Введение к работе
Актуальность.
Бактериородопсин (БР) был открыт в 1973 году. Это природный мембранный белок, содержащийся в клетках Halobactcrivvn halobium. Уникальность БР із том, что он является простейшей фотосинтезирую-щей системой - все процессы по преобразованию световой энергии в трансмембранную электрохимическую разность потенциалов осуществляются единственной молекулой. Хотя преобразование энергии в сложных организмах выполняется не одной молекулой, а целым набором органических соединений, кажущаяся простота БР весьма относительна - ее аминокислотная последовательность состоит из 248 аминокислотных остатков. Исследовательский интерес к принципам функционирования бактериородопсина объясняется еще и тем, что БР исключительно стабилен, он восстанавливает активность и после глубокого замораживания, и после воздействия сильных кислот и щелочей, и после вакуумного' высушивания. Выделенные в виде фрагментов клеточных мембран, образцы позволяют работать с ними как с обычным, хотя и сложным, органическим соединением, а не как с традиционными биологическими объектами. К изучению БР применялось множество, как чисто физических, так и физико-химических методов исследования. Исследованию функционирования БР посвящены тысячи научных публикаций, аспекты его активности неоднократно обсуждались на специализированных научных конференциях. Однако, несмотря на столь значительный исследовательский интерес и затраченные усилия, окончательный ответ о физических механизмах функционирования до сих пор не получен, и бактериородопсин продолжает оставатся объектом исследования во многих лабораториях.
Поскольку главная функция БР это перекачка протонов с цито-плазматической на внешнюю сторону мембраны, то особый интерес представляют внутримолекулярные изменения, связанные с перемещениями зарядов.
Изменения оптических характеристик среды, вызванные движением зарядов, не ограничиваются только изменениями в хорошо изученных спектрах поглощения видимого диапазона. Поглощение в других частях спектра отражает влияние локальных электрических полей на прочие, отличные от близкого окружения к хромофору, части белковой молекулы. Так поглощение БР в ближнем УФ диапазоне определяется наличием в аминокислотной последовательности ароматических аминокислот. Исследование возмущений вблизи отдельных аминокислот проводилось различными методами, однако результаты исследований зачастую противоречивы и вопрос о том, какие именно аминокис-
лотные остатки претерпевают возмущения и на каких стадиях фотоцикла, остается открытым. Эксперименталыюе исследование того, как движущийся заряд влияет на отдельные аминокислоты, на каких именно стадиях фотоцикла - одна из целей данной работы.
Кинетика движения зарядов может регистрироваться не только косвенным, как это имеет место при регистрации изменений оптических свойств среды, но и прямым путем - методом измерения кинетики индуцированного заряда. В этом случае необходимо иметь ансамбль одинаково сориентированных молекул. Известно несколько типов ориентированных систем, однако, наиболее интересны молекулярные ориентированные пленки, полученные методом Лэнгмюра- Блоджетт (ЛБ пленки). Такой выбор обусловлен все возрастающим интересом к устройствам "молекулярной электроники" - приборам, осуществляющим функции электронных элементов на молекулярном уровне.
БР один из вероятных кандидатов на использование в опто-электронных приборах, т.к обладает хорошей устойчивостью к внешним воздействиям, высоким быстродействием (фемтосекунды), имеет высокий квантовый выход и большие спектральные различия фотопродуктов. Кроме того, БР сохраняет фотоактивность в условиях, далеких от естественных, например в сухом состоянии или помещенным в полимерную матрицу.
Исследование фотоцикла БР в ЛБ структурах обычно ограничивается регистрацией фототока/фотонапряжения с многослойной системы с невысоким временным разрешением. Измеренная кинетика движущихся зарядов может быть искажена влиянием экспериментальных факторов, например взаимодействием с электродами измерительной ячейки или паразитными фотонаведенными окислительно-восстановительными реакциями. Задача данного исследования - создание высокооднородных искусственных БР-содержащих мембран молекулярной толщины, исследование фотоактивности БР и процессов, связанных с транспортом зарядов в молекулярных твердотельных пленках.
Цель работы.
Цель данной работы состояла в получении информации о внутримолекулярном движении зарядов при функционировании бактериоро-допсина как в естественных условиях, так и в сухих ориентированных структурах.
Научпая новизна.
-
Кинетически разделены вклады в абсорбционные изменения от возмущений вблизи конкретных аминокислот в фотоцикле бактерио-родопсина.
-
Получена связь между стадиями фотоцикла и молекулярными событиями, вызывающими возмущения вблппп аминокислотных остатков тирозина и триптофана.
-
В приближении линейной последовательности интермедиатов получены дифференциальные спектры в УФ области спектра L, М и О фотопродуктов для БР в нативных'условиях.
-
Продемонстрировано, что метод Лэнгмюра-Блоджетт позволяет получить высокооднородные пленки с молекулами БР противоположных ориентации.
-
Впервые получен разрешенный во времени сигнал фотонапряжения с единственного ЛБ-БР слоя. Показано, что кинетики фотонапряжения с монослоев различной молекулярной ориентацией полностью симметричны.
-
Из кинетических кривых фотоэлектрического отклика выделены вклады, связанные с движением зарядов. Показана идентичность временных констант, связанных с формированием и распадом М состояния, полученных из спектральных и фотоэлектрических измере-ний.
-
Получена температурная зависимость временных констант фотоцикла. Вычислены энергии активаций процессов.
Научпая и практическая цеппость работы.
Рассмотрены экспериментальные методы исследований, дающие информацию о внутримолекулярных событиях, связанных с движением зарядов при функционировании бактериородоисина.
Результаты исследования возмущающего действия движущихся зарядов на аминокислотные остатки молекулы бактериородопсина позволили кинетически разделить вклады от отдельных аминокислот. Был решен вопрос о том, какие именно виды аминокислот подвержены влиянию локальных электрических полей от движущегося заряда. На основании полученных данных сделаны выводы о молекулярных событиях вблизи конкретных частей молекулы белка.
Исследована активность бактериородопсина в сухих пленках Лэнгмгора-Блоджетт, которые могут быть использованы в приборах молекулярной электроники. Разработаны методы, позволяющие регистрировать малые смещения заряда в мономолекулярных пленках. Получены монослойные образцы с противоположными ориентациями бактериородопсина. Исследованы кинетики фотопотенциала и абсорбцион-
пых изменений, связанные с функционированием бактериородопсина в пленках. Полученные данные позволили сделать выводы о перемещениях заряда в молекуле при малых значениях влажности. Вычислены активационные энергии микросекундных стадий.
Результаты исследований интересны с точки зрения понимания механизмов функционирования простейшей фотосинтезирующей системы.
Апробация работы
Основные результаты исследований, вошедшие в диссертацию неоднократно докладывались на семинаре отдела колебаний ИОФ РАН; на IV международной конференции "Ретинальсодержащие белки" в (США, г.Санта-Круз, 1990); 14 симпозиуме ГОРАС по фотохимии (Бельгия, г.Левен, 1992); IV международной конференции "Laser applications in life sciences" (Финляндия, г.Юваскула, 1992); V международной конференции "Ретинальсодержащие белки" (Франция, г.Дурдан, 1992).
Публикации.
По результатам диссертации опубликовано 9 печатных работ, список которых приведен в конце автореферата.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка цитированной литературы из 236 наименований. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы и 25 рисунков.
