Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Внутрибольничный инвазивный кандидоз - проблемы современной лабораторной диагностики (Обзор литературы) .10
1.1 Краткая историческая справка .10
1.2 Грибы рода Candida –возбудители инвазивного кандидоза 14
1.3 Современные подходы к видовой идентификации возбудителей инвазивного кандидоза .21
1.4 Чувствительность возбудителей инвазивного кандидоза к противогрибковым препаратам 31
1.5 Современные методы определения чувствительности Candida spp. к противогрибковым препаратам .35
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования 43
2.1 Объекты исследования 43
2.2 Подготовка культур Candida spp. 43
2.3 Идентификация Candida spp. методом ДНК – секвенирования .44
2.4 Идентификация Candida spp. методом MALDIOF масс-спектрометрии 46 2.4.1 Изучение комплекса видов C. parapsilosis .48
2.5 Видовая идентификация возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза с помощью тест-системы AUXACOLOR2 49
2.6 Изучение морфологических особенностей возбудителей инвазивного кандидоз .49
2.7 Методы определения чувствительности Candida spp. к противогрибковым препаратам in vitro 2.7.1 Метод микроразведений в жидкой питательной среде - CLSI M27-A3 .51
2.7.2 Диско-диффузионный метод определения чувствительности - CLSI M44-А 54
2.7.3 Определение чувствительности с помощью микробиологического анализатора Vitek 2 Compact .55
2.8 Статистическая обработка результатов 55
Результаты собственного исследования
ГЛАВА 3 Определение видового спектра клинических изолятов Candida spp 56
3.1 Источники выделения возбудителей инвазивного кандидоза 56
3.2 Сравнение результатов видовой идентификации Candida spp. методами ДНК-секвенирования и MALDIOF масс-спектрометрии 57
3.3 Сравнение результатов видовой идентификации штаммов Candida spp. методами MALDIOF масс-спектрометрии и тест-системой AUXACOLOR 2 59
3.4 Видовой спектр возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза в течение 2012-2014 гг .66
3.5 Географические особенности этиологии инвазивного кандидоза .69
3.6 Морфологические особенности возбудителей инвазивного кандидоза...71
3.7 Протеомное профилирование возбудителей инвазивного кандидоза 81
3.8 Молекулярно-генетические особенности возбудителей инвазивного кандидоза 83
ГЛАВА 4 Определение чувствительности клинических изолятов Candida spp. к противогрибковым препаратам 89
4.1 Результаты определения чувствительности возбудителей инвазивного кандидоза методом CLSI M27-A3 89
4.1.1 МПК противогрибковых препаратов для различных видов Candida spp .92
4.2 Результаты определения чувствительности возбудителей инвазивного кандидоза методом CLSI M44-А 99
4.3 Результаты определения чувствительности возбудителей инвазивного кандидоза с помощью анализатора Vitek2 Compact 102
ГЛАВА 5 Заключение 108
Выводы 119
Практические рекомендации .121 перспективы разработки темы 122
Список условных сокращений 123
Список литературы .
- Современные подходы к видовой идентификации возбудителей инвазивного кандидоза
- Видовая идентификация возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза с помощью тест-системы AUXACOLOR2
- Сравнение результатов видовой идентификации штаммов Candida spp. методами MALDIOF масс-спектрометрии и тест-системой AUXACOLOR 2
- Результаты определения чувствительности возбудителей инвазивного кандидоза методом CLSI M44-А
Современные подходы к видовой идентификации возбудителей инвазивного кандидоза
В 1869 году французский педиатр Joseph Parrot при изучении молочницы пищевода, желудка, кишечника, гортани, трахеи и легких, возникших в результате грибкового поражения ротоглотки, впервые произвел гистологическое описание проникновения гриба в ткани. В 1877 году немецкий ученый Paul Grawitz, культивируя возбудителя молочницы, обнаружил, что в кислых условиях образовались не нити гриба, а дрожжеподобные клетки, и назвал их Mycoderma vini. Одновременно немецкий ученый Max Reess, исследуя биопсийный материал от больных, описал возбудителя молочницы как дрожжеподобный микромицет, но назвал его Saccharomyces albicans. Таким образом, P. Grawitz и M. Reess первыми выявили диморфизм, характерный для Candida albicans, т.е. способность образовывать и дрожжеподобные, и нитчатые формы [14, 32]. В 1890 году немецкий ботаник Wilhelm Zopf переименовал возбудителя в Monilia albicans, а заболевание соответственно стало именоваться «монилиаз» вплоть до 1923 года, когда датский микробиолог Christine Berkhout предложила назвать род Candida и вид Candida albicans. Название Candida albicans было образовано от двух латинских слов: toga candida (тога, которую носили кандидаты древнеримского сената) и albicans - от латинского слова albicare – «отбеливать», что связано с внешним видом колоний на питательной среде.
Хорошо известное сейчас название рода Candida было закреплено лишь в 1954 году на VIII Ботаническом конгрессе в Париже и используется до сих пор [11].
Количество видов грибов рода Candida постоянно увеличивается и в настоящее время составляет около 150 видов, а включая синонимы - почти 800. Большинство Candida spp. являются сапротрофами. Основными патогенами для человека являются около 20 видов [8].
В соответствии с классификацией патогенных грибов, сформулированной в 1996 году американским микологом K.J.Kwon-Chung [96], в основу которой положены способы размножения грибов, Candida spp. относят к классу Ascomycetes и дрожжевым грибам. Ранее Candida spp. относили к классу Fungi imperfecti (или Несовершенным грибам, для которых половая стадия не была выявлена). С развитием методов диагностики возбудителей кандидоза, включая молекулярно-генетические, у многих видов Candida выявлена способность размножаться половым путем (половая стадия – телеоморфа). Для тех видов Candida, у которых половая стадия до сих пор не обнаружена, но молекулярно-генетическими исследованиями, характером метаболизма подтверждено, что эти грибы являются аскомицетами, введено понятие аффинитета, то есть сродства, в данном случае, к классу Ascomycetes. Названия половой стадии и бесполой (анаморфы) Candida spp. различны.
В последние годы благодаря использованию современных молекулярно – генетических методов значительно уточнены межвидовые отношения внутри рода Candida. Так, описаны три клады в роде Candida spp.: клада 1 – Candida albicans, включает C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis; клада 2 – Clavispora – Metschnikowia, включает C. guilliermondii, C. lusitaniae,
Грибы рода Candida - возбудители инвазивного кандидоза Инвазивный кандидоз – инфекция, вызванная грибами Candida spp., как правило, внутрибольничная, возникающая при наличии следующих факторов риска: долгое пребывание в отделении реанимации и интенсивной терапии, сахарный диабет, хирургические манипуляции, парентеральное питание, трансплантация органов и тканей, применение центрального венозного катетера, антибиотиков широкого спектра действия, а также иммуносупрессивной терапии и системы гемодиализа [4]. Грибы рода Candida являются важными представителями нормальной микробиоты человека. Чаще всего Candida spp. можно обнаружить в желудочно-кишечном тракте, на слизистых оболочках ротовой полости и половых органов, коже. Также они широко распространены во внешней среде (растения, почва, продукты питания) [29,69]. Дрожжи Candida spp. имеют общие характеристики: это одноклеточные микроорганизмы; образуют псевдомицелий (кроме C. glabrata и C. inconspicua); размножаются почкованием; размеры клеток в пределах 1,5 – 15 мкм; являются факультативными анаэробами, большинство видов растут при температуре 370С [95].
В соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами, принятыми в России, «СП 1.3.2322-08. Безопасность работы с микроорганизмами III и IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» [13], Candida spp. относят к III и IV группам патогенности, т.е. к условно-патогенным организмам, вызывающим оппортунистические системные микозы при понижении иммунного статуса человека (III группа) или являющимися возбудителями поверхностных микозов (IV группа). В соответствии с зарубежной классификацией по уровням биологического риска (BioSafety Level, BSL), принятой Всемирной Организацией Здравоохранения [98], Candida spp. относят к BSL-1 и BSL-2 -возбудителям низкого уровня риска, так как они вызывают глубокие микозы на фоне иммунодефицита, критического состояния (BSL-1) или среднего уровня риска (BSL-2) [11].
К основным возбудителям инвазивного кандидоза (ИК) человека относят виды: C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis. Реже встречаются: C. lusitaniae, C. guilliermondii, C. rugosa, C. inconspicua. Редкими возбудителями ИК являются C. kefyr, C. utilis, C. lipolytica, C. dubliniensis.
Самым частым возбудителем кандидоза, в том числе инвазивного, является вид C. albicans, который входит в состав нормальной микробиоты тела человека, колонизируя слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта. Поэтому ИК обычно возникает в результате эндогенной диссеминации, реже – экзогенным путем. C. albicans растет при температуре 370С и 450С. При посеве на «голодные» среды (рисовый агар, голодный щелочной агар) образует терминальные хламидоспоры. При инкубировании культуры C. albicans с сывороткой крови образуются «ростковые трубки» – короткие нити истинного мицелия. Аскоспор не образует [95].
C. parapsilosis обычно является экзогенным патогеном, обитает на коже человека. Этот вид распространен в окружающей среде больниц, на поверхностях катетеров и другом медицинском оборудовании. Образует псевдомицелий. В 2005 г. были описаны два новых вида, которые сформировали так называемый C. parapsilosis комплекс: собственно C. parapsilosis, C. orthopsilosis и C. metapsilosis. Два последних вида часто проявляют способность к формированию биопленок на биомедицинских устройствах, их идентификация возможна с помощью молекулярно-генетических методов, а также MALDIOF масс-спектрометрии [29, 39, 68].
C. glabrata может входить в состав нормальной микробиоты тела человека. Псевдомицелий не образует. Ассимилирует глюкозу и трегалозу. Важной особенностью C. glabrata является ее способность замещать вид C. albicans на фоне лечения инфекции, вызванной этим видом. В 2005 году с помощью ДНК-секвенирования выявлен «криптический» вид, т.е. вид не отличающийся по морфологическим и биохимическим свойствам – C. nivariensis, который является более устойчивым к азоловым противогрибковым препаратам, чем C. glabrata [121], а в 2008 описан вид C. bracarensis [29, 34].
Видовая идентификация возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза с помощью тест-системы AUXACOLOR2
Использовали бумажные диски (производство Oxoid, Великобритания) диаметром 6 мм, пропитанные противогрибковыми препаратами (диски с вориконазолом содержали 1 мкг препарата, диски с флуконазолом – 25 мкг препарата) и плотную питательную среду Мюллер-Хинтона, содержащую 2% глюкозу и 0,5 мкг/мл красителя метиленового синего [45].
Для приготовления инокулюма использовали суточные культуры исследуемых Candida spp. Мутность инокулюма соотвествовала 0,5 McFarland (1х106 - 5х106 клеток/мл ).
Посев инокулюма проводили не позднее, чем через 15 минут с момента его приготовления. Стерильный хлопковый тампон несколько раз погружали в инокулюм, затем переносили в чашку Петри со средой Мюллер-Хинтон и растирали по всей поверхности среды, постепенно вращая тампон, для получения роста «газоном» и полного впитывания инокулюма в среду. Диски с флуконазолом и вориконазолом наносили стерильным пинцетом на поверхность засеяной чашки, слегка придавливая для получения наибольшей площади соприкосновения со средой. Инкубировали при температуре 350С 18-24 часа. Учет результатов проводили автоматически с помощью микробиологического анализатора BIOMIC Vision (Giles Scientific, США) по диаметру зоны задержки роста (Таблица 8). [2, 45]. В качестве контроля качества исследования использовали тест-культуру C. parapsilosis ATCC 22019 (РКПГY-1245).
Критерии интерпретации метода М44-А Флуконазол І Вориконазол Категория чувствительности Диаметр, мм МПК,мкг/мл Диаметр, мм МПК,мкг/мл Чувствительный (Ч) 19 8 17 1 Умеренно-чувствительный (УЧ) 15-18 16-32 14-16 2-4 Устойчивый (У) 14 64 13 6 Определение чувствительности по стандарту CLSI M44-A было проведено в НИЛ микологического мониторинга и биологии грибов НИИ медицинской микологии им.П.Н.Кашкина (Зав. лабораторией Богомолова Т.С., исполнитель - н.с. Выборнова И.В.)
Определение чувствительности с помощью микробиологического анализатора Vitek 2 Compact Использовали автоматический анализатор Vitek 2 Compact (bioMerieux). В качестве расходного материала использовали пластиковые карты AST-YS01 (bioMerieux), содержащие в запаянных лунках серийные разведения противогрибковых препаратов ( флуконазол, вориконазол, амфотерицин В, 5-флуцитозин) [49,76].
Осуществление методики проводили в соотвествии с рекомендациями производителя. Из суточной культуры Candida spp. готовили суспензию в 3 мл 0,85% раствора NaCl в специальной пластиковой пробирке, затем пробирку вместе с картой AST-YS01 помещели в ячейки кассеты Vitek 2 Compact и устанавливали в прибор. Время определения чувствительности дрожжей к противогрибковым препаратам составляло 18-35 часов. Полученный результат автоматически выдавался после завершения определения чувствительности. Анализ данных проводили в соотвествии со стандартами интерпретации МПК CLSI M27-А3 S4 (2012).
Статистическая обработка результатов Результаты исследования обрабатывали с помощью программы STATISTICA for Windows версия 6.0. Использовали непараметрические и параметрические методы. Критерием статистической достоверности получаемых данных считали общепринятую в медицине величину р 0.05
Источники выделения возбудителей инвазивного кандидоза В период с 2011 по 2014 гг. исследовали биосубстраты от 284 пациентов с внутрибольничным инвазивным кандидозом (из 37 стационаров, в 12 городах России). Образцы периферической крови, перитонеальной и плевральной жидкостей, содержимого абсцессов внутренних тканей, цереброспинальной жидкости (ЦСЖ), биоптатов (мочеточник, кишечник, легкие, тромб сердца при аутопсии), желчи и пунктата суставной жидкости на питательные среды высевали наагар Сабуро. Было выделено 322 изолята грибов рода Candida (рисунок 5). Биосубстраты были получены, преимущественно, в результате многоцентрового исследования из отделений реанимации и интенсивной терапии. периферическая кровь перитонеальная жидкость содержимое абсцесса ЦСЖ плевральная жидкость биоптат желчь пунктат коленного сустава Рисунок 5 – Виды биоматериалов, из которых выделены возбудители ИК (n=322). В большинстве случаев (83,2%) возбудители внутрибольничного инвазивного кандидоза выделены из крови (рисунок 7).
Видовую идентификацию клинических изолятов Candida spp. осуществляли с помощью различных методов (ДНК-секвенирования, MALDIOF масс-спектрометрии, тест-системы AUXACOLOR2).
Сравнение результатов видовой идентификации Candida spp. методами ДНК-секвенирования и MALDIOF масс-спектрометрии
Определили видовую принадлежность 97 штаммов грибов из рода Candida референтным методом - ДНК-секвенированием, в соответствии с международным протоколом CLSI MM18-A (рисунок 6) и методом MALDIOF масс-спектрометрии (рисунок 7).
По результатам исследования 97 штаммов методом ДНК секвенирования было определено 9 видов Candida, среди которых C. albicans - 50,5%, другие виды Candida - 49,5% (C. parapsilosis - 14,4%, C. tropicalis – 12,4%, C. glabrata - 11,4%, C. krusei - 7,3%, C. lipolytica,C. lusitanie, C. bracarensis, C. kefyr - по 1,0 %).
По результатам видовой идентификации методом MALDIOF масс-спектрометрии 97 изолятов Candida spp. также определены 9 видов Candida (рисунок 9), среди которых 50,5% штаммов составляли C. albicans и 49,5 % составляли C. не - albicans виды (C. parapsilosis - 14,4%, C. tropicalis – 12,4%, C. glabrata – 11,4%, C. krusei - 7,3%; C. lipolytica, C. lusitanie, C. bracarensis и C. kefyr - по 1,0%).
Сравнение результатов видовой идентификации штаммов Candida spp. методами MALDIOF масс-спектрометрии и тест-системой AUXACOLOR 2
C. tropicalis Berkhout, 1923. Макроморфология культур. Колония диаметром 4,5 см получена через 14 суток после посева на агар Сабуро. Окраска колонии кремовая, слегка блестящая, консистенция мягкая, центр колонии имеет мелкозернистую текстуру, край колонии равномерно (рисунок 31а).
Микроморфология. При микроскопии обнаружены скопления дрожжевых клеток округлой и овальной формы размером 4,0-6,0 х 5,2-8,8мкм (рисунок 31б).
Морфология культуры C. tropicalis (изолят Ом-1): а –гигантская колония C. tropicalis, б – микроскопия культуры C. tropicalis; ДК–дрожжевые клетки C. utilis Lodder & Kreger-van Rij, 1952. Макроморфология культур. Через 14 суток после посева на агар Сабуро получен рост гриба в виде гигантской колонии диаметром 4,5 см. Окраска колонии молочная, консистенция мягкая, поверхность – гладкая, слегка блестящая, приподнятая. Край колонии мелко-складчатый (рисунок 32а). Микроморфология. При микроскопии обнаружены скопления дрожжевых клеток округлой и овальной формы размером 7,0 – 10,0 х 2,0 – 3,0 мкм (рисунок 32б).
Рисунок 32 – Морфология культуры C. utilis (изолят Пер-27): а –гигантская колония C. utilis, б – микроскопия культуры C. utilis ; ДК–дрожжевые клетки
В результате изучения морфологических особенностей представителей 14 видов грибов рода Candida обнаружено, что клетки C. albicans и близкородственного ей вида C. dubliniensis при микроскопическом исследовании практически не отличались друг от друга, равно как и клетки C. glabrata и криптического вида – C. bracarensis. Было замечено значительное сходство культур C. pararugosa и C. utilis, а также C. krusei и C. inconspicua по макро- и микроморфологическим признакам. Стоит отметить, что дрожжевые клетки редких видов, таких как C. bracarensis, C. pararugosa, C. utilis, C. inconspicua достаточно мелкие при микроскопии, в сравнении с другими видами Candida. Таким образом, выявлено, что у некоторых видов Candida существует сходство между собой как по внешнему виду колоний, так и дрожжевых клеток, что затрудняет их дифференцировку. Особенно важно, что подобные совпадения обнаружены между часто встречающимися и редкими видами.
Протеомное профилирование возбудителей инвазивного кандидоза В связи с установленной тенденцией к увеличению встречаемости комплекса видов C. parapsilosis среди C. не-albicans видов, нами был изучен состав этого комплекса с помощью MALDIOF масс-спектрометрии (рисунок 33).
Дендрограмма белковых масс-спектров штаммов С. parapsilosis (n=65). №№ 1-5 -номера субкластеров
Проведенным иерархическим кластерным анализом основных масс-спектропрофилей комплекса С. parapsilosis выявлено, что все исследуемые штаммы комплекса принадлежали только к виду С. parapsilosis. Изолятов С. orthopsilosis, C. metapsilosis в России не обнаружено. Все полученные масс-спектры были распределены по 5 субкластерам сообразно их родству между собой. Дальнейшее, более подробное, деление также происходило по принципу родства. Были обнаружены близкородственные масс-спектры у некоторых изолятов, которые были выделены в одних и тех же городах, в одних и тех же стационарах, в один промежуток времени, но от разных пациентов (изоляты №№ 29, 30, 31 – г. Москва , №№ 14, 15 – г. Тюмень, №№ 24, 42 – г. Санкт-Петербург). Также выявлено, что изоляты №№ 21 и 39, устойчивые к флуконазолу, располагались в субкластере № 2, а изоляты №№ 24 и 41 находились в субкластере №3 и обладали устойчивостью и к вориконазолу (изолят №41).
В качестве дополнения базы данных масс-спектропрофилей Bruker 3.1 для улучшения идентификации редких видов Candida нами были добавлены их масс-спектры (рисунок 34).
Масс-спектро профили редких возбудителей ИК: а – С. utilis, б -C. lusitaniae, в – C. kefyr, г – C. bracarensis. При сравнении масс-спектров C. parapsilosis, выделенных в России с масс-спектрами тест-штаммов из зарубежных коллекций микроорганизмов, приведенныхв базе данных Bruker Biotyper обнаружили различие белковых масс-спектропрофилей C. parapsilosis исследуемых штаммов от зарубежных коллекций типовых культур (рисунок 35). Также установлено, что масс-спектр штамма C. bracarensis, выделенный в России отличается от масс-спектров штаммов находящимся в Центральном бюро грибных культур в Нидерландах (рисунок 36). При сравнении масс-спектро-профилей штамма C. utilis, выделенного в РФ, со штаммами из зарубежных коллекций наоборот выявлено близкое сходство между ними (рисунок 37).
Таким образом, протеомные профили редких видов Candida spp. различны, что диктует необходимость дальнейшего наблюдения за видовым спектром, циркулирующим на территории России.
Для исследования полиморфизма региона D1/D2 гена 28S рРНК нами был выбран вид C. parapsilosis, которому принадлежит ведущая роль в развитии инвазивного кандидоза, вызванного C. не-albicans. В ходе исследования было получено 11 последовательностей данного региона для исследуемых штаммов C. parapsilosis, четырёх – для контрольных (типовые штаммы РКПГ), а также одного клинического штамма с не определённой чувствительностью к противогрибковым препаратам.
Полученные последовательности были выравнены и обрезаны по самым коротким, длина окончательного выравнивания составила 416 пар нуклеотидов (рисунок 38). Исключение составил штамм A., для которого удалось получить последовательность длиной только в 318 п.н.
Результаты определения чувствительности возбудителей инвазивного кандидоза методом CLSI M44-А
К вориконазолу чувствительность штаммов Candida spp. составила 97,5%, а доля умеренно-чувствительных и устойчивых составила – 0,9 % и 1,6%, соответственно. При этом 99,7% штаммов C. albicans были чувствительными к вориконазолу, а среди C. не-albicans – 95,7% штаммов, тогда как доля умеренно-чувствительных к вориконазолу составила 1,6%, устойчивых – 2,7%. Также было установлено, что 2 штамма C. guilliermondii, 2 штамма C. parapsilosis, 1 штамм C. tropicalis и 1 штамм C. albicans были устойчивы и к флуконазолу, и к вориконазолу. Таким образом, среди штаммов Candida spp. 1,9% были полирезистентны к азоловым антимикотикам. Наряду с этим, при изучении МПК противогрибковых препаратов, МПК50, МПК 90 было выявлено, что к флуконазолу у C. parapsilosis и C. guilliermondii начинает формироваться внутривидовая устойчивость. Такая же тенденция, как и в России была отмечена в исследовании в одном из госпиталей Бразилии в период исследования с 1998 по 2005 г [151]. В других исследованиях среди 1029 изолятов C. guilliermondii (127 медицинских центров) было отмечено снижение чувствительности к флуконазолу – до 25% штаммов [36].
В Турции при проведении исследования (2008 – 2009 гг.) по определению чувствительности возбудителей ВБИК к флуконазолу методом CLSI M27-A3 установили, что Candida spp. были чувствительными в 81,1%, умеренно-чувствительными – 8,1 % и 10,8% - устойчивыми. В отношении вориконазола доли умеренно-чувствительных и устойчивых были по 0,9 % [61]. Таким образом, процентное соотношение категорий чувствительности видов Candida spp., полученных нами, совпадает с данными, полученными другими исследователями.
К каспофунгину штаммов со сниженной чувствительностью нами обнаружено не было. При определении чувствительности к позаконазолу мы ориентировались на значение МПК90 1 мкг/мл, также как и большинство зарубежных исследователей, В нашем исследовании МПК90 позаконазола составило 0,125 мкг/мл. В исследовании, проведенном в Бразилии, МПК90 позаконазола составляла 0,25 мкг/мл. [43].
При определении чувствительности Candida spp к противогрибковым препаратам диско-диффузионным методом - протокол CLSI M44-A (141 клинический изолят) мы выявили, что 67,4% штаммов были чувствительны к флуконазолу, 32,6% – обладали сниженной чувствительностью. Результаты, полученные в соответствии с двумя стандартными протоколами (CLSI M27-A3, критерии 2012 г. и CLSI M44-A) были сравнимы. Количество чувствительных штаммов C. albicans составило 96,3% и 3,7% - устойчивых к флуконазолу. Среди C. не-albicans видов чувствительными были 48,8 % (CLSI M27-A3) и 46,6% (CLSI M44-A), умеренно-чувствительными 21,6% (оба метода), устойчивыми – 29,5% и 27,3%. Чувствительных штаммов C. albicans к вориконазолу было обнаружено 98,1%, а устойчивых – 1,8% по обоим протоколам. Среди C. не-albicans видов чувствительными к вориконазолу было 92% (CLSI M27-A3) и 83% (CLSI M44-A), умеренно-чувствительных – 2,3% и 9%, устойчивых – 5,7% и 7,9%. Достоверных различий в результатах, полученных двумя методами, не выявлено.
Для определения чувствительности к противогрибковым препаратам использовали также коммерческий метод Vitek2 Compact (82 изолята). Сопоставимость результатов, полученных с использованием протокола CLSI M27-A3 и метода Vitek2 Compact (по критериям интепретации CLSI M27-A3, 2012 г.) составляла от 78 до 100% в зависимости от вида изолята. Однако при сравнении результатов по критериям CLSI M27-A3, 2008 г. были отмечены несовпадения (12% в отношении флуконазола и 4,8% в отношении вориконазола). В исследовании американских ученых в 2011 г., при сравнении результатов определения чувствительности к каспофунгину и позаконазолу методами CLSI M27-A3 и Vitek2 Compact, обнаружено, что совпадение для каспофунгина составило 99,5%, для позаконазола – 95,6%. Однако, в зависимости от вида Candida spp. вариации в совпадении по категориям чувствительности составляли от 30% (C. krusei) до 100% (C. guilliermondii, C. parapsilosis) для каспофунгина [108, 109]. Совпадение результатов чувствительности к флуконазолу и вориконазолу методами CLSI M27-A3, Vitek2 Compact, Eest в исследовании французских ученых (2010 г.) варьировало от 25% до 100% (25% – C. glabrata) [22].
В крупном проспективном исследовании FUNGINOS (Швейцария, 2004-2009 гг.), анализируя 1090 изолятов крови, сравнивали результаты их чувствительности по критериям интерпретации EUCAST и CLSI M27-A3 (2008 и 2012 гг.). Для C. albicans не было выявлено значимых отличий МИК флуконазола, вориконазола и каспофунгина, 98% штаммов были чувствительны. Среди C. не-albicans наблюдали возрастание устойчивых изолятов среди C. tropicalis и C. parapsilosis для азолов, а также C. glabrata и C. krusei для каспофунгина в соответствии с новыми критериями EUCAST и CLSI 2012 г. по сравнению с критериями CLSI 2008 г. [40].
Следовательно, на основании наших исследований можно заключить, что в качестве метода выбора определения чувствительности к противогрибковым препаратам возбудителей ВБИК в микробиологической практике можно рекомендовать диско-диффузионный метод (протокол M44-A) и микробиологический анализатор Vitek2 Compact с критериями CLSI M27-A3 (2012 г). Метод разведения в жидких питательных средах (протокол CLSI M27-A3), в связи с его трудоемкостью, можно рекомендовать к использованию в основном в референтных лабораториях.
Учитывая возрастающее значение комплекса видов C. parapsilosis при инвазивном кандидозе мы проанализировали 65 масс-спектро-профилей этого комплекса. Были выявлены только штаммы, принадлежащие к виду C. parapsilosis sensu stricto, криптические виды C. metapsilosis, C. orthopsilosis не были обнаружены. Однако, в зарубежных исследованиях отмечают обнаружение и криптических видов комплекса C. parapsilosis – C. orthopsilosis, C. metapsilosis как методом MALDIOF масс-спектрометрии, так и рефентным методом (ДНК-секвенирование). В Италии при сравнительном исследовании комплекса C. parapsilosis, в который входят такие виды как C. metapsilosis, C. orthopsilosis и собственно C. parapsilosis, методом MALDIOF масс-спектрометрии и AFLP (молекулярно генетический метод) были выявлены все виды с высокой степенью точности, входящие в комплекс.
Путем проведения кластерного анализа нами выявлены сходные штаммы от разных пациентов – изоляты №№ 29, 30, 31 – г. Москва , №№ 14, 15 – г. Тюмень, №№ 24, 42 – г. Санкт-Петербург (в одном отделении и в один промежуток времени). Также выявлено, что в субкластере № 2 располагаются устойчивые к флуконазолу изоляты №№ 21 и 39, а в субкластере №3 находятся изоляты №№ 24 и 41, обладавшие устойчивостью также и к вориконазолу (изолят № 41).
Следует заметить, что поскольку среди исследуемых штаммов C. parapsilosis были выявлены сходные масс-спектры штаммов, к тому же имевшие устойчивость к азоловым препаратам в одном и том же субкластере, мы использовали ДНК – секвенирование в качестве метода поиска полиморфизма у данных устойчивых штаммов. Полиморфизм в регионе D1/D2 гена 28S рРНК, в том числе и множественный, был выявлен у чувствительных к флуконазолу и вориконазолу штаммах C. parapsilosis, у устойчивых штаммов полиморфизма не наблюдали. Следовательно, изучение в дальнейшем полиморфных вариантов генов Candida spp. будет перспективным при разработке быстрых методов определения устойчивости возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза к противогрибковым препаратам.
