Содержание к диссертации
Введение
2 Обзор литературы 9
2.1. Жизненный цикл токсоплазм и их эпизоотическая опасность для сельскохозяйственных животных 9
2.2 Эпизоотологический и серологический мониторинг токсоплазмоза кошек 20
2.3 Семиотика токсоплазмоза кошек 26
2.4 Диагностика токсоплазмоза 28
2.4.1 Серологическая диагностика 28
2.4.2. Паразитологическая диагностика токсоплазмоза 31
2.4.3. Прямое микроскопирование 32
2.4.4 Выделение токсоплазм методом биопробы 33
2.4.5 Паразитологический дифференциальный диагноз 34
2.4.6 Полимеразная цепная реакция 36
2.4.7 Реакция флуоресцирующих антител 40
2.5 Ферментная система: гиалуроновая кислота - гиалуронидаза . 43
2.6 Лечение животных при токсоплазмозе. 47
2.7 Заключение 51
3. Собственные исследования 53
3.1 Материалы иметоды исследования, 53
штаммы возбудителей. 53
3.2 Результаты собственных исследований 63
3.2.1 Клннико-эпизоотологический мониторинг токсоплазмоза кошек 63
3.2.2.Жизненный цикл токсоплазм 64
3.2,3 Сравнительное изучение штаммов «RH», «3» 74
3.2.4 Устойчивость и восприимчивость лабораторных животных к различным дозам токсоплазм 76
3.2.5 Изучение инвазивных свойств ооцист токсоплазм 78
3.2.6. Эпизоотическая опасность ооцист токсоплазм для животных80
3.2.7. Экспериментальный токсоплазмоз кошек 82
3.2.8.Сравнительное изучение реакции флуоресцирующих антител, полимеразной цепной реакции и копрологического метода исследования на токсоплазмоз 89
3.2.9 Опыт по химиотерапии и химиопрофнлактике кошек при токсоплазмозе 90
3.2.10 Изучение токсических свойств химкокцида 92
3.2.11 Кумулятивные свойства химкокцида 96
Обсуждение 99
Выводы 105
Рекомендации по использованию научных выводов.. 107
Литература 109
Приложение 129
- Эпизоотологический и серологический мониторинг токсоплазмоза кошек
- Ферментная система: гиалуроновая кислота - гиалуронидаза
- Клннико-эпизоотологический мониторинг токсоплазмоза кошек
- Изучение токсических свойств химкокцида
Введение к работе
Актуальность проблемы. ФАО и ВОЗ рассматривают токсоплазмоз как важную проблему медицины и ветеринарии. Убиквитарное распространение токсоплазм за счёт наличия 3-х форм развития (эндозоиты, цистозоиты, ооцисты), их устойчивость к неблагоприятным условиям среды, отсутствие у них хозяинной специфичности, инвазивность всех стадий жизненного цикла, колосальная репродуктивная способность и многообразие путей заражения делает указанных простейших опасными для животных и человека. Это подтверждается таким фактом, что около 350 видов позвоночных являются промежуточными хозяевами указанных паразитов (Т.В.Бейер,1989). Следует также учесть, что токсоплазмы наряду с угрозой здоровья животному имеют и определённое социальное значение, поскольку миллионы кошек, особенно в крупных городах, находясь в непосредственной близости к человеку, представляют угрозу для здоровья населения, особенно детей.
В условиях антропургических очагов большое значение в качестве источников токсоплазм имеет домашняя кошка, которая является окончательным хозяином этих паразитов (W.Hutchison, 1965, 1967; L.Jacobs, 1967; J.Dubey 1968,1970; H.Scheffild, 1970; MMelton, 1969; ИГ.Галузо, 1970 и.т.д.) В частности сообщается, что кошка съевшая одну инвазированную мышь, выделяет с фекалиями до 20 млн. ооцист токсоплазм за одну дефекацию (W. Tadrds, J. Laarman, 1982), Хотя количество таких кошек в естественных условиях невелико и обычно составляет в среднем \% (J.Dubey et al., 1977)
В естественных условиях число реагирующих на токсоплазмоз кошек в иммунологичеких исследованиях в различных странах неодинаково от 1 до 96% (J.Dubey, 1968, 1973,1976, V.Svobodova et al., 1998, В.Ф.Новинская, 1966 и др.), что объясняется существованием в
5 природе штаммов неодинаковой вирулентности (Б.А.Тимофеев, 1975;
И.И.Вершинин, 1996 и др.)
Следует учесть, что некоторые штаммы, указанных паразитов, циркулируют в природе, минуя своего окончательного хозяина, то есть существуют без прохождения кишечной фазы развития, подтверждая свою факультативную гетерогенность (И.Г.Галузо и др., 1970, 1971, И.И.Вершинин, 1996).
Рассматривая симптоматику токсоплазмоза у кошек необходимо отметить её разнообразие: общее истощение, истечения из носа и глаз, слабость, депрессия, лихорадка, диарея, различные нервные расстройства и патологию органов зрения (В.Ф.Новинская, 1966; M.Petrac, J.Carpentner, 1965, M.Lappin et al., 1993, M.Chavkin et al., 1994 и др.), хотя существуют другие взгляды - бессимптомное носительство является обычным явлением у кошек (T.Hagivara et al., 1981, J.Dubey, 1988)
Касаясь последнего, необходимо отметить наличие ряда работ по установлению в глазной жидкости токсоплазменных IgG и IgM, выраженных хориоретинитов, увеитов (M.Chavkin et al, 1994, D.Burney et al. 1998) К сожалению, в литературе очень мало сведений по особенностям этой инвазии у кошек в условиях крупного мегаполиса, хотя паразитарные болезни собак и кошек в мегаполисе города Москвы занимают 4-5 место среди других патологий (М.В.Розовенко, 2002),
Как известно, для диагностики токсоплазмоза животных широко используются серологические методы: реакция связывания комплемента, флюресцирующих антител и другие способы диагностики, например копрологические, а в последнее время - полимеразная цепная реакция (Э.А.Кузнецова, 2001). Однако, их практическая ценность не равнозначна, поэтому до установления связи патологии, наблюдаемой у животных, и положительно реагирующих на токсоплазмоз, необходимо иметь высокочувствительный и простой по технике исполнения метод, который в одинаковой степени был бы приемлем и для практических ветеринарных
лабораторий. Очень скудными являются сведения по лечению животных, больных токсоплазмозом, хотя описывается применение с положительным результатом химкокцида и байкокса (А.Н.Крылов, 1982; Е.М.Кузовкин, 2000, O.Hanssn, 1996 и др.). Однако токсические свойства химкокцида и его эффективность при токсоплазмозе кошек в полной мере не изучены.
Таким образом, изучение эпизоотической ситуации, диагностики, терапии и профилактики токсоплазмоза кошек в условиях крупного мегаполиса Москвы и Московской области, а также разработка мер борьбы с токсоплазмозом является актуальной проблемой.
Цель исследования. В связи с изложенным, целью наших исследований было изучить эпизоотическую ситуацию, некоторые вопросы иммунитета, диагностики, терапии и профилактики токсоплазмоза плотоядных в г. Москве и Московской области.
Для выполнения поставленной цели нашими задачами было:
изучить пути распространения токсоплазмоза кошек в условиях мегаполиса на примере г. Москвы и Московской области;
провести сравнительное изучение жизненных циклов 2-х штаммов токсоплазм - высоковирулентного «RH» и слабовирулентного «3» и их факторов патогенности;
провести сравнительное изучение следующих методов диагностики токсоплазмоза: РСК (реакция связывания комплимента), РФА (реакция флюресцирующих антител), ПЦР (полимеразная цепная реакция), копрологический метод исследования;
изучить семиотику экспериментального токсоплазмоза кошек и пути заражения указанной инвазией;
изучить токсические и лечебные свойства химкокцида при токсоплазмозе кошек;
усовершенствовать меры борьбы с токсоплазмозом кошек в условиях мегаполиса.
7 Научная новизна работы. Изучена роль и место токсоплазмоза в
формировании инвазионной патологии у плотоядных; степень
контаминации внешней среды токсоплазмами; уточнена трансмиссия
инвазии в современных условиях г. Москвы и Московской области.
Установлены различия жизненных циклов токсоплазм, их вирулентность, а
также изучены токсические и лечебные свойства химкокцида для кошек
при экспериментальном токсоплазмозе.
Практическая значимость работы. Разработаны «Методические рекомендации «Токсоплазмоз животных и цистоизоспороз собак и кошек. Профилактика и меры борьбы». Рекомендации одобрены Секцией инвазионные болезни животных и утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 04.03.2005. Разработана методика лечения кошек, заражённых и больных токсоплазмозом.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены:
На Всероссийской практической конференции 8 июня 2004 г., г.Волгоград, РПК «Политехник».
На ежегодных научных конференциях ветеринарного отделения аграрного факультета РУДН.
3. На научной конференции «Теория и практика борьбы с
паразитарными болезнями», ВИГИС, 2005, 25-27 мая.
Положения, выносимые на защиту:
особенности эпизоотического процесса при токсоплазмозе кошек в условиях г. Москвы;
семиотика экспериментального и спонтанного токсоплазмоза кошек;
токсические и лечебные свойства химкокцида при токсоплазмозе кошек.
8 Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из
введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных
исследований, их обсуждения, выводов, практических предложений,
списка использованной литературы из 229 источников, в том числе 169
иностранных и приложения. Работа иллюстрирована 15 таблицами, 1
графиком и 14 рисунками.
Эпизоотологический и серологический мониторинг токсоплазмоза кошек
Первое наблюдение по выявлению положительно реагирующих кошек в Австралии относят к 1959 году (Cook, Pope, 1959). Ниже приводятся данные литературы по этому вопросу. Смотри таблицу 1. О высокой чувствительности иммуноферментного метода (ИФА-ELISA) при экспериментальном токсоплазмозе кошек сообщали M.Lappin et al. (1989, 1993). С помощью этого метода авторы установили в сыворотке заражённых кошек наличие IgG и IgM, причём, как считают авторы, определение указанных иммуноглобулинов позволяет вести речь о выявлении хронического течения токсоплазмоза, в частности IgM появляется раньше, чем IgG. По данным В.Ф.Новинской (1966), самцы и самки старше года реагировали одинаково. Значительно меньший процент инфицированных отмечен у кошек в возрасте до года (3,4%). Наблюдения свидетельствуют, что с возрастом число положительно реагирующих на токсоплазмоз среди беспризорных кошек увеличивается. Токсоплазмозные антитела у них выявляют чаще и титр антител выше, чем у комнатных кошек (J.Unbehauen, 1991, F.Femander, 1995). Положительно реагирующих наблюдали чаще среди кошек (20,9%), и реже у котов (15,5%), а также у животных при кормлении натуральным кормом (19,3%). При кормлении кошек коммерческим кормом реагировало положительно 20% животных, при кормлении грызунами - 48%, при групповом содержании положительно реагировало 32%, при вольном -19,6%, при комнатном -13,7%, при нахождении в клетках - 19% (F.Femander, 1995). По другим данным (M.De Fea et al., 2002), среди уличных кошек положительно реагировало 50% животных, среди домашних - 43%. У котов - число положительно реагирующих составляло 43% животных, у кошек - 42%. В дальнейших исследованиях (M.Lappin et al, 1993) с помощью ELISA было показано у спонтанно больных и экспериментально заражённых токсоплазмозом кошек наличие в крови IgG и IgM (специфический иммунный комплекс), которые могут играть роль в развитии клинической картины болезни. В опытах Y.Omate et а!., (1994) установлений, что у котят, рождённых от заражённых токсоплазмозом кошек, обнаружены токсоплазменные IgG. У этих котят после заражения их ооцистами этих паразитов установлено повышение титра антител и выделение ооцист с фекалиями. В последующем D.Burney et al. (1995) с помощью ИФА помимо IgG и IgM установили у экспериментально заражённых кошек IgA, появление которых регистрировали по времени позднее IgG и IgM. Подозревается связь IgA с патологией глаз. E.Kimbita et al. (2001) сообщали о высокой чувствительности иммуноферментного метода (ИФА, ELISA), содержащего ген, кодирующий поверхностный антиген (SAG1, РЗО) Т. gondii, клонированного в плазмиде QEX-4T-3. Этот метод способен дифференцировать сыворотки кошек от сывороток мышей, заражённых экспериментальным токсоплазмозом. ИФА не даёт перекрёстных реакций с сыворотками мышей, заражённых неоспорозом. Из 193 сывороток кошек 40 (29,7%) давали положительную реакцию в ИФА. В опытах D.Burney et al. (1999) полимеразная цепная реакция оказалась более чувствительной, чем метод биопроб. Вместе с тем, авторы считают, что ПЦР не может быть полезной в диагностике клинического токсоплазмоза. Как видно из приведённых данных, число положительно реагирующих на токсоплазмоз кошек неоднозначное, что по нашему мнению, объясняется неодинаковой чувствительностью используемых методик. Информация о выделении токсоплазм из органов и тканей приведена в таблице 2. Анализ приведённых данных свидетельствует о том, что наиболее часто выделяются токсоплазмы из головного мозга, мышц и глаз животных. Сводные данные по выделению кошками с фекалиями ооцист токсоплазм приведены в таблице 3. - примечание ооцисты токсоплазм были идентифицированы с помощью биопробы на белых мышах. В Чехии в 6 зоопарках из 2287 проб фекалий от различных представителей семейства кошачьих (амурский леопард, дикие коты и др.) установлено 12 случаев выделения ооцист токсоплазм (D.Lukevova, J.Literak, 1998). Таким образом, данные таблицы свидетельствуют о низком проценте случаев выделения ооцист токсоплазм с фекалиями у кошек. 2.3 Семиотика токсоплазмоза кошек Анализируя литературу по семиотике токсоплазмоза следует отметить наличие разнообразной информации по этому вопросу, в частности указывается на наличие поражения нервной системы у кошек (Wickam, Carne, 1950, Haskins, 1989, Svoboda et al., 1988, Кудряшов, 1998), патологии органов пищеварения (Smart et al.., 1973, Neufeld Brandt, 1974, Svoboda et al., 1988), патологии органов дыхания (Parker et al., 1981 Meier et al., 1957, Bartels, 1972) и.т.д. Из клинических признаков у кошек наблюдали общее недомогание, потерю аппетита, лихорадку, апатию, диарею, параличи, эпилептиформные припадки, желтуху, ступор (В.Ф.Новинская, 1966, Meier et al., 1957, M.Petral, J.Carpeniter 1965). По сообщению J.Heidel et al. (1990), у 10-летнего кота, павшего при наличии полного паралича задних конечностей, диареи и анемии, обнаружили в спинном мозгу тахизоиты токсоплазм. О наличии неспецифических признаков токсоплазмоза у кошки сообщал И.И.Вершинин (1996). Вместе с тем, большинство исследователей указывают на субклиническое течение токсоплазмоза у кошек в спонтанных условиях (T.Hagiware et al. 1981, J.Dubey et al, 1989, 1995, M.Lappin et al. 1989, D.Burney et al. 1998. Svobodova et. al., 1998 и т.д.) Хотя в эксперименте можно получить четко выраженные признаки болезни, анорексию, повышенную температуру, блефариты, увеиты (J.Dubey, D.Thullier 1989), пневмонию (G.Parker et al, 1981), причем выраженность патологии зависела от числа введенных паразитов (G. Parker, 1981).
В данном разделе следует остановиться на патологии глаз у кошек, связанный с токсоплазмозом, в частности M.Lappin et al. (1989) у 15 кошек диагностировали патологию глаз токсоплазмозного происхождния. В последующем M.Chavkin et. al. (1994) указывали о наличии локальных токсоплазменных иммуноглобулинов в глазах при экспериментальном токсоплазмозе кошек. По мнению указанных авторов, специфические токсоплазменные сенсибилизированные В-лимфоциты или плазматические клетки мигрируют в глаза, где и происходит выработка токсоплазменных антител - IgG, наличие которых является показателем увеитов у животных.
Далее M.Lappin et al. (1995, 1996) для оценки глазной патологии у кошек при токсоплазмозе использовали коэффициент Goldman-Witmer, который представляет собой отношение токсоплазменных антител в глазной жидкости и сыворотке крови к общим антителам в сыворотке крови и антителам глазной жидкости. Определены количественные показатели этого коэффициента.
В дальнейших исследованиях D.Burney et, al. (1998) показано наличие специфических токсоплазменных антител IgG в слезной жидкости глаз. Их присутствие связано с хориоретинитом кошек. Рядом исследователей отмечается совместное течение токсоплазмоза с рядом инфекционных болезней, в частности с панлейкемией кошек, вирусом иммунодефицита кошек. Работами MXappin et al. (1989) показано наличие конкурирующей инфекции (вирус иммунодефицита) при токсоплазмозе глаз. По данным C.Witte et al. (1989), из 585 проб сывороток кошек 14 (2,4%) реагировало положительно на вирус иммунодефицита, 89 (15,2%) реагировали на токсоплазмоз. По данным этих авторов, вирус иммунодефицита является иммуносупрессивным фактором для проявленя токсоплазмоза. V.Svoboda et al. (1998) установили наличие токсоплазмозных антител у 63,6% из 33—х кошек, которые страдали вышеуказанными болезнями. Титры IgG колебались от 10 до 640 (в среднем 101). Выделение ооцист не наблюдали. Наличие IgG свидетельствует об оппортунистическом характере инфекции. Токсоплазмоз у кошек протекал инаппарантно. О наличи положительных реакций на присутствие вируса иммунодефицита, лейкемии и коронавирусов у кошек, реагирующих на токсоплазмоз сообщал M.Chavkin et al. (1992). Однако патология глаз у кошек (глаукома, смещения хрусталика и т.д.), по мнению авторов, были патогенетически связаны с токсоплазмозом. Существует несколько прижизненых серологических тестов диагностики токсоплазмоза сельскохозяйственных животных: реакция с красителем (Сэбин-Фельдмана), реакция связывания комплимента (РСК), реакция флюоресцирующих антител, реакция непрямой гемаглютинации,
Ферментная система: гиалуроновая кислота - гиалуронидаза
При изучении инфекционной патологии у животных большое значение имеет выяснение вопроса о механизме инфекции, в частности, значение системы гиалуроновой кислоты и гиалуронидазы. Большой интерес к изучению системы гиалуроновой кислоты и гиалуронидазы объясняется той важной ролью, которую они играют в состоянии тканей, в бактериальной инфекции и оплодотворении, особенно при объяснении понятия вирулентности возбудителя. Первое упоминание о веществах, способных повышать инвазивные свойства микробов, принадлежит А.С. Егорову (1900). Им было показано, что микробы могут вырабатывать вещества, усиливающие их распространение в организме. В 1928 г. Дюран-Рейнальс (Duran-Reynals) установил следующее если кролику вместе с вакциной коровьей оспы ввести внутрикожно небольшое количество (0,5 мл) тестикулярного экстракта, то площадь поражаемая вирусом увеличивается в несколько раз по сравнении с таковой у животных, которому введён тотже самый вирус, но без тестикулярного экстракта. Аналогичное действие наблюдалось также и в отношении многих других видов инфекционных болезней при использовании фактора, обнаруженного Дюран-Рейнальсем в семенниках. Это явление было названо феноменом Дюран-Рейнальса, а вещество его вызывающее - фактором проницаемости, фактором распространения, фактором диффузии. Фактор диффузии состоит из сложного состава различных ферментов и веществ, обладающих неодинаковым действием. К нему принадлежит комплекс ферментов, именуемыми гиалуронидазой. (Chain, Dutchie, 1940).
Гиалуронидаза в своём действии очень специфична, действует только на гиалуроновую кислоту. Вещества, близкие по химическому составу - гепарин, хондриатин - серная кислота гиалуронидазу не гидролизирует. Действие фермента на субстрат происходит ступенеобразно. Сначала нарушается связь между полисахаридной частью и белковой частью агрегата, затем наступает деполимеризация с понижением вязкости и , наконец, гидролиз с разрушением гликозидной связи между глюкуроновой кислотой и ацетил-глюкозамином. (ЕЛ.Гейман, 1947).
Под воздействием бактериальной и тканевой гиалуронидазы гиалуроновая кислота теряет способность вступать в связь с белком (разрушается связь между полисахаридной и белковой частью агрегата), что проявляется потерей гиалуроновой кислотой способности образовывать в кислой среде сгусток и исчезновением присущей ей вязкости. Этим достигается разрушение межклеточных соединительнотканных образований и в связи с этим увеличиваетсяпроницаемость тканей.
Факторы распространения были найдены в экстрактах семенников, сперматозоидов, в стрептококках, стафилококках, певмококках, возбудителях газовой гангрены, в яде змей, пчёл, экстратках пиявок, в ресничном теле и радужной оболочке (Е.Я.Гейман, 1947). Первые наиболее полные работы относительно гаалуронидазнои активности и действия этого фермента и гиалуроновой килоты на протозоа относятся к 1943 году.
Seneca, Henderson, Harvey (1943) при изучении влияния гиалуронидазы и гиалуроновой кислоты на Leishmania donovani, Trypanosoma cruzi, Entamoeba histolityca установили, что гиалуронидаза не влияла на размножение и жизнедеятельность указанных простейших.
Brune (1939) обнаружили фактор распространения у Ancylostoma duodenale.Lincicom (1953) предложил для определения гаалуронидазнои активности использовать гемолитический стрептококк группы А и С.
Использую эту методику, Stierwalt, Evans (1953) количественно установили гиалуронидазную активность по измеренному объёму капсул стрептококков, учавствующих в реакции. Далее Эванс установил, что гиалуронидазная активность церкарий проявляется при наличии в 1 мм3 от 10000 до 85000 особей, количество паразитов ниже этого значения ведёт к неправильным показателям.
Bradin (1953) при изучении 5 штаммов Entamoeda histolityca установил, что они обладают заметной гаалуронидазнои активностью после пассирования через организм хомяков и куриные эмбрионы.
Kuntz (1953) установил фактор диффузии у церкарий Shistosoma mansoni при внутрикожной инъекции кроликам размельчённых особей.
Boni, Orsi (1958), применяя свою оригинальную методику, установил слабовыраженную гиалуронидазную активность Trichomonas vaginalis. Б.А.Теохаров (1957) не смог установить наличие фактора распространения и гиалуронидазную активность у исследованных штаммов Trichomonas vaginalis. При изучении ряда простейших, гиалуронидаза была обнаружена также у Entamoeda histolityca (В.В.Счеснович, М.В.Губергриц, 1965, Bradin, 1953, М.Ф.Миагирова, С.З.Глейберман, 1963, С.Т.Айлярова, 1972), у Trichomonas vaginalis (Boni, Orsi, 1958), Т. foetus (Б.А.Тимофеев, 1962), балантидий (В.Г.Хамцов, 1966), По данным А.КАгеева (1951), Т.А.Яценко (1954), не всегда соблюдается полный параллелизм в степени активности гиалуронидазного действия и увеличения площади распространения краски у одного и того
Клннико-эпизоотологический мониторинг токсоплазмоза кошек
В течение 2000-2004 г. в Москве паразитологическому исследованию было подвергнуто 81 кошка различных пород и возраста. У этих животных брали кровь для серологических исследований (РСК, РФА) и фекалии на наличие ооцист токсоплазм. Результаты исследований представлены в таблице 6. Из таблицы видно, что более чувствительной является реакциями флуоресцирующих антител. Совпадения результатов по 2 реакциям отмечали в 16 случаях. Более высокий титр антител наблюдали в РФА (1:80 III!). Из клинических признаков у 6 животных отмечены патология глаз (кератиты, увеиты, блефариты и.т.д.), у 8 - бронхит, у 10 - диарея, сопровождающаяся слабостью, потерей аппетита; у 2 нервный тик головы. Необходимо отметить подобные признаки регистрировали и у кошек с отрицательными серологическими реакциями. Кроме того, в 2004 году было подвергнуто осмотру 250 кошек разных пород и возраста на наличие патологии глаз (увеиты, катаракта и.т.д.) с одновременным исследованиями их глазной жидкости с помощью ПЦР. Ни в одном случае не было выявлено поражение глаз и положительной полимеразной цепной реакции. Изучение жизненного цикла Toxoplasma gondii представляет большой интерес как в связи с вопросами систематики, так и для возможностей передачи токсоплазм на разных стадиях развития возбудителя. При изучении жизненного цикла токсоплазм в наших опытах при заражении котят токсоплазмами штамма «3» (эндозоиты) было установлено, что препатентный период составлял 9-12 дней, патентный -34 дня. Выделение ооцист с фекалиями у заражённых кошек регистрировали периодически (на 10, 12, 14 и 18 дни после заражения), (микрофотография 7) Вместе с тем, мы не могли выделить ооцист токсоплазм у животных при введении им эндозоитов штамма «RH», а также не обнаружили кишечного цикла развития паразитов этого штамма. Указанные материалы свидетельствуют о факультативной гетероксенности токсоплазм, то есть штамм «RH» существует в природе при отсутствии кишечной фазы развития в окончательном хозяине. При исследовании гистосрезов кишечника и мазков-отпечатков паренхиматозных органов новорожденных котят, заражённых алиментарным путём штаммом «3» удалось проследить 2 пути развития: I - кишечный, специфически приуроченный к организму кошек; II - внекишечный, проникновение мерозоитов из клеток кишечника в другие органы и ткани кошек. Кишечный путь, предшествующий образованию ооцист, протекает по схеме, принципиально сходной с жизненным циклом развития кокцидий рода Isospora, Мы обнаружили различные стадии токсоплазм на всём протяжении тонкого отдела кишечника, и особенно, в тощей и подвздошных кишках.
Проникая в эпителиальные клетки кишечника токсоплазмы (эндозоиты) начинают размножаться путём эндодиогении (стадия мерогонии) в подслизистой ткани кишечника, в результате чего образуются в большом количестве мерозоиты (расселительные стадии) (4,9x1,5 микрон) (рисунок 8,9,10).
Как известно, обычно совершается 2-3 и более генераций мерогонии, в течение которых паразит, адаптируется к внутренней среде организма хозяина. Впоследствии происходит их внекишечное размножение, и диссеминация во все паренхиматозные органы котят, где и осуществляется сначала предцистная, а затем и цистная мерогония. В дальнейшем наступает процесс гаметогонии: появляются микрогаметоциты и макрогаметоциты. Макрогаметоциты имеют продолговато-овальную или округлую форму (10-12 микрон), в их центре находится ядро, которое не делится. Микрогаметоциты имеют округлую или продолговато-овальную форму 10-14 микрон в диаметре. В одном гаметоците иногда можно насчитать до 70-80 микрогамет, их размер составляет 3,0x1,5 микрон. Однако образующие после полового процесса в слизистой оболочке ооцисты (10-12 микрон), выпадают в просвет кишечника и выделяются из организма кошек во внешнюю среду. Все стадии шизогонии и гаметогонии могут устанавливаться одновременно без чёткой последовательности. Ооциста покрыта плотной 3-х слойной оболочкой, наружний слой которой гладкий и бесцветный. Она имеет мелкозернистую цитоплазму, которая заполняет всё внутреннее пространство ооцисты. В процессе споруляции, которая идёт во внешней среде, цитоплазма уменьшается в объёме, между ней и внутренней оболочкой появляется пространство. В дальнейшем цитоплазма ооцисты делится на 2 части, вокруг которых формируется оболочка; далее, возникают чётко контурированные овальной формы спороцисты. В последующем в них образуются спорозоиты (также расселительные стадии). Спорозоиты представляют конечную форму спорогонии, после чего ооцисты токсоплазм становятся инвазионными (рисунок 11,12). При исследовании мазков-отпечатков паренхиматозных органов заражённых котят, окрашенных по Романовскому, были обнаружены эндозоиты (предцистные мерозоиты). Таким образом, эти паразиты могут являться первой генерацией мерогонии, либо спорозоитами, преобразовавшимися в тахизоиты без возникновения меронтов. Эндозоиты имеют форму полумесяца с более заострённым передним концом. Их величина составляет 5хЗмкм. Ядро располагается в передней части тела, оно окрашенно в красный цвет, а цитоплазма - в голубой. В наших опытах в поле зрения насчитывалось до 20-40 эндозоитов, что свидетельствовало об острой фазе токсоплазмоза. Проведённые опыты подтверждают наличие гомоксенного пути развития, т.е, в этом случае кошка является как промежуточным хозяином, в котором осуществляется бесполый путь развития, так и окончательным, где имеет место развитие и половых стадий токсоплазм. Как правило, у заражённых штамом «RH» котят заболевание протекало в острой форме при потере аппетита, развития слабости и депрессии. Котята, заражённые эндозоитами штамма «3», болели также тяжело, с признаками кровавой диареи, угнетения и гибели. При гистологичеком исследовании кишечника котят, заражённых штаммом «3», установлена гиперсекреция слизистой, дистрофия эпителия ворсинок - у одного котёнка в 12-ти перстной, а у остальных в тощей и подвздошных кишках. В отдельных участках встречались ворсинки в состоянии некробиоза и некроза. Соединительная ткань собственного слоя слизистой оболочки слабо отёчна и инфильтрирована лимфоидными клетками. В паренхиматозных органах отмечено наличие дистрофии (рисунок 13).
При гистологическом исследовании кишечника котят, заражённых штаммом «RH», установлено слабовыраженное набухание ворсинок и гиперемия слизистой и подслизистой 12-ти перстной кишки и чётко выраженная патология в органах и тканях этих животных, что подтверждает факт не обязательного наличия кишечной фазы развития у некоторых штаммов токсоплазм (рисунок 14).
Изучение токсических свойств химкокцида
Параметры острой токсичности и особенно величина ЛД 50 необходимы в первую очередь для определения коэффициента токсичности препарата - отношение дозы соответствующей ЛД 50 к терапевтической. Острая токсичность - это вредное воздействие препарата, проявляющее после его однократного применения или повторного введения через короткие промежутки времени (не более 6 часов) в течение суток. Основные параметры вычисляются при помощи различных статистических методов: Кербера (1931) и.т.д.
Для изучения острой токсичности химкокцида вначале готовили раствор состоящий из 0,1 г натрия карбоксиметилцеллюлозы, которую смешивали с горячей водой при 70 - 80 и оставляли на сутки. Затем эту суспензию доводили до 500 мл тёплой дистиллированной воды. Для работы использовали 15% концентрацию химкокцида на приготовленной выше суспензии натрия карбоксиметилцеллюлозы. Для этой цели его тщательно растирали в фарфоровой ступке постепенно добавляя указанную суспензию. Для дальнейших опытов использовали белых мышей с массой тела от 18 до 20 грамм. Расчёт токсичности химкокцида проводился по методике Кёрбера (1931), который считает, что для определения среднелетальной дозы препарата достаточно использовать 4-5 доз, интервал между которыми не обязательно должен быть одинаковым. Кёрбер считает также достаточным, чтобы в каждой группе было одинаковое количество животных и не менее 6 голов. Расчёт среднелетальной дозы расчитывают по формуле: ЛДІ0=ЛД]М- -, где и ЛД юо- доза вызывающая 100% гибель животных в группе; Z - среднее арифметическое из числа животных, у которых имела место реакция под влиянием каждых двух смежных доз; d - разность между двумя смежными дозами; п - число животных в группе Перед введением препарата белым мышам, последних выдерживали на полуголодной диете и за 4-8 часов до испытания не давали животным корма и воды. Суспензию в объёме от 0,2 мл до 0,7 мл вводили белым мышам непосредственно в желудок при помощи шприца и иглы с булавовидным утолщением на конце иглы. Кормление и воду давали лишь через 3 часа после введения препаратов в желудок. Итоги исследований приведены в таблице 13.
В течение 14 дней за подопытными животными велось клиническое наблюдение: обращалось внимание на состояние животных, шерстного покрова, активность движении, состояние желудочно-кишечного тракта. После гибели животных проводили вскрытие с изучением патологоанатомических изменений.
Введение в желудок белым мышам суспензии 15% концентрации химкокцида показало, что максимально переносимой дозой последнего явилась доза 1614,1 мг/кг массы тела (таблица 14). Начало гибели животных отмечалось при дозе 2384,8 мг/кг массы тела. Всего испытано 4 дозы - по 10 белых мышей на каждую дозу. Летальной дозой для всех опытных животных была доза 5607,4 мг/кг массы тела (таблица 14). Вскрытие павших белых мышей в первые часы показало, что острое воспаление желудочно-кишечного тракта было свойственно картине при отравлении. Однако в последующие дни (вторые-третьи сутки) отмечалось геморрагическое воспаление желудочно-кишечного тракта, местами в тонком отделе кишечника наличие тягучей слизи катарального характера с примесью крови. Печень и селезёнка незначительно увеличена, кровенаполнены. Почки тёмно-вишнёвого цвета, мозговой и корковые слои незначительно сглажены, сосуды этих слоев наполнены кровью. Общее состояние выживших белых мышей в последующем нормализовалось, активность в движениях ограничена, реакция на раздражители положительная. Таким образом, средняя смертельная доза химкокцида для белых мышей составляет 3335,5 мг/кг массы тела. Для изучения новых лекарственных веществ, помимо острой токсичности, необходимо исследовать действие препарата и при повторном введении. Практика показывает, что при многократном поступлении химических соединений возникает несоответствие между количеством вещества, поступившего в данный момент, и интенсивностью его токсического действия. В таких случаях говорят о кумулятивном действии препрата.
Для выявления кумулятивных свойств химкокцида использовали метод субхронической токсичности (Urn, 1961). Опыт проводили в течение 24 дней. В соответствии с данным методом в первые 4 дня вводили белым мышам 0,1 ЛД50, на следующие сутки дозу увеличивали в 1,5 раза и вводили следующие 4 дня и.т.д.
Опыт был поставлен на 60 белых мышах с массой тела 19-20 грамм, которые по принципу аналогов были разделены на 2 группы, по 30 мышей в каждой. Животные I группы получали испытуемый препарат, 2 группы служили контролем. Препарат вводили ежедневно, индивидуально, при помощи шприца с оливой, пероральноым путём в виде водной суспензии в объёме 0,6 мл. Опыт проводили в помещении при температуре +16 +18С.
В течение опыта наблюдали за внешним видом животных, за поведением, отправлением естественных функций, учитывая смертность мышей. Результаты опытов приведены в таблице 15.
![Малярия в условиях мегаполиса [Электронный ресурс]](/i/i/4441/178385.png "Малярия в условиях мегаполиса [Электронный ресурс] Иванова Татьяна Николаевна")
