Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современный взгляд на проблему экссудативного среднего отита (обзор литературы) 12
1.1. Теоретические аспекты лечения экссудативного среднего отита 13
1.2. Роль нейтрофильных лейкоцитов в противоинфекционной защите 20
1.3. Трудности лечения экссудативного среднего отита 27
Глава 2. Материал и методы исследования 37
2.1. Характеристика объекта исследования 37
2.2. Экспериментальные и клинические методы 37
2.3. Цитохимические методы 40
2.4. Компьютерный анализ изображения нейтрофильных лейкоцитов 43
2.5. Статистические методы 49
Глава 3. Экспериментальное изучение сроков заживления лазерных перфораций барабанной перепонки 50
Глава 4. Лазерная тимпаностомия при лечении больных экссудативным средним отитом 54
4.1. Лечение экссудативного среднего отита у больных со злокачественными опухолями носоглотки 54
4.2. Критерии отбора и лечение больных экссудативным средним отитом с использованием лазерной тимпаностомии 59
4.2.1. Клинические, функциональные и морфологические особенности течения экссудативного среднего отита у изученной категории больных 59
4.2.2. Консервативное лечение больных экссудативным средним отитом 66
4.2.2.1. Медикаментозное лечение больных экссудативным средним отитом 66
4.2.2.2. Лечение сопутствующих заболеваний верхних дыхательных путей у больных экссудативным средним отитом 67
4.2.3. Лечение больных экссудативным средним отитом с использованием лазерной тимпаностомии 69
4.2.4. Зависимость отдалённых результатов лазерной тимпаностомии от клинических, морфологических и функциональных особенностей течения экссудативного среднего отита 70
Глава 5. Цитохимическая характеристика нейтрофилов крови у больных экссудативным средним отитом (компьютерный анализ изображения) 73
5.1. Клетка в целом 86
5.2. Содержание в цитоплазме нейтрофильных лейкоцитов компонентов антибактериальных систем 86
5.3. Количество гранул и степень заполнения ими цитоплазмы 90
5.4. Зона диффузного распределения вещества 95
5.5. Резюме 96
5.6. Клинические примеры 100
Глава 6. Обсуждение результатов исследования 105
Заключение 113
Выводы 116
Практические рекомендации 117
Список литературы
- Роль нейтрофильных лейкоцитов в противоинфекционной защите
- Компьютерный анализ изображения нейтрофильных лейкоцитов
- Критерии отбора и лечение больных экссудативным средним отитом с использованием лазерной тимпаностомии
- Содержание в цитоплазме нейтрофильных лейкоцитов компонентов антибактериальных систем
Введение к работе
Актуальность темы
Экссудативный средний отит широко распространён (Анютин Р.Г. и соавт., 2004). Трудно найти ребёнка, не переболевшего им до трёхлетнего возраста (Дмитриев Н.С. и соавт., 1996). В развитых странах он служит главной причиной тугоухости у детей (Загорянская М.Е. и соавт., 2003). ;
При длительном течении экссудативный средний отит вызывает стойкие изменения барабанной перепонки и среднего уха: мирингосклероз, атрофию барабанной перепонки, ретракционные карманы, спайки барабанной перепонки с медиальной стенкой барабанной полости, разрыв цепи слуховых косточек, перфорацию барабанной перепонки, холестеатому, холестериновую гранулёму (Butler С.С., МасМШап Н., 2001; Roland P.S. et al., 2004; Ry-ding M. et al., 2004). Большинство холестеатом развивается в ретракционных карманах барабанной перепонки, возникших вследствие экссудативного среднего отита. Холестериновая гранулёма может вызывать значительные разрушения височной кости (Coleman В.Н., 1992; Sano S. et al., 1994).
Целью хирургического лечения служит вентиляция среднего уха через отверстие в барабанной перепонке. Миринготомия не может обеспечить длительной вентиляции, поэтому дополняется введением тимпаностомиче-ских трубок. Этим достигается аэрация среднего уха в течение значительного периода - от нескольких месяцев до 2 - 3 лет (Garin P. et al., 2001).
Тимпаностомия достаточно эффективна, однако имеет серьёзные недостатки. До сих пор не доказано, что столь продолжительный период вентиляции всегда необходим. Неясно, когда следует удалять тимпаностоми-ческие трубки. Нередко это делают через 2-3 года, однако лишь потому, что при увеличении срока ношения тимпаностомических трубок возрастает частота осложнений; других критериев длительности ношения вентиляционных трубок не существует (Kobayashi Н., Zusho Н., 1985; Le C.T.et al., 1991;LevineS. etal., 1994).
Ношение тимпаностомических трубок часто ведёт к осложнениям. Ото-рея развивается в 34,5% случаев (McLelland С.А., 1980). Она не только снижает качество жизни пациентов, но и может приводить к развитию внутричерепных осложнений (Преображенский Н.А., Гольдман И.И., 1987). Стойкая перфорация барабанной перепонки, в зависимости от модели и длительности ношения вентиляционной трубки, образуется в 5 - 20% случаев (McLelland С. А., 1980).
Тимпаностомические трубки вызывают патологические изменения барабанной перепонки и среднего уха, характерные для неблагоприятного течения самого экссудативного среднего отита. После введения вентиляционных трубок они возникают чаще, чем при отсутствии лечения (Schilder A.G., 1999; Butler С.С., MacMillan Н., 2001; Кос A., Uneri С, 2001). Так, тимпа-носклероз развивается в 39 - 65% случаев при ношении вентиляционных трубок и в 0 - 10% случаев при отсутствии лечения. Атрофия барабанной перепонки встречается соответственно в 16 - 73% и 5 - 31% случаев. Ателектаз и ретракции аттика также чаще возникают после тимпаностомии, чем без лечения (Schilder A.G., 1999).
Известно, что регенерация барабанной перепонки происходит дольше после повреждения лазерным излучением, чем хирургическими инструментами (Soderberg О. et al, 1984; Yucel О.Т., 2000). Это обстоятельство может быть использовано для создания длительно существующих перфораций барабанной перепонки. Однако отсутствуют объективные критерии, позволяющие до оперативного вмешательства прогнозировать эффективность применения лазеров для вентиляции среднего уха. Такая неопределённость затрудняет выбор оптимальной лечебной тактики.
Исследованиями последних лет доказано, что экссудативный средний отит имеет бактериальную этиологию (Biedlingmaier J.F. et al., 1998; Costeron J.W. et al., 1999; Saidi LS. et al., 1999; Berry J.A. et al., 2000; Post J.C., 2001; Ehrlich G.D. et al., 2002; Swords W.E. et al., 2004). Известно, что основную антибактериальную защиту осуществляют нейтрофильные лейкоциты (Козинец Г.И. и соавт., 2001). Нейтрофильную инфильтрацию постоянно обнаруживают при экссудативном среднем отите (Lee D.H. et al., 2001).
Эффективность участия нейтрофилов в иммунной защите организма зависит от состояния их внутриклеточных антибактериальных систем, основные компоненты которых содержатся в нейтрофильных гранулах (Козинец Г.И., Макаров В.А., 1997; Козинец Г.И. и соавт., 2001; Borregaard N. et al, 1993; Bor-regaard N., 1996; Bainton D.F., 1999). Активность компонентов антибактериальных систем нейтрофилов изменяется в соответствии с тяжестью патологического процесса и служит показателем его выраженности при целом ряде заболеваний (Шубич М.Г., Нагоев Б.С., 1980). В то же время традиционный подход к оценке результатов цитохимических реакций не позволяет выявить тонкие изменения внутриклеточных структур (Автандилов Г.Г., 1996).
Известно, что экссудативный средний отит не сопровождается выраженными изменениями периферической крови. Это обстоятельство служило одной из причин того, что ещё недавно данное заболевание рассматривалось как неинфекционный, стерильный воспалительный процесс.
Очевидно, что для оценки функциональных возможностей нейтрофильных лейкоцитов при развитии экссудативного среднего отита представление о гранулированности их цитоплазмы должно иметь количественное выражение, основанное как на определении числа гранул, так и на измерении их геометрических и оптических параметров. Визуальная оценка клеток в микроскопических препаратах не может привести к адекватному решению такой задачи. Световой микроскоп не позволяет точно подсчитать количество гранул в клетке, а тем более измерить отдельные внутриклеточные структуры. Переход от визуального наблюдения к измерению характеристик объекта по его изображению позволяет получить принципиально новые данные о клетке (Левин Г.Г., Козинец Г.И., 1997). Применение телевизионного ком пьютерного анализа клеточного изображения расширяет возможности светового микроскопа (Погорелов В.М. и соавт., 1995).
Несмотря на обширные исследования, посвященные экссудативному среднему отиту, механизмы его развития во многом,остаются неясными. Серьёзные и частые осложнения ношения вентиляционных трубок вызывают настороженное отношение к ним. Зачастую это приводит к несвоевременному началу хирургического лечения. Достойной альтернативой ношению тимпаностомических трубок может стать лазерная тимпаностомия.
Данные об эффективности применения лазеров для обеспечения долгосрочной вентиляции среднего уха малочисленны и не позволяют в клинической практике сделать выбор между традиционной и лазерной тимпано-стомией. Объективные методы оценки тяжести воспалительного процесса в среднем ухе, которые позволили бы до операции прогнозировать её влияние на течение экссудативного среднего отита, отсутствуют. С учётом имеющихся сведений о роли нейтрофильных лейкоцитов, их количественное цитохимическое исследование у больных экссудативным средним отитом будет способствовать раскрытию механизмов развития заболевания и обоснованию лечебной тактики.
Цель и задачи исследования
Цель. Повысить эффективность лечения больных экссудативным средним отитом с помощью лазерной тимпаностомии и определить зависимость её исхода от характера изменений цитохимических маркеров антибактериальных систем в цитоплазме нейтрофильных лейкоцитов крови по данным компьютерного анализа клеточного изображения.
Задачи:
1. Разработать технику выполнения лазерной тимпаностомии аппаратом на иттрий - алюминиевом гранате с неодимом.
2. Выявить зависимость длительности вентиляции среднего уха от диаметра лазерной перфорации барабанной перепонки.
3. Установить количественные показатели активации нейтрофильных лейкоцитов у больных экссудативным средним отитом по активности и распределению в цитоплазме НАДФН-оксидазы и щелочной фосфатазы.
4. Определить состояние азурофильной зернистости циркулирующих нейтрофилов крови при экссудативном среднем отите по геометрическим и оптическим параметрам гранул миелопероксидазы и нафтол-AS-D-хлорацетат эстеразы.
5. Выявить эффективность лазерной тимпаностомии при экссудативном среднем отите в зависимости от характера экссудата и показателей функционально-метаболического состояния антибактериальных систем нейтрофилов периферической крови.
Научная новизна
1. Разработан способ выполнения лазерной тимпаностомии с помощью•» Nd:YAG лазера для лечения экссудативного среднего отита.
2. Получены сведения о сроках закрытия перфораций барабанной перепонки, созданных Nd:YAG лазером.
3. Установлены количественные показатели активации циркулирующих нейтрофильных лейкоцитов, связанные с изменениями геометрических и оптических параметров гранул НАДФН-оксидазы и щелочной фосфатазы. У больных с мукоидным экссудатом выявлен более высокий, чем при серозном характере экссудата, уровень активации нейтрофилов.
4. Получены данные о снижении активности миелопероксидазы и наф-тол-АБ-В-хлорацетат эстеразы в цитоплазме нейтрофильных лейкоцитов периферической крови при экссудативном среднем отите. Эти изменения более выражены у больных с мукоидным экссудатом и указывают на де-грануляцию азурофильной зернистости активированных нейтрофилов в кровеносном русле до выхода в очаг воспаления.
5. Установлено, что у больных с серозным экссудатом меньший уровень активации и менее выраженное снижение бактерицидного потенциала циркулирующих нейтрофилов сопровождается большей, чем у больных с мукоидным экссудатом, эффективностью лазерной тимпаностомии.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Лазерная тимпаностомия - эффективный и безопасный метод лечения больных экссудативным средним отитом. Созданная Nd:YAG лазером перфорация барабанной перепонки диаметром 2 миллиметра обеспечивает вентиляцию среднего уха в течение 1 месяца. Стойкая перфорация барабанной перепонки диаметром 3 миллиметра обеспечивает длительную вентиляцию среднего уха у больных экссудативным средним отитом со злокачественными опухолями носоглотки.
2. Для экссудативного среднего отита характерна активация ней-трофильных лейкоцитов периферической крови со снижением антибактериального потенциала азурофильной зернистости вследствие её де-грануляции в системном кровотоке. Эти изменения более выражены у больных с мукоидным характером экссудата среднего уха, чем с серозным, и позволяют прогнозировать эффективность лазерной тимпаностомии у больных экссудативным средним отитом.
3. Лазерная тимпаностомия показана больным экссудативным средним отитом с умеренными изменениями активности компонентов ней-трофильной зернистости и серозным экссудатом. Лицам со значительными изменениями активности цитохимических маркеров антибактериальных систем и густым мукоидным экссудатом необходима тимпаностомия с введением вентиляционных трубок.
Научно-практическая значимость
Внедрение лазерной тимпаностомии в клиническую практику повысило эффективность лечения больных экссудативным средним отитом. Выполненные Nd:YAG лазером перфорации барабанной перепонки также могут быть использованы для эндоскопии барабанной полости и долгосрочного введения лекарственных препаратов в среднее ухо.
Выявленные изменения активности ферментов в цитоплазме нейтро-филов у больных экссудативным средним отитом могут быть использованы в клинической лабораторной диагностике при оценке тяжести патологического процесса. Различия в активности цитохимических маркеров антибактериальных систем у больных с различным характером экссудата могут применяться для прогнозирования эффективности лазерной тимпаностомии у больных экссудативным средним отитом.
Внедрение результатов исследования
По материалам исследований опубликовано 14 печатных работ. Основные положения диссертации представлены на заседании краевого научного общества оториноларингологов (Краснодар, 2001), юбилейной научно-практической конференции, посвященной столетию профессора В.К. Супрунова (Краснодар, 2002), XXIX научной конференции студентов и молодых учёных ВУЗов юга России (Краснодар, 2002), Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых учёных и студентов по медицине (Тула, 2002), республиканской научно-практической конференции "Проблемы и возможности микрохирургии уха" (Оренбург, 2002), республиканской конференции "Национальные дни лабораторной медицины России - 2002" (Москва, 2002), XXX научной конференции студентов и молодых учёных ВУЗов Южного федерального округа (Краснодар, 2003), I Всероссийской конференция "Физиология иммунной системы" (Сочи, 2003), всероссийской конференции с междуна родным участием "Проблема реабилитации в оториноларингологии", посвященной восьмидесятилетию академика И.Б. Солдатова (Самара, 2003), I Всероссийской конференция по иммунотерапии (Сочи, 2003).
Лазерная тимпаностомия, способ отомикроскопии и пневматическая ото-эндоскопия у больных экссудативным средним отитом внедрены в практику работы Краснодарской краевой оториноларингологической больницы (приложения 2, 3,4). Видеопособия для обучения студентов, интернов и клинических ординаторов "Лазерная тимпаностомия у больных экссудативным средним отитом", "Отомикроскопическое исследование больных экссудативным средним отитом" и "Пневматическая отоэндоскопия у больных экссудативным средним отитом" внедрены в учебный процесс на кафедре ЛОР - болезней Кубанской государственной медицинской академии (приложения 5,6,7).
Роль нейтрофильных лейкоцитов в противоинфекционной защите
Известно, что основную защиту от бактериальных инфекций обеспечивают нейтрофильные лейкоциты (Козинец Г.И., 2000). Нейтрофильная инфильтрация - постоянная находка при экссудативном среднем отите (Lee D.H. et al., 2001). Содержание нейтрофилов в слизистой оболочке и субэпителиальной ткани среднего уха больных экссудативным средним отитом значительно выше, чем у здоровых (Amin К. et al., 1999).
Внутриклеточные антибактериальные системы нейтрофилов подразделяют на кислородзависимые и кислороднезависимые (Locksley R.M., Klebanoff S.J., 1983; Clark R.A., Borregaard N., 1985; Kobayashi T. et al.,1998; VoUebregt M. et al.,1998). Кислородзависимые антибактериальные системы используют продукты респираторного взрыва. Одна из этих систем для образования биооксидантов нуждается в наличии миелопероксидазы (Henderson W.R., Klebanoff S.J., 1983; Klebanoff S.J., et al., 1993), другая связана с действием НАДФН-оксидазы (Меныцикова Е.Б., Зенков Н.К., 1997).
Наиболее заметным функциональным проявлением стимуляции фагоцитов является респираторный взрыв (Клебанов Г.И., Владимиров Ю.А., 1999). При этом происходит резкое увеличение потребления клетками кислорода для образования свободных кислородных радикалов. Стимулом для респираторного взрыва является контакт с объектом фагоцитоза или высокие концентрации хемоаттрактантов в очаге воспаления. Респираторный взрыв обусловлен активацией НАДФН-оксидазы и приводит к образованию активированных кислородных метаболитов, обладающих высокой реакционностью (Шанин В.Ю.,1998). С помощью НАДФН-оксидазной системы кислород окисляется до супероксидного радикала, который под влиянием супероксиддисмутазы образует перекись водорода. При её восстановлении супероксидным радикалом происходит образование гідроксильного радикала. Он является чрезвычайно мощным окислителем, способным атаковать все органические соединения (Уайт А. и соавт., 1981; Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К., 1997). Параллельно образуется синглетный кислород, несущий на одной орбите два электрона (Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1995). Синглетный кислород индуцирует перекисное окисление мембранных фосфолипидов и нарушает проницаемость клеточных мембран. Самой активной формой кислорода считается гидроксильный радикал, который с высокой скоростью реагирует почти со всеми макромолекулами клетки, такими как ДНК, белки, липиды и углеводы.
Клетки, вовлеченные в процесс респираторного взрыва, определяются по способности к восстановлению при фагоцитозе красителя нитросинего тетра-золия до формазана (Дуглас С.Д., Куй П.Г., 1983). Нитросиний тетразолий (НСТ) при этом служит акцептором электронов от окисляемого субстрата, конкурируя в соответствии со своим редокс-потенциалом с участком цепи биологического окисления на уровне цитохрома С (Jones S.A. et al., 1996). Стимуляция нейтрофила растормаживает НАДФН-оксидазу и активирует гексозомонофосфатный шунт. Электроны, снимаемые с НАДФН, переводят молекулярный кислород в супероксидный анион, который непосредственно восстанавливает НСТ (Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., 1995). Таким образом, НСТ-тест отражает активность НАДФН-оксидазных систем в нейтрофилах, является показателем степени активации кислородзависимого метаболизма и связанной с ним выработки клетками активных форм кислорода.
Активированные нейтрофилы выделяют активные формы кислорода в межклеточное пространство и в фагосомальные вакуоли. При поглощении микроорганизмов сегменты плазматической мембраны нейтрофила инва-гинируются, и активированные оксидазы с поверхности плазматической мембраны оказываются внутри фагосомы, определяя внутриклеточное накопление оксидантов (Бахов Н.И. и соавт., 1988; Vaissiere C.et al., 1999). Поэтому связанная с фагоцитозом активация сопровождается внутрифаго-сомальным восстановлением НСТ, в то время как при стимуляции растворимыми антигенами фагосомы не образуются, и формазан откладывается на плазматической мембране (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1983).
Миелопероксидаза считается маркером азурофильных гранул нейтро-филов. Это доказано средствами электронной цитохимии (Arnljots К. et al., 1998; Bainton D.F., 1999). Миелопероксидаза катализирует внутриклеточное окисление органических соединений, перенося от них два электрона на перекись водорода. Нейтрофилы обладают миелопероксидазной системой, которая включает в себя миелопероксидазу, перекись водорода, а также окисляемые кофакторы - ионы хлора, иода, брома (Rosen Н., Klebanoff S.J., 1982; 1985; Rosen Н. et al., 1987). Миелопероксидаза и перекись водорода окисляют кофакторы, тем самым переводя их в активную форму. В результате генерируются эффективные микробицидные средства (Хаитов P.M., Пинегин Б.В. 1995; Henderson W.R., Klebanoff S.J., 1983; Hampton М.В. et al., 1996; Shih H.C. et al., 1999). В процессе респираторного взрыва нейтрофилы в присутствии миелопероксидазы способны продуцировать гипохлорную кислоту, выполняющую вместе с перекисью водорода антимикробную функцию и играющую роль медиатора воспаления, а также увеличивающую проницаемость эндотелия сосудов (Ochoa L. et al., 1997). Микробицидное действие миелопероксидазы также связано с декарбоксилированием и деза-минированием аминокислот бактерий, быстрым и обширным подавлением синтеза бактериальной ДНК (Rosen Н., Michel B.R., 1997).
При активации нейтрофилов наряду с образованием супероксидного ки слорода наблюдается их дегрануляция с освобождением миелопероксидазы из азурофильных гранул (Nagaji J., 1999). Внеклеточная миелопероксидаза стимулирует освобождение воспалительного цитокина TNF-a и генерирование активных форм кислорода макрофагами, что, в свою очередь, стимулирует респираторный взрыв в нейтрофилах (Stapleton P.P. et al., 1998).
Специфичным ферментом для клеток нейтрофильного ряда является нафтол-AS-D-хлорацетат эстераза. Она относится к сериновым эстеразам -гидролитическим ферментам, способным расщеплять простые эфиры N-свободных спиртов и органических кислот (Хейхоу Ф.Г.Д., Кваглино Д., 1983). Электронно-цитохимически установлено, что нафтол-AS-D-хлорацетат эстераза является компонентом азурофильных гранул нейтро-филов (Wiedermann С.J. et al.,1983). В процессе гранулоцитопоеза она синтезируется на стадии промиелоцита и сохраняется во время дальнейшего созревания клеток (Wiedermann С J. et al.,1983; Jain N.C.et al., 1989).
Цитохимически лейкоцитарные эстеразы выявляются по их действию на субстраты - простые ацильные или хлорацильные эфиры, в числе которых нафтол-АБ-О-хлорацетат. В процессе реакции освобождающийся нафтол связывается с соответствующим диазотированным амином, при этом образуется азокраситель (Katayama I., Mochino Т., 1983; Frederix М., Baert J., 1986; Markovic O.T. et al., 1988).
По своим свойствам нафтол-АЗ-О-хлорацетат эстераза сходна с химот-рипсином. Есть мнение, что эти ферменты идентичны, поэтому нафтол-AS-D-хлорацетат эстераза обеспечивает протеолитическую переваривающую функцию нейтрофилов (Li C.Y. et al., 1973). Механизм микробицид-ного действия нафтол-А8-0-хлорацетат эстеразы связан с гидролизом пеп-тидогликана бактериальной стенки (Шубич М.Г., Нестерова И.В., 1978).
Компьютерный анализ изображения нейтрофильных лейкоцитов
Компьютерный анализ изображения нейтрофильных лейкоцитов проводили при помощи высокочувствительной цветной телевизионной системы для микроскопических исследований "MagiScop" (рис. 2.3). Система прошла испытания в научно-производственном комплексе спектрозонального телевидения и обработки изображений НИИ Телевидения. Испытания показали её пригодность для научных исследований в медицине и биологии посредством количественного анализа геометрических и оптических характеристик микрообъектов (приложение 1).
Система "MagiScop" включает в себя микроскоп "Бимам Р-13" с мик-рофотонасадкой, на которой установлена цветная телевизионная камера стандарта S-VHS с кодирующим мозаичным фильтром. Камера имеет матрицу 1/2 дюйма, количество элементов 752x582. Разрешающая способность системы не менее 460 телевизионных линий по горизонтали.
Связь микроскопа с телекамерой, а также согласование поля зрения микроскопа и изображения на экране монитора осуществляет оптический адаптер. Для визуального контроля изображения нами использован цветной монитор Hitachi СРМ 1404 с размером экрана 14 дюймов по диагонали и разрешением 500 телевизионных линий. Выходной сигнал стандарта PAL с качеством изображения S-VHS с телекамеры передается на установленную в компьютере плату ввода/вывода видеосигнала - цветной фрейм-граббер МАГ-9Ц. Объем видеопамяти фреймграббера 6 МБайт (2 полноэкранных цветных кадра). Формат видеопамяти 768x576 элементов, разрешение 24 бита на пиксел.
Для компьютерного анализа изображения применяли пакет прикладных программ "Magisoft" и "Видеотест". Пакет прикладных программ НИИ телевидения "Magisoft" производит ввод/вывод изображения с фреймграббера, чтение/запись на диск компьютера, согласование динамического диапазона сигнала с диапазоном аналого-цифрового преобразователя, улучшение и
сегментацию цветного изображения. Дальнейшую обработку и автоматический анализ изображения мы производили с помощью программного пакета "Видеотест-морфо" фирмы "Иста-Видеотест" (Санкт-Петербург).
Возможности анализатора изображения "Видеотест" для проведения микрофотометрических исследований клеток апробированы в Институте цитологии РАН. Установлена линейность фотометрической характеристики при измерении содержания ДНК в клетках разных классов плоидности (Штейн Г.И. и соавт., 1998).
Подготовка изображения к автоматическому сканированию включает в себя его бинаризацию по цвету или яркости. Бинарное изображение состоит только из двух цветов (объекта и фона), что позволяет компьютеру идентифицировать выделенные структуры при измерениях. Бинарное изображение можно подвергнуть морфологическим операциям для наиболее точной его подготовки к измерениям в автоматическом режиме (очистка от шумов, сглаживание границ, разрыв связей, заполнение пустот, контури-рование структур). Автоматические измерения позволяют определить геометрические параметры выделенных объектов (площадь, средний диаметр, факторы формы круга, эллипса, округлость), оптические параметры (яркость, оптическую плотность, среднее значение цвета и его насыщенности). РІзображения нейтрофильных лейкоцитов сохраняли в базе данных на основе программного продукта "Видеотест-альбом".
Анализ изображения нейтрофильных лейкоцитов производили с использованием следующего алгоритма.
1. Изображение нейтрофила, найденного с помощью иммерсионной системы микроскопа в мазке крови (рис. 2.4) или лейкоконцентрате, вводили через телекамеру в видеопамять компьютерного фреймграббера.
2. С помощью программного алгоритма линейной аппроксимации увеличивали изображение клетки до размера экрана монитора (нейтрофилы из мазков крови - в 3 раза, после инкубации с НСТ - в 2 раза). Линейная ап проксимация позволяет вывести внутриклеточные структуры из области шумов и сделать их доступными для последующих измерений.
3. Делали медианную фильтрацию изображения для равномерной очистки изображения от высокочастотных шумов (небольших по размерам сильных выбросов яркости).
4. Производили RGB - LSH преобразование, то есть переход из цветовой модели RGB в цветовое координатное пространство LSH. Выполняли контрастирование по гистограмме яркости. Возвращали изображение в цветовую модель RGB.
5. Сохраняли изображение в виде файла, переносили для обработки программой "Видеотест-морфо".
6. Применяли фильтр, усиливающий резкость изображения.
7. Измеряли яркость фона для вычисления оптической плотности.
8. Производили бинаризацию (сегментацию) изображения по яркости или цвету цитохимической реакции (рис. 2.5). Последовательно выделяли клетку в целом, зону диффузно-гранулярного распределения вещества (рис. 2.6), его гранулы (рис. 2.7).
9. В каждом из трех бинарных изображений удаляли элементы, не имеющие отношения к анализируемой клетке, и однопиксельные шумы (элементы, одно из измерений которых составляет один пиксел).
10. Производили автоматическое сканирование бинарных изображений с измерением заданных параметров, занося результаты в три различных канала: "Клетка в целом", "Зона диффузно-гранулярного распределения красителя" и "Гранулы красителя".
Критерии отбора и лечение больных экссудативным средним отитом с использованием лазерной тимпаностомии
Обследование больных экссудативным средним отитом включало сбор анамнеза, осмотр ЛОР-органов с помощью стандартных инструментов, традиционную отоскопию с применением ушной воронки, пневматическую отоскопию воронкой Зигле, отомикроскопию и пневматическую ото эндоскопию, тимпанометрию, тональную пороговую аудиометрию.
Мы разделили все изучаемые отоскопические признаки на статические и динамические. Первые выявляются всеми перечисленными методами отоскопии, вторые при движениях барабанной перепонки, вызванных изменением давления в наружном слуховом проходе при использовании воронки Зигле и пневматической отоэндоскопии. Информативность различных методов в отношении отдельных отоскопических признаков представлена в таблице 4.2. Сокращения: БП - барабанная перепонка; ПОЭС - пневматическая отоэндоскопия (принята за 100%); ОМС - отомикроскопия; МСБП -медиальная стенка барабанной полости. Из таблицы видно, что отоскопия с помощью ушной воронки при известном опыте позволяет обнаружить статические признаки. Воронка Зиг ле уступает отомикроскопии в выявлении линии экссудата и пузырьков воздуха, перфорации барабанной перепонки и выделений, ретракции pars flaccida, мирингосклероза, атрофии барабанной перепонки.
В то же время воронка Зигле превосходит отомикроскопию при обнаружении спаянности барабанной перепонки с медиальной стенкой барабанной полости, оценке подвижности барабанной перепонки и её отдельных участков, подвижности рукоятки молоточка. В сравнении с пневматической отоэндоскопией воронка Зигле одинаково информативна при оценке втяжения и выпячивания барабанной перепонки, по остальным признакам уступает ей.
Следует отметить, что использование пневматической отоэндоскопии в ряде случаев позволяет обнаружить ложноположительный результат, полученный с помощью микроскопа. В частности, в 4 случаях при пневматической отоэндоскопии обнаружена фиксация средней части барабанной перепонки к медиальной стенке барабанной полости, что при отомикро-скопии было принято за линию экссудата.
Перфорация барабанной перепонки и патологические выделения в наружном слуховом проходе обнаружены нами в 10 из 166 случаев отоскопического обследования, что позволяет отнести эти признаки к разряду редких у больных экссудативным средним отитом.
Посредством пневматической отоэндоскопии определяли подвижность барабанной перепонки; при этом хорошо различается неподвижность отдельных участков, спаянность со стенками барабанной полости и слуховыми косточками. Диффузное ограничение подвижности в различной степени наблюдали во всех случаях экссудативного среднего отита. Локальное ограничение подвижности наблюдали при ретракциях барабанной перепонки и мирингосклерозе. Пневматическая отоэндоскопия позволяет не только выявить, но и чётко оценить степень ретракции барабанной перепонки. В 2 случаях IV типа ретракций pars flaccida дифференцировка от перфораций достигнута лишь при пневматической отоэндоскопии. Характер ретракций барабанной перепонки представлен в таблице 4.3. Классификации ретракций барабанной перепонки приведены в разделе 2.2.
Содержание в цитоплазме нейтрофильных лейкоцитов компонентов антибактериальных систем
Анализ цифровых данных, содержащихся в таблицах 5.1.-5.8., показал, что наибольшей информативностью для оценки функционального состояния нейтрофилов крови и прогнозирования эффективности лечения больных экссудативным средним отитом обладает интегральный цитохимический показатель (ИЦП) зоны диффузно-гранулярного распределения ферментов. На рисунках 5.5. и 5.6. представлены значения ИЦП нейтрофилов крови здоровых и больных людей с различным характером экссудата в среднем ухе. На гистограммах величина целого столбца - ИЦП диффузно-гранулярной зоны цитоплазмы. При этом части столбца характеризуют ИЦП гранул и диффузной зоны.
В нейтрофилах больных с мукоидным экссудатом интегральный цитохимический показатель щелочной фосфатазы составляет 7,3±0,09 отн. ед. до лечения и 4,67±0,06 отн. ед. после лечения (рис 5.5.А). Значение интегрального цитохимического показателя НАДФН-оксидазы - 16,83±0,19 отн. ед. до лечения и 9,58±0,06 отн. ед. после лечения (рис 5.5.В).
Значение активности миелопероксидазы: 1,03±0,02 отн. ед. до начала лечения и 3,27±0,02 отн. ед. после лечения (рис 5.6.А). Активность нафтол-AS-D-хлорацетат эстеразы равна 4,09±0,05 отн. ед. до лечения, 6,58±0,07 отн. ед. после лечения (рис 5.6.В).
В нейтрофилах больных с серозным экссудатом активность щелочной фосфатазы равна до лечения 4,98±0,06 отн. ед., после лечения 3,3±0,02 отн. ед. (рис 5.5.Б). Значение интегрального цитохимического показателя НАДФН-оксидазы: 10,92±0,13 отн. ед. до лечения и 5,5±0,06 отн. ед. после лечения (рис 5.5.Г).
У миелопероксидазы интегральный цитохимический показатель составляет 3,4±0,04 отн. ед. до лечения и 4,91±0,06 отн. ед. после него (рис 5.6.Б). Активность нафтол-AS-D-хлорацетат эстеразы до лечения 9,92±0,12 отн. ед., а после лечения - 14,09±0,16 отн. ед. (рис 5.6.Г)
Таким образом, компьютерный анализ клеточного изображения выявил изменение активности компонентов антибактериальных систем в нейтрофилах больных экссудативным средним отитом.
Активность щелочной фосфатазы до начала лечения превышает показатели здоровых людей в 2,3 раза (р 0,001) у больных с мукоидным экссудатом и в 1,6 раза (р 0,001) у больных с серозным характером экссудата. После лечения активность щелочной фосфатазы у пациентов с серозным экссудатом статистически значимо (р 0,001) снижается до нормальных показателей, а у больных с мукоидным экссудатом остаётся повышенной в 1,5 раза (р 0,001).
Активность НАДФН-оксидазы до лечения увеличена в 2,9 раза (р 0,001) у больных с мукоидным экссудатом и в 1,9 раза (р 0,001) у больных с серозным экссудатзначений (р 0,001), в то время как у больных с мукоидным экссудатом остаётся повышенной в 1,7 раза (р 0,001).
Активность миелопероксидазы до лечения снижена в 5,1 раза (р 0,001) у больных с мукоидным экссудатом и в 1,5 раза (р 0,001) у больных с серозным экссудатом. После лечения активность фермента повышается и у пациентов с серозным экссудатом достигает значений здоровых людей, а у пациентов с мукоидным экссудатом остаётся пониженной в 1,6 раза (р 0,001).
Активность нафтол-АБ-В-хлорацетат эстеразы до лечения снижена в 4,1 раза у больных с мукоидным экссудатом (р 0,001) и в 1,7 раза у больных с серозным экссудатом (р 0,001). После лечения этот показатель возрастает (р 0,001), оставаясь, тем не менее, ниже нормы в 1,2 раза (р 0,01) у больных с серозным экссудатом и в 2,6 раза у больных с мукоидным характером экссудата (р 0,001).
Для интерпретации изложенных в разделе 5.2. данных о разнонаправленных изменениях активности ферментов в нейтрофильных лейкоцитах у больных экссудативным средним отитом необходимо рассмотреть результаты измерения количества гранул в клетке, степень заполнения ими цитоплазмы, а также способность гранул сливаться и формировать конгломераты. Уменьшение количества гранул в цитоплазме лейкоцита со снижением показателя заполнения, но без возрастания показателя их конгломерации может свидетельствовать о дегрануляции нейтрофилов в крови.
Количество гранул в нейтрофильных лейкоцитах здоровых людей, по данным компьютерного анализа изображения, самое большое - 75 принадлежит нафтол-АБ-О-хлорацетат эстеразе, они занимают 6% площади клетки. Миелопероксидаза имеет 38 гранул (4% площади). Меньше всего гранул щелочной фосфатазы - 21 (2% площади клетки). Гранул НАДФН-оксидазы 26 на 1% площади клетки.
У больных экссудативным средним отитом среди всех параметров гранул нейтрофилов наиболее выраженные различия имеют их количество и показатель заполнения клетки.
У пациентов с мукоидным экссудатом щелочная фосфатаза до лечения представлена в среднем 43,8±0,49 гранулами с показателем заполнения клетки б,90±0,08%. После лечения эти показатели составили 35,9±0,41 гранул и 3,98±0,05%. НАДФН-оксидаза до лечения имеет 87,4±0,98 гранул, занимающих 3,61 ±0,05% площади клетки. После лечения эти показатели равны 42,4±0,37 гранулам и 1,75±0,02%.
Миелопероксидаза до лечения образует 18,4±0,22 гранул (рис. 5.7.А) и заполняет 3,85±0,05% площади клетки. После лечения этот фермент представлен 29,6±0,34 гранулами, которые занимают 3,04±0,04% площади клетки. Количество гранул нафтол-AS-D-хлорацетат эстеразы до лечения -47,3±0,68 (рис. 5.7.В), показатель заполнения клетки 3,50±0,04%. После лечения эти показатели соответственно равны 66,70±0,75 гранул и 4,04±0,05%.
У больных с серозным экссудатом щелочной фосфатазе до лечения принадлежит 31,4±0,36 гранул, показатель заполнения 4,19±0,05%. После лечения эти показатели равны соответственно 23,9±0,23 гранул и 2,67±0,1%. НАДФН-оксидаза до лечения образует 42,4±0,48 гранул с показателем заполнения 3,17±0,04%, после операции - 28,6±0,29 гранул, показатель заполнения равен 1,3±0,1%.
Гранул миелопероксидазы до лечения в клетке 29,8±0,34 (рис. 5.7.Б) при показателе заполнения 3,05±0,04%, а после лечения - 34,6±0,39 гранул, которые занимают 3,78±0,05% площади нейтрофила. Нафтол-AS-D-хлорацетат эстераза представлена до лечения 63,3±0,71 гранулами (рис. 5.7.Г) с показателем заполнения 5,26±0,06%, после лечения 69,8±0,79 гранулами, занимающими 9,67±0,11% площади клетки.
