Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Токсоплазмоз кошек и собак 9
1.1.1. Характеристика возбудителя 9
1.1.2. Патогенез заболевания 14
1.1.3. Эпизоотология токсоплазмоза 16
1.1.4. Эпидемиология токсоплазмоза 19
1.1.5. Клинические признаки болезни и патологоанатомические изменения у кошек и собак 22
1.1.6. Иммунитет при токсоплазмозе 25
1.2. Лабораторная диагностика токсоплазмоза 26
1.2.1. Микроскопические исследования 28
1.2.2. Копрологические исследования 29
1.2.3. Выделение и культивирование токсоплазм 30
1.2.4. Индикация и идентификация антигенов токсоплазм 31
1.2.5. Генодиагностика токсоплазмоза 32
1.2.6. Аллергическая диагностика токсоплазмоза 33
1.2.7. Выявление противотоксоплазменных антител 34
1.3. Лечение и профилактика токсоплазмоза 40
2. Материалы и методы 45
2.1. Эпизоотологическое обследование 45
2.2. Опытные животные, сыворотки и патологический материал 46
2.3. Индикация возбудителя в клиническом материале 46
2.4. Серологические реакции 46
2.5. Культуры токсоплазм 49
2.6. Получение токсоплазменного антигена для ифа 49
2.7. Электрофоретический анализ полученного антигена 50
2.8. Иммунизация животных токсоплазменным антигеном 52
2.9. Изучение сероконверсии специфических антител у кошек 53
2.10. Полимеразная цепная реакция 54
2.11. Статистическая обработка результатов исследований 54
3. Результаты исследований 55
3.1. Клинико-эпизоотологические аспекты токсоплазмоза кошек и собак 55
3.2. Разработка иммуноферментнои тест-системы для выявления токсоплазменных антител 59
3.2.1. Подбор метода получения токсоплазменного антигена 59
3.2.2. Электрофоретические исследования токсоплазменного антигена 63
3.2.3. Конструирование иммуноферментнои тест-системы для выявления токсоплазменных антител 65
3.3. Сравнительное изучение эффективности рск и ифа для ретроспективной диагностики токсоплазмоза у домашних плотоядных 70
3.4. Серологический скрининг домашних плотоядных животных в отношении токсоплазменной инвазии 72
3.5. Изучение сероконверсии при иммунизации кошек токсоплазменным антигеном 74
3.6. Алгоритм исследования кошек на токсоплазмоз 76
4. Обсуждение результатов исследований 80
5. Выводы 94
6. Практические предложения 96
Список использованной литературы 98
Приложения 126
- Клинические признаки болезни и патологоанатомические изменения у кошек и собак
- Индикация и идентификация антигенов токсоплазм
- Опытные животные, сыворотки и патологический материал
- Разработка иммуноферментнои тест-системы для выявления токсоплазменных антител
Введение к работе
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Актуальность проблемы токсоплазмоза обусловлена практически повсеместным распространением возбудителя в природе, высокой частотой инфицированности и способностью токсоплазм длительно персистиро-вать в пораженных клетках, а также опасностью заражения людей от животных.
Окончательным хозяином токсоплазм является кошка и другие представители семейства кошачьих: рысь, пума, оцелот, ягуар, леопард и др. Промежуточными хозяевами могут быть почти все теплокровные животные, включая собак, а также человек (известно более 400 видов промежуточных хозяев токсоплазм).
Болезнь регистрируется во всех странах мира. Зараженность токсоплазмами кошек и собак, сельскохозяйственных животных и человека в той или иной степени выявлена в большинстве стран Европы, Америки, Африки и Азии. Установлено, что примерно у 25-30% населения земного шара выявляются антитела к токсоплазмам (есть регионы, где до 90% людей имеют такие антитела). Кошке среди других представителей семейства кошачьих принадлежит основная роль в распространении этой инвазии [9].
Значительный полиморфизм клинических проявлений при токсоплазмозе, разнообразный характер течения болезни и преобладание латентных форм инвазии над клинически выраженными практически исключают возможность постановки диагноза только на основании клинической картины, в связи с этим возрастает роль лабораторных исследований, включающих паразитологические и иммунологические методы [40].
Паразитологические исследования включают световую микроскопию и выделение паразита. Метод прямой микроскопии, хотя несложен и доступен, не всегда результативен, а выделение токсоплазм не пользуется широкой популярностью из-за большой трудоемкости и необходимости соблюдения режимных условий при работе с живым возбудителем. В подавляющем большинстве случаев при диагностике токсоплазмоза ориентируются на данные серологических исследований.
Наиболее популярными методами ретроспективной диагностики заболевания у людей являются реакция непрямой иммунофлуоресценции и иммунофер-ментный анализ. РНИФ и ИФА успешно сочетают в себе чувствительность, специфичность и простоту выполнения теста. В ветеринарной практике для этих целей до настоящего времени применяют реакцию связывания комплемента (РСК), которая по своим характеристикам значительно уступает двум первым методам.
Применение иммуноферментного метода ветеринарными специалистами во многом сдерживается отсутствием в достаточном количестве необходимых компонентов (тест-систем и оборудования), но, учитывая его диагностическую важность, можно уверенно утверждать, что в перспективе ИФА станет достоянием ветеринарных лабораторий при диагностике инфекционных и инвазионных болезней.
В доступной литературе встречаются сообщения об использовании ИФА для диагностики токсоплазмозов у животных [188, 192, 213, 228, 239]. Несмотря на это, вопросы серологической диагностики токсоплазмоза у кошек и собак до настоящего времени остаются открытыми.
Цель и задачи исследований. Цель исследований - усовершенствовать средства диагностики токсоплазмоза у мелких домашних животных (кошек и собак).
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
- провести комплекс исследований по выяснению этиологической роли токсоплазм при различной патологии у мелких домашних животных;
- разработать токсоплазменный антиген для иммунологических реакций и изучить его свойства;
- сконструировать тест-систему для ретроспективной диагностики токсоплазмоза у кошек и собак иммуноферментным методом;
- доказать преимущества разработанной тест-системы для индикации специфических антител по сравнению с общепринятыми;
- изучить сероконверсию токсоплазменных антител у иммунизированных кошек.
Научная новизна. Впервые сконструирована и апробирована в лабораторных и производственных условиях иммуноферментная тест-система для индикации в сыворотках крови кошек и собак противотоксоплазменных антител.
Разработана новая технология получения токсоплазменного антигена для иммунологических реакций.
С использованием разработанного набора диагностикумов проведен серологический скрининг спонтанно зараженных токсоплазмами мелких домашних животных.
Практическая ценность. Разработана тест-система ИФА для ретроспективной диагностики токсоплазмоза у кошек и собак.
Результаты проведенных исследований вошли в следующие разработанные и внедренные в практику нормативно-технические документы:
- во "Временную инструкцию по изготовлению и контролю иммунофермент-ной тест-системы для выявления токсоплазменных антител у кошек и собак", утвержденную ректором ФГОУ ВПО КГАВМ 3 декабря 2004 г.;
- в "Технические условия на опытную партию иммуноферментных тест-систем для выявления токсоплазменных антител у кошек и собак", утвержденные ректором ФГОУ ВПО КГАВМ 3 декабря 2004 г.;
- во "Временное наставление по применению иммуноферментной тест-системы для выявления токсоплазменных антител у кошек и собак", утвержденное начальником ГУВ Кабмина РТ 3 декабря 2004 г.;
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:
- Ежегодных итоговых заседаниях проблемных советов ФГОУ ВПО "Казанская академия ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана" (2002-05 гг.).
- Научно-практических конференциях по проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань, 2002,2004-06 гг.).
- Научно-практической конференции "Актуальные вопросы ветеринарной медицины домашних животных" (Екатеринбург, 2003 г.).
- XI, XIII и XIV Международных ветеринарных конгрессах (Москва, 2003, 2005-06 гг.).
- Конференции молодых ученых и специалистов (Казань, 2004 г.).
- V Всероссийской научно-практической конференции "Ветеринарная медицина: современные проблемы и преспективы развития" (Саратов, 2005 г.)
- Международном симпозиуме "Научые основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний" (Казань, 2005 г.).
Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ. Разработаны нормативно-технические документы на набор биопрепаратов: наставление по применению, инструкция по изготовлению и контролю, технические условия.
Основные положения диссертации, выдвигаемые для защиты;
- значительная встречаемость подозрительных по заболеванию токсоплазмозом кошек и собак в практике городских ветеринарных клиник;
- эффективность иммуноферментого анализа по сравнению с общепринятыми методами ретроспективной диагностики токсоплазмоза;
- возможность использования ПЦР для идентификации токсоплазм;
- высокая позитивность поголовья кошек и собак в отношении токсоплазмен-ной инвазии при серологическом скрининге.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований (5 глав), обсуждение результатов исследования, выводы, практические предложения и указатель литературы (всего 271 источник, в том числе 198 иностранных и 6 ссылок на сайты Internet). Диссертация иллюстрирована 8 таблицами и 8 рисунками. Прилагаются разработанные нормативно-технические и другие документы, подтверждающие результаты исследований, их научно-практическую ценность.
Клинические признаки болезни и патологоанатомические изменения у кошек и собак
Большинство животных не проявляют клинических симптомов заражения токсоплазмозом. Однако иногда болезнь проявляется клинически. Клинические проявления при токсоплазмозе обусловлены видом и возрастом животных, дозой, стадией и локализацией паразита. Более подвержены заболеванию котята, щенки и старые животные. Клинически выраженный токсоплазмоз чаще регистрируется у кошек, чем у собак.
Клинические проявления заболевания у кошек и собак в основном сходны. Вялость, потеря аппетита и лихорадка являются типичными ранними неспецифичными симптомами. Другие симптомы обусловлены локализацией размножающихся паразитов и степенью поражения инвазированных органов, тканей [9, 217, 252].
В результате воздействия паразита на ткани формируются очаги некроза и воспаления. Если интенсивность инвазии высокая и экстенсивность поражения значительна, у животного наблюдают клинические проявления [129].
Наиболее подвержены воздействию токсоплазм органы зрения и центральная нервная система. При этом основными симптомами могут быть - вое паление роговицы и передней камеры глаза, ненормальный размер зрачка и реакция на свет, слепота, коньюнктивит, панофтальмит, нарушение координации, повышение внутричерепного давления, гидроцефалия, трудность в жевании и глотании пищи. Завершается болезнь парезами и параличами конечностей (реже шеи). Парезы сопровождаются расслаблением сфинктеров прямой кишки и мочеиспускательного канала (непроизвольное выделение фекалий и мочи). Гибель животного происходит через 10-15 дней при наличии параличей конечностей [9, 217].
При гепатитах токсоплазменной природы регистрируются рвота, диарея и желтуха. Так же при этой патологии происходит увеличение лимфатических узлов, появляется панкреатит, может развиться клиника сепсиса. У котят и щенков вскоре после рождения могут развиться: острая пневмония; гепатит и холангит; энтероколит; миокардит; энцефаломиелит; миозит; иридоциклит; хориоретинит; увеит [9, 203,214,247].
У большинства собак выявляют только циркулирующие антитела против токсоплазм [158]. Клинически токсоплазмоз проявляется у новорожденных щенков и собак в возрасте до 1 года, инфицированных вирусом чумы. Кроме того, у собак токсоплазмоз может протекать и в генерализованной форме, напоминающей чуму с типичными для нее патологическими изменениями во внутренних органах и ЦНС, или же отмечают нервную форму, аналогичную таковой при чуме. Поражения легких и ЖКТ также вызывают симптоматику, наблюдаемую при чуме [214].
Хроническое течение болезни, регистрируемое у старых собак, длится несколько месяцев [10]. У животных отмечают перемежающуюся лихорадку, ано-рексию, депрессию, нарушение пищеварения, дерматиты в области головы, бедер, задних конечностей, исхудание. Поражения нервной системы проявляются повышенной агрессивностью и возбудимостью, судорогами, параличами, парезами задних конечностей. Суки, заразившиеся в период беременности, абортируют или приносят недоразвитый, нежизнеспособный приплод. При вскрытии животных, павших от токсоплазмоза, отсутствуют характерные только для этого заболевания изменения.
При остром течении болезни отмечаются воспаление и отек легких, увеличение печени, селезенки и лимфатических узлов, на разрезе - очажки некроза и кровоизлияния. При подостром и хроническом течении болезни наблюдаются фокусные очаги некроза, особенно подкожных лимфатических узлов, лимфаденит, гидроторакс, асцит, язвенный и фибринозный энтерит. У щенков на 3-5 сутки после заражения токсоплазмозом, при остром течении болезни обнаруживали увеличение региональных и мезентериальных, на 10-15 сутки - всех лимфатических узлов. Они были сочны на разрезе, имели очажки некроза, величиной с просяное зерно.
Печень, как правило, увеличена, окрашена неравномерно (чередуются темно-красные и желто-коричневые тона). С поверхности и на разрезе органа обнаруживают бледно-серые, хорошо очерченые некротические очажки размером от булавочной головки до просяного зерна или мелкой горошины. Слизистая оболочка двенадцатиперстной кишки набухшая, темно-красного цвета. Сердечная мышца дряблая, легкие - в состоянии застойной гиперемии и отека. Головной мозг незначительно гиперемирован, оболочки мозга отечны.
При хроническом экспериментальном токсоплазмозе макроскопические изменения отмечают в легких, селезенке, кишечнике, головном мозге и лимфоузлах [9].
Гистологические исследования показали присутствие тахизоитов в пери-тонеальных жидкостях животных, сразу после смерти. При проведении имму-ногистохимических исследований установили присутствие токсоплазм во всех органах кроме яичек. Печень была наиболее интенсивно инвазирована. Вакуоли паразитов присутствуют в цитоплазме гепатоцитов и поражают их ядро. Было также обнаружено присутствие делящихся паразитов в селезенке, легком, ки шечнике, мозге и почках, хотя интенсивность паразитизма была более низкая в этих органах по сравнению со степенью паразитизма в печени [129].
Индикация и идентификация антигенов токсоплазм
Для индикации и идентификации токсоплазм предложены современные иммунохимические и молекулярно-генетические методы, такие как: иммуно-ферментный анализ, иммуноблотинг, гибридомные технологии, полимеразная цепная реакция и др. Перечисленные методы обладают высокой чувствительностью, специфичностью, воспроизводимостью, возможностью одновременно исследовать большое число проб, простотой постановки и учета результатов, способностью выявлять межвидовые и межштаммовые различия токсоплазм. Обнаружение антигена токсоплазм проводят твердофазным иммунофер-ментным анализом авидин-биотина [192]. Использование иммуноблота показало высокую чувствительность метода при выявлении токсоплазменного антигена [141, 192, 213, 235, 239]. При этом для статистической обработки результатов исследований было использовано компьютерная программа StatXact Typbo (Ver. 2.11, Cytel Company, США) [192]. У мышей инвазированных штаммом Ме49 Т. gondii через две недели после алиментарного заражения методом иммуноблота в сыворотках крови обнаруживали антитела, которые реагировали с антигенами, имеющими молекулярную массу 34 kD. В этот период в мозгу мышей были найдены цисты. Через 3 недели после заражения были обнаружены антитела, реагирующие с пептидами молекулярной массой 22,23, 28, 34 и 50 kD. Через 4 недели сыворотки реагировали почти со всеми электрофоретическими фракциями антигена токсоплазм [122]. Чтобы установить профиль антигенности белка Т. gondii попавшего в организм алиментарным путем было изучено образование антител на антигенные детерминанты паразита после заглатывания пораженной цистами тканей. На 2-ю неделю был обнаружен антиген с молекулярной массой 34 kD. Затем появлялся антиген с молекулярной массой 30 kD (SAG 1-антиген) [79]. С 3-ей недели появлялся антиген с молекулярной массой 22 kD (SAG2-aHTHreH) [102, 213]. В последние годы достаточно широкое распространение для генетической диагностики токсоплазмоза в практике медицинских лабораторий получил метод полимеразной цепной реакции (ГЩР), суть которого состоит в обнаружении в исследуемом субстрате генетического материала (ДНК, РНК) инфекционных агентов. Его преимуществами являются высокая чувствительность и специфичность. Многие исследователи использовали технику ПЦР для диагностики токсоплазмоза [28, 34, 56, 68, 77, 83, 88, 99, 123, 124, 125, 127, 140, 142, 143, 146, 152, 162,165,166,176,177,179, 189,192, 210,216, 225, 234]. Обнаружение гена постановкой полимеразной цепной реакцией (ПЦР) особенно полезно для обнаружения Т. gondii в жидкостях организма, крови, и тканях подозрительных в заболевании пациентов [34, 55,125,192, 216].
Однако исследования показали, что среди больных, которым различными методами был поставлен диагноз на токсоплазмоз, в ПЦР положительно реагировали только 35-70% [152]. Более того, даже в условиях сертифицированных лабораторий в 26,6% случаев наблюдаются ложно-положительные результаты ПЦР [99, 216]. Таким образом, метод ПЦР, наряду с положительными чертами (обнаруживается минимальное количество искомого агента), имеет и недостатки, ограничивающие его применение [68]. Для постановки данной реакции необходимо наличие специального дорогостоящего оборудования, а также высокие требования к соблюдению технологии постановки и учета реакций. Поэтому в России метод определения токсоплазм в ПЦР пока не нашел распространения в ветеринарии. Для диагностики токсоплазмоза у человека была предложена внутрикож-ная аллергическая проба. Проба ставится с токсоплазменным аллергеном (токсоплазмином) по типу реакции Манту. Кожную реакцию (покраснение, инфильтрация) учитывают через 24-48 часов. У лиц, чувствительных к токсоплазмину, на месте введения аллергена возникает эритема, которая в ясно положительных случаях бывает интенсивно красной, округлой или овальной, чаще ограниченной. Измеряют продольный и поперечный диаметр покраснения и инфильтрата. Реакцию считают положительной, если через 24 часа после иньекции диаметр участка покраснения и инфильтрата кожи имеет не менее 10 мм и через 48 часов не уменьшается и не исчезает. Как правило, реакция ограничивается чисто местным характером, но у некоторых лиц, чувствительных к токсоплазмину, может быть реакция со стороны организма в целом (небольшое повышение температуры, слабость, головная боль). При положительных реакциях изменения на коже держаться 3-5 дней, затем бесследно исчезают. В сомнительных случаях эритема розоватого цвета. Реакция считается отрицательной, когда на месте введения аллергена нет никаких изменений.
Когда реакция очень слабая, диаметр участка покраснения и инфильтрата менее 10 мм. Суть аллергического метода состоит в развитии местной воспалительной реакции после внутрикожного введения набора антигенов токсоплазм у тех людей, у которых в организме есть клон специфических лимфоцитов (то есть, у инфицированных). В настоящее время проба (в нескольких модификациях) используется: - для окончательного решения вопроса о наличии заражения (отрицательные результаты пробы и отсутствие антител надежно исключают токсоплазмоз). - для определения показаний к проведению иммунокоррекции больным манифестной формой токсоплазмоза. - для определения "стартовой дозы" при проведении иммунокоррекции [7, 271].
Опытные животные, сыворотки и патологический материал
В серологических тестах испытывали сыворотки подопытных и подозрительных по заболеванию кошек и собак, а также различные варианты антигенов, которые были получены при конструировании иммуноферментной тест-системы для диагностики токсоплазмоза у кошек и собак. В процессе экспериментальных исследований использовали РСК и ИФА. РСК выполняли согласно "Наставлению по применению набора для диагностики токсоплазмоза животных", утвержденному Департаментом ветеринарии 04.12.97 г., с использованием стандартного набора диагностикумов, изготовленных на Омской биофабрике. ИФА ставили на полистероловых планшетах, изготовленных на ПО ВНРШ медицинской техники (г. Москва).
В качестве конъюгата использовали белок А, меченный пероксидазой хрена, который получали из НИИЭМ им. Пастера МЗ РФ (г. С-Петербург). ИФА выполняли по непрямому методу: - планшет или необходимое количество стрипов разборного планшета (сорбированных токсоплазменным антигеном) один раз промывали раствором ФСР-Т; - контрольные и исследуемые образцы разводили в растворе для разведения сывороток 1:100 и вносили по 100 мкл в лунку (контрольные образцы вносили каждый в 2 лунки); - в одну лунку не вносили ни контрольные, ни исследуемые сыворотки (контроль конъюгата); - планшет или стрипы разборного планшета помещали во влажную камеру и инкубировали 40 минут при 37С; - лунки 5 раз промывали раствором ФСР-Т, остатки содержимого лунок удаляли легким постукиванием по 4-5 слоям фильтровальной бумаги; - в каждую лунку планшета или стрипа разборного планшета вносили по 100 мкл рабочего раствора конъюгата, после чего планшет или стрипы помещали во влажную камеру и инкубировали 30 минут при температуре 37 С; - лунки 5 раз промывали раствором ФСР-Т, остатки содержимого лунок удаляли легким постукиванием по 4-5 слоям фильтровальной бумаги; - в каждую лунку планшета или стрипа вносили по 100 мкл субстратного раствора и инкубировали при комнатной температуре в темном месте в течение 15 минут; - реакцию останавливали добавлением в лунки по 50 мкл стоп-реагента и проводили учет результатов ИФА.
При постановке реакции ставили следующие контроли: - положительный контроль - исследование сыворотки, заведомо содержащий токсоплазменные антитела (по одной лунке для каждого вида животных); - отрицательный контроль - исследование заведомо негативной сыворотки (по две лунки для каждого вида животных); - контроль конъюгата (одна лунка). Результаты ИФА регистрировали с помощью спектрофотометра Multiskan, измеряя оптическую плотность (ОП) смеси реагентов в лунках при длине волны 450 нм. «0» (бланк) устанавливали по воздуху. Результат подлежал учету, если среднее значение ОП отрицательных контролей (ОП ср. К-) не превышало 0,2 оптические единицы (о.е.), а среднее значение ОП положительных контролей (ОП ср. К+) составляло не менее 0,8 о.е. Положительными считали образцы исследуемых сывороток, ОП которых превышала критическое значение ОП (ОП крит.), которое рассчитывали по формуле: ОП крит.= ОП ср. К- + 0,2. Результаты ИФА регистрировали визуально по интенсивности окрашивания цветной реакции ферментзависимой метки с субстратом. Положительными считали образцы, интенсивность окрашивания которых в лунках с исследуемой сывороткой отчетливо отличалась от таковой в отрицательном контроле. Интенсивность окрашивания положительного контроля при этом должна была быть достаточно выраженной. В качестве исходного материала при изготовлении токсоплазменного антигена и получении иммунных токсоплазменных сывороток использовали культуры токсоплазм рода Т. gondii. Культуры производственных штаммов токсоплазм поступали инактиви-рованными, в лиофилизированном состоянии и хранились в холодильнике при температуре 4 С.
Разработка иммуноферментнои тест-системы для выявления токсоплазменных антител
Целый ряд преимуществ иммуноферментного анализа (высокая чувствительность и специфичность, воспроизводимость результатов, экспрессность, возможность исследования одновременно большого числа проб, простота постановки и учета реакции) обуславливают то, что указанные тест-системы весьма перспективны и в последнее время широко внедряются в практику ветеринарных лабораторий для диагностики инфекционных и инвазионных заболеваний животных. При выполнении твердофазного варианта ИФА по выявлению антител ключевым моментом, предшествующим самой реакции, является подготовка антигена. Именно его качеством определяется чувствительность и специфичность конкретной тест-системы. В реакции могут быть использованы как корпускулярные, так и некорпускулярные антигены. По литературным данным известно, что корпускулярные антигены весьма неэффективны для иммуноферментной индикации токсоплазменных антител, поэтому мы заранее отказались от их испытания в нашей работе. Для сравнения в ИФА нами были получены и испытаны лизатные антигены токсоплазм. В качестве детергентов использовали: 0,1%-ный додецилсуль-фат натрия, 1%-ный дезоксихолат натрия, 1%-ный твин-80 и 1%-ный тритон-Х100. Исходным материалом при изготовлении антигена служили лиофилизи-рованные инактивированные культуры токсоплазм вида Т. gondii. Суспензию токсоплазм предварительно обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе (УЗДН-А) на среднем режиме интенсивности озвучивания в течение 1 минуты. Обработанную ультразвуком суспензию "осветляли" на центрифуге ОС-6 М, в угловом роторе в течение 20 минут при 5000 об/минуту.
Затем суспензии обрабатывали указанными выше детергентами и ультразвуком в различных сочетаниях. Всего было испытано 5 вариантов обработки антигена токсоплазм. От детергентов и обломков клеток освобождались 3-х кратным переосаждением суспензии насыщенным раствором сульфата аммония. Надосадок, содержащий антиген токсоплазм, служил исходным материалом для дальнейших процедур очистки, которую проводили путем ультрацентрифугирования при lOOOOOg в течение 6,5 часов в градиенте плотности сахарозы 5-55% (w/v) с шагом 5%. Было получено по 11 фракций каждого варианта обработки токсоплазменной биомассы, из которых были изготовлены антигены для испытания в ИФА с положительными и отрицательными сыворотками кошек и собак. Результаты этих исследований представлены на рисунках 2 и 3. Анализ представленных данных свидетельствует, что наиболее специфичным является антиген, полученный из фракции собранной в 35%-ной сахарозе ступенчатого градиента, после центрифугирования суспензии токсоплазм, которая подвергалась обработке ультразвуком и 1%-ным дезоксихолатом натрия. Коэффициент его специфичности при концентрации антигена 6 мкг/мл при исследовании сывороток кошек составил 10,6, собак - 11,8. Полученный специфический токсоплазменный антиген не реагировал с геторологичными сыворотками, содержащими антитела против эхинококка, токсокар, лямблий, хламидий, микоплазм и вирусов чумы плотоядных. Конструирование иммуноферментной тест-системы включало несколько этапов: - подбор режима "посадки" антигена на полистироловую основу; - получение контрольных положительных и отрицательных сывороток; - титрование конъюгата; - подбор регламента проведения реакции; - определение критериев оценки результатов тестирования, - определение срока годности тест-системы.
В опытах были использованы: - специфический антиген, изготовленный из культуры токсоплазм по разработанной нами технологии; - токсоплазменные иммунные сыворотки, полученные от кошек и собак; - отрицательные сыворотки, полученные от кошек и собак; - белок А, меченный пероксидазой хрена (НИИЭМ МЗ РФ, С-Петербург). За основу был взят непрямой метод постановки ИФА - наиболее перспективный при разработке тест-систем для выявления антител. При определении оптимальной концентрации белка в антигене в модельных опытах были испытаны концентрации антигена от 1 до 12 мкг/мл (таблица 3). Данные таблицы свидетельствуют, что наименьшая концентрация белка в антигене, при которой удается достичь наивысшей специфичности тест-системы, составляет 6 мкг/мл. Контрольные токсоплазменные сыворотки получали на клинически здоровых серонегативных беспородных собаках и кошках в стационаре кафедры патологии мелких животных и оперативной хирургии ФГОУ ВПО КГАВМ. Для этого у подобранных животных брали кровь и исследовали ее в РСК с токсо-плазменным антигеном.
Похожие диссертации на Совершенствование ретроспективной диагностики токсоплазмоза кошек и собак
