных щенят. У спленэктомированных и у щенков в подсосный период комплементсвязывающие антитела не обнаруживали, несмотря на то, что паразитемия была в пределах 20...35%. Таким образом, проделанные нами опыты показали, что комплементсвязывающие антитела выявляли только у зараженных щенят на 10-15 сутки после заражения в титрах 1:5, в то время как в мазках периферической крови бабезии появлялись на пятый день после заражения. У спленэктомированных щенков и у щенков, зараженных в подсосный период жизни, комплементсвязывающие антитела не обнаружены ни у первой, ни у второй группы, несмотря на то, что уровень паразитемии был высоким в пределах 20 - 25%. Результаты серологических исследований на бабезиоз собак из разных регионов России Бабезиоз собак зарегистрирован на многих территориях РФ. Начиная с 2003года, с целью проверки бабезийного антигена, мы проводили серологические исследования по изучению эпизоотической ситуации на бабезиоз собак в разных регионах России.
Необходимый материал был доставлен из ветеринарных лечебниц и клиник различных районов и городов России. Результаты исследований сведены в таблицу 17. Из таблиц 17,18, 19 видно, что зараженность собак бабезиозом составляла в среднем 23,2% из 56 проб сывороток крови. По городам Российской Федерации: Москва - 9 (16,7%), Пермь - 2 (%), Воронеж- 1 (%), Калуга - 1(%). . Из таблицы 19 видно, что больше положительных собак выявили среди немецких овчарок (8 из 24), кавказских овчарок (2 из 6), и положительная проба выявлена у керри-блю-терьера. Таким образом, серологические исследования на бабезиоз собак из разных регионов России, показали, что бабезионосительство выявлялось в Москве, Перми, Воронеже, Калуге. Зараженность собак бабезиозом составила в среднем 23,2%из 56 проб сывороток крови. Больше положительных собак выявляли среди немецких и кавказских овчарок. 4.0БСУЖДЕНИЕ Проблема бабезиоза собак в последнее время приобретает все большее значение в связи с уточнением сведений об ареале этого заболевания. Сейчас уже нет сомнения относительно того, что бабезиоз собак распространен повсеместно. Учеными России и других стран мира проведены многочисленные исследования по изучению морфологии и природы возбудителя, источников и путей заражения собак, симптомокомплекса и патогенеза, совершенствованию методов диагностики и разработке средств терапии и профилактики. Несмотря на определенные достижения, проблема бабезиоза далека до своего разрешения по причине того, что практическая ветеринарная служба не располагает надежными диагностическими средствами.
Динамика паразитемии и комплементсвязывающих антител у экспериментально зараженных бабезиозом собак
Эти методы вызывают полный гемолиз эритроцитов, однако, для обеспечения полного гемолиза и одновременно сохранения стерильности исходного материала мы считаем наиболее удобным метод попеременного замораживания и оттаивания (Х.Георгиу, 1980). При микроскопии мазков крови, окрашенных по Романовскому-Гимза В. canis может иметь различную форму: грушевидную, овальную, округлую, амебовидную, но в основном находят парногрушевидную форму паразита (Паразитология и инвазионные заболевания с/х животных, 1956; Протозойные болезни с/х животных, 1982; Паразитология и инвазионные заболевания животных, 1998; Walter S. et al, 2002). Все формы могут ассоциироваться в одном эритроците (Якимов В.Л. 1931; Henning M.W. 1956; Farwell G.F. et al, 1982). Нередко в одном эритроците может находиться несколько паразитов. Вместе с тем участившиеся случаи нетипичного бабезиоза собак (Бондаренко М., 1998.), при которых показатель паразитемии ниже 1% и существует бабезионосительство, а также случаи заболевания, сопровождающиеся лептоспирозом, гепатитом, филяриозом, анкилостомозом (Button С, 1979; Бондаренко М., 1998), затрудняют диагностику этого заболевания. Именно эти трудности идентификации бабезий, особенно при паразитоносительстве, вызвали необходимость изыскать специфические и более эффективные средства диагностики (EwingS.A., 1965). Как известно, для приготовления бабезиозного антигена используют кровь от больного животного. На активность такого антигена большое влияние оказывает уровень пораженности эритроцитов крови донора бабезиями — чем выше паразитемия, тем активнее антиген. Это условно послужило обоснованием для отработки технологии получения паразитемии у зараженных бабезиозом собак. С учетом того, что селезёнка наряду с другими органами играет существенную роль в иммунологическом статусе организма животных, нами был применён метод спленэктомии. Для приготовления антигена из бабезий необходимо получить кровь с высокой паразитемией, для чего применялась спленэктомия животных.
У спленэктомированных собак паразитемия может достигать 40%(Adachi К., Makimura S., 1992), 22%(Davis J.W., Anderson R.C., 1971), 30%(Adachi K. et al., 1993). Учитывая литературные данные о. различной длительности инкубационного периода у зараженных бабезиозом собак в зависимости от дозы введенного возбудителя и способа заражения, мы обратили внимание на факторы, способствующие сокращению инкубационного периода и появления максимальной паразитемии. Для решения этого вопроса провели три опыта с использованием 23 щенка в возрасте от 3"х недель до 4"х месяцев, у четырех из которых в начале удалили селезёнку, а затем заразили бабезиозом. У остальных 19 щенков селезенка не была удалена. Опыты, проведенные на щенках, у .которых вначале удалили селезёнку, а затем заразили их бабезиями, показали, что уровень паразитемии у зараженных животных и сроки, в которые она достигает максимальной величины, находятся в прямой зависимости от дозы введённых бабезий. Установлено, если во втором опыте для щенят, которых заразили после спленэктомии, доза была 2 мл инвазированной крови (с паразитемией 19-20%), то максимальная паразитемия на уровне 25-50% была достигнута на 7 день. В том же опыте у четырех неспленэктомированных щенят, для которых заражающая доза была 2 мл. инвазированной крови (с паразитемией 3..5%), максимальная паразитемия на уровне 19-29% была достигнута на 6-8 день после заражения. У 9 интактных подсосных щенков, в том же втором опыте, у которых заражающая доза была 1,5 мл инвазированной крови при паразитемии 25-50%, максимальная паразитемия (10-15%) была достигнута на 3..4 день после заражения. Антигены с высокими титрами 1:32 ... 1:256 получили от спленэктомированных щенят, которым ввели инвазированную кровь при паразитемии 19-29% и от подсосных щенят которым ввели инвазированную кровь с паразитемией 25-50%. Активность бабезиозных антигенов, полученных из крови опытных щенят, находится в прямой зависимости от паразитемии у обескровленных животных. От щенят, которых обескровили с высокой паразитемией 25-50% получили антиген с титрами от 1:32 до 1:256.
