Введение к работе
Актуальность темы
Рак молочной железы (РМЖ) является самой распространенной онкологической патологией у женщин. На сегодняшний день довольно подробно изучены спектр и частота молекулярно-генетических нарушений при РМЖ. Вместе с тем, наряду с аномалиями на уровне генома, внимание современных исследователей привлекают изменения эпигенетических процессов, к которым относится метилирование ДНК. Метилирование цитозина в составе так называемых "CpG-островков" активирует деацетилированне гистонов, что, в свою очередь, приводит к изменению конфигурации хроматина и локальному подавлению транскрипции (Ng НН, Bird А, 1999). CpG-островки представляют собой короткие участки в промоторных областях генов, содержащие повышенное по сравнению с остальным геномом число CG-динуклеотидов; эти районы практически всегда не метилированы в нормальных клетках.
Для опухолей характерен дисбаланс эпигенетической регуляции: на фоне глобального гипометилирования наблюдается гиперметилирование промоторных областей множества генов. Для новообразований разных локализаций, включая РМЖ, установлены специфичные профили метилирования (Costello JF et al., 2000).
Во многих случаях гиперметилирование является причиной инактивации супрессорных генов (Jones PA and Baylln SB, 2002; Herman JG and Baylin SB, 2003). В соответствии с классической моделью Knudson'a, функция одного из аллелей гена-супрессора может быть подавлена вследствие метилирования, а другого - за счет точковой мутации или делеции (Plass С, Soloway PD, 2002). В отличие от мутаций, необратимо изменяющих первичную структуру ДНК, присоединение метильной группы к основаниям потенциально обратимо. Этот факт лег в основу разработок терапии, направленной на восстановление нормальной картины метилирования и, соответственно, экспрессии антионкогенов (Herman JG and Baylin SB, 2003).
Гиперметилирование генов ESR1 (ER-alpha), BRCA1, CCND2, RARb2 встречается со значительной частотой при раке молочной железы.
По данным Li S et al. (2005), ER-alpha гиперметилирован в 84% РМЖ. Определение экспрессии рецепторов эстрогенов (ЭР) в опухолевой ткани остается одним из наиболее важных параметров при определении прогноза заболевания и выборе лечебной тактики. Приблизительно треть опухолей не содержит рецепторов
стероидных гормонов на момент диагноза, кроме того, фракция изначально ЭР-положительных карцином перестает экспрессировать их в ходе прогрессирования. Между тем, причины нарушений экспрессии рецепторов эстрогенов пока еще во многом неясны. Некоторые исследования указывают на ассоциацию гиперметилирования промотора гена ESR1 с потерей его транскрипции (Weigel RJ, deConinck ЕС, 1993; Kim SJ et al., 2004).
Мутации в антионкогене BRCA1 обуславливают до 10-15% наследственных карцином молочной железы. В спорадических случаях, напротив, соматические мутации встречаются чрезвычайно редко. Тем не менее, такие факты, как высокая частота потерь гетерозиготности (LOH - Loss of Heterozygosity) в этом локусе и снижение экспрессии BRCA1 в «несемейных» РМЖ, свидетельствуют об участии этого гена и в развитии ненаследственных неоплазий. На сегодняшний день доказано, что гиперметилирование промотора принадлежит к числу возможных способов инактивации BRCA1 (EstellerMetal., 2000).
Еще одной частой мишенью эпигенетических нарушений является ген циклина D2 (CCND2). CCND2 вместе с другими D-циклинами отвечает за переход от S1- к G-фазе клеточного цикла путем активации циклин-зависимых киназ, фосфорилирования белка RB1 и накопления транскрипционных факторов. Кроме того, он обладает и альтернативной антипролиферативной активностью (Меууаррап М et al., 1998). Возможно, угнетение именно этой супрессорной функции при метилировании промотора CCND2 имеет значение в патогенезе РМЖ.
Доля РМЖ с гиперметилированием промотора гена рецептора ретиноевой кислоты (RARb2) составляет, по некоторым данным, до 69% (Bean GR et al., 2005). RARb2 необходим для реализации функции ретиноидов, которые участвуют в регуляции роста и дифференцировки нормальных клеток в эмбриогенезе и неопластических клеток в процессе малигнизации.
Особый интерес для молекулярно-генетических исследований представляет билатеральный рак молочной железы (БРМЖ), так как при этой форме заболевания две опухоли развиваются в пределах одного организма на фоне идентичных эндогенных и экзогенных воздействий. Кроме того, БРМЖ является самой частой формой первично-множественных опухолей у человека. Эпигенетические нарушения при БРМЖ практически не охарактеризованы. Изучение вопроса о конкордантности или дискордантности статуса метилирования описанных выше генов в двух неоплазмах от одной пациентки предоставляет исключительную возможность судить о степени
сходства патогенеза обеих опухолей и о роли эпигенетических нарушений в их развитии.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы является изучение особенностей картины метилирования генов в билатеральных опухолях молочной железы. В связи с этим поставлены следующие задачи:
Сравнить уровни метилирования и частоты гиперметилирования генов ESR1, BRCA1, CCND2, RARb2 в билатеральных и монолатеральных опухолях молочной железы
Провести анализ конкордантности/дискордантности изучаемых явлений в парных образцах БРМЖ
Сопоставить данные о метилировании гена ESR1 при РМЖ с информацией об экспрессии рецепторов эстрогенов на уровне РНК и белка в тех же опухолях
Провести анализ корреляций между статусом метилирования генов ESR1, BRCA1, CCND2, RARb2
Провести анализ ассоциаций между статусом метилирования изучаемых генов и клинико-биологическими параметрами РМЖ.
Научная новизна полученных результатов
В настоящей работе впервые изучены профиль и частота гиперметилирования генов ESR1, BRCA1, CCND2, RARb2 при БРМЖ. Также проведено сравнение частот изученных явлений между монолатеральными и билатеральными опухолями.
Практическая значимость
Полученные данные об эпигенетических нарушениях при билатеральной форме РМЖ дополняют «молекулярный портрет» БРМЖ и вносят вклад в понимание его патогенеза. В дальнейшем эта информация может быть использована при разработке новых принципов противоопухолевой терапии.
Основные положения, выносимые на защиту:
1) Билатеральные опухоли молочной железы не отличаются от монолатеральных по уровню метилирования и по частоте гиперметилирования генов BRCAl,CCND2,RARb2.
Билатеральные опухоли молочной железы отличаются от монолатеральных по уровню метилирования промотора гена ESR1. В билатеральных карциномах значительно выше доля случаев с низким (<10%) уровнем метилирования.
Гиперметилирование промотора гена ESR1 является редким событием при раке молочной железы (частота составляет 4% в монолатеральных и 4% в билатеральных карциномах). Колебания уровня метилирования ниже порога гиперметилирования не ассоциированы с изменением экспрессии рецепторов эстрогенов.
Метилирование генов ESR1, BRCA1, CCND2, RARb2 не проявляет тенденции к повышенной конкордантности в парных билатеральных карциномах молочной железы. Данное наблюдение ставит под сомнение критическую роль эпигенетических нарушений в патогенезе БРМЖ.
Апробация работы
Результаты работы были представлены на научной межлабораторной конференции НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова (22 декабря 2008 г., Санкт-Петербург, Россия), на конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2009» (17 апреля 2009 г., Санкт-Петербург, Россия).
Струю-ура и объем диссертации
Диссертация изложена на 100 страницах и состоит из введения, обзора литературы, глав материалов и методов, результатов исследований, обсуждения полученных данных и выводов. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 16 рисунками. Библиографический указатель включает 193 публикации, в том числе 7 отечественных и 186 зарубежных.
Исследуемые группы
Материалом для исследования послужила ДНК, выделенная из 3 групп образцов: билатеральных опухолей молочной железы (БРМЖ), монолатеральных опухолей молочной железы (МРМЖ), а также из морфологически нормальной ткани молочной железы (N). Все пациентки, включенные в исследование, проходили лечение в НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова, образцы собирались в период с 1985 по 2006 год.
Группа билатеральных карцином представлена 72 образцами от 42 пациенток. В их число вошли 32 опухоли из синхронных (сБРМЖ) и 40 опухолей из метахронных (мБРМЖ) пар. Синхронными считались случаи, в которых новообразования обеих молочных желез были диагностированы с промежутком менее 1 года. Из 40 метахронных опухолей 17 были первыми (Ml), а 23 - вторыми (М2) из пар. Средний возраст женщин в подгруппах синхронных, первых и вторых метахронных неоплазм составил 56.3, 50.1 и 63.5 года, соответственно (возрастной интервал 38-85, 32-85,41-87 лет).
В группу монолатеральных карцином вошли опухоли от 71 пациентки. Средний возраст больных составил 55.4 года (возрастной интервал 32-78 лет). Контрольную группу составили 28 образцов морфологически нормальной ткани молочной железы от пациенток с БРМЖ (средний возраст 57.1 года, возрастной интервал 32-85 лет).
Анализ метилирования, ввиду использования архивного парафинового материала, удалось провести не во всех случаях, информация о количестве проанализированных образцов представлена в таблице 1.
Таблица 1. Количество образцов МРМЖ и БРМЖ, проанализированных при помощи пиросеквенирования (сБРМЖ- синхронный БРМЖ, мБРМЖ ~ метахронный БРМЖ).
Изучаемые группы опухолей были охарактеризованы по ряду клинико-биологических параметров. Сведения о размере опухоли и вовлеченности региональных лимфоузлов по системе TNM, иммуногистохимической экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона, степени дифференцировки и гистологическом варианте новообразования взяты из историй болезни, хранящихся в архиве НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова. Информация об амплификации онкогена HER2, мутациях
в гене р53 и экспрессионных подтипах карцином взята из результатов предыдущих исследований использованных коллекций опухолей (Suspitsin EN et al., 2007; Russnes HG et al., in press).
Выделение ДНК
Источником ДНК во всех исследуемых группах послужили архивные патоморФологические парафиновые блоки. Выделение ДНК проводилось по методике, рекомендованной Agilent Technologies и описанной в работе van Beers EH et al. (2006). Процедура выделения состояла из нескольких этапов: удаления парафина, обработки ферментом протеиназой К, экстракции геномной ДНК.
С целью депарафинизации в пробирку с 3-5 парафиновыми срезами толщиной 20 мкм добавляли 480 мкл PBS и 20 мкл 10% раствора Tween 20, инкубировали пробирки при 90С в течение 10 минут, затем центрифугировали 15 минут при 10000g и помещали на лед на 2 минуты. Образовавшийся вверху пробирки слой парафина и супернатант удаляли. Депарафинизированную ткань промывали 1 мл 96% этанола. После удаления этанола добавляли 400 мкл 1М раствора тиоцианата натрия и оставляли в термошейкере на 12 часов при 37С. Затем центрифугировали образец 20 минут при 10000g, удаляли супернатант, промывали ткань 400 мкл PBS. После удаления PBS добавляли 360 мкл лизирующего буфера ATL (Qiagen, DNeasy Blood and Tissue Kit) и 40 мкл протеиназы К (20 мкг/мкл), инкубировали 12-16 часов при 55С на термошейкере. Затем еще дважды добавляли по 40 мкл протеиназы К (20 мкг/мкл) с интервалом 6-8 часов.
После полного лизиса ткани осуществляли экстракцию ДНК. Для этого к лизату добавляли 400 мкл буфера AL (Qiagen, DNeasy Blood and Tissue Kit), инкубировали 10 минут при 70C, затем добавляли 440 мкл 96% этанола. Далее экстракцию осуществляли при помощи колонок DNeasy Mini spin columns (Qiagen) в соответствии с инструкцией к набору Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit. Ha последнем этапе ДНК элюировали 50 мкл воды. Качество выделенной ДНК контролировали путем электрофореза в 2% агарозном геле и измерения концентрации с помощью спектрофотометра Thermo Scientific NanoDrop 1000. Полученный раствор ДНК хранили при -20С.
Выбор генов и участков генов для исследования
В настоящей работе изучался статус метилирования 4 генов: ESR1, BRCA1, CCND2, RARb2. При выборе генов для тестирования учитывались следующие два критерия:
высокая частота гиперметилирования при монолатеральном РМЖ
вовлеченность гена в патогенез РМЖ.
Статус метилирования оценивался в промоторных зонах генов в следующих участках (считая от сайта начала транскрипции): ESR1 +94+296 (включает 19 CG-nap), BRCA1 +209+394 (включает 7 CG-nap), CCND2 -1287-1098 (включает 11 CG-nap), RARb2 +36+211 (включает 10 CG-nap). С целью выбора наиболее CG-богатых областей промоторные участки были проанализированы с помощью программы MethPrimer (Li LC and Dahiya R, 2002). Праймеры для ПЦР-амплификации подбирались с помощью этой же программы. Критериями при их подборе были максимально близкое расположение фрагмента к сайту начала транскрипции, неспособность праймеров к отжигу на немоднфицированной бисульфитом натрия ДНК-матрице, а также способность амплифицировать фрагмент вне зависимости от его статуса метилирования.
Анализ метилирования ДНК
Бисульфитная обработка ДНК. Анализ метилирования проводился путем пиросеквенирования обработанной бисульфитом натрия ДНК (Kwabi-Addo В et al., 2007). Бисульфитная обработка конвертирует все неметилированные цитозины в урацил, при этом метилированные основания остаются неизмененными. Таким образом генерируется разница в нуклеотидной последовательности между метилированной и неметилированной ДНК, которая детектируется на этапе пиросеквенирования.
Бисульфитная обработка проводилась при помощи набора EpiTect Bisulfite Kit, Qiagen по протоколу, оптимизированному для образцов ДНК, полученных из архивных парафиновых срезов.
Пиросеквеннрование. Обработанную бисульфитом натрия ДНК амплифицировали в ПЦР-реакции объемом 25 мкл. Реакционная смесь содержала 1х HotStar Taq буфер, 2.0 единицы активности полимеразы Hot Star Taq (Qiagen), 1.6 мМ MgC12, 5 пмоль каждого праймера из соответствующей пары, 200 мкмоль каждого дНТФ, 2 мкл обработанной бисульфитом натрия ДНК. ПЦР-циклирование состояло из активации полимеразы в течение 10 минут при 95С; 50 циклов, включающих шаги денатурации (95С, 15 сек), отжига праймеров (52-60С, 30 сек), элонгации (72С, 30
сек); а также шага завершающего синтеза при 72С в течение 5 минут. Обратный праймер в каждой из пар содержал биотин на 5'-конце, необходимый для последующего формирования одноцепочечной ДНК. Перед реакцией секвенирования качество ПЦР-продукта оценивалось путем электрофореза в 2% агарозном геле. Формирование одноцепочечной ДНК проводилось при помощи Pyrosequencing Workstation (Biotage, Uppsala, Sweden). Полученный в ходе ПЦР амплификат иммобилизировали на покрытых стрептавидином микрошариках streptavidin-coated Sepharose beads (GE Health Care, Uppsala, Sweden), промывали, денатурировали, после чего биотинилированную ДНК на микрошариках помещали в буфер для отжига (20 мМ Tris, 2 мМ ацетата магния, рН=7.6, V=40 мкл), содержащий 15 пмоль праймера для секвенирования.
Количественный анализ метилирования осуществлялся на приборе PSQ 96МА с использованием набора PyroGoldSQA Reagent Kit, результаты оценивались с помощью программного обеспечения Pyro Q-CpG (Biotage, Uppsala, Sweden). Универсальная обработанная бисульфитом полностью метилированная и неметилированная ДНК (EpiTect Control DNA Set; Qiagen) использовалась в качестве контроля.
Уровень метилирования каждого отдельного CG-локуса внутри каждого исследуемого фрагмента вычислялся на основании сравнения высоты пиков метилированного основания (Cm) и неметилированного основания (Cum) по следующей формуле:
Г Ст 1
Метшироваиие(%) = I— г * 100
L(Cm + Cum) J
Уровень метилирования каждого гена в каждом образце вычислялся как среднее из уровней метилирования всех входящих в данную область CG-сайтов.
Для определения частоты гиперметилирования в опухолях был выбран пороговый уровень, который рассчитывался для каждого гена следующим образом (lehmann Uetal., 2005):
N(mean) + 2SD, где N(mean) - средний уровень метилирования в норме, SD -стандартное отклонение.
Определение экспрессии мРНК ESR1
Выделение РНК. мРНК была выделена из 33 архивных патоморфологических образцов опухолевой ткани (14 билатеральных и 19 монолатеральных карцином
молочной железы). Архивные срезы депарафинизировали с помощью ксилола, регидратировали путем последовательной инкубации в 96%, 80% и 70% этаноле и лизировали на протяжении 16 часов при 60 С. Лизирующий буфер состоял из 10 мМ Tris-HCl, рН 8.0, 0.1 мМ EDTA, 2% SDS, и 500 мкг/мл протеиназы К. Экстракция производилась кислым фенолом (рН 4,0) и хлороформом. Затем мРНК осаждали изопропанодом в присутствии 1 мкл гликогена (20 мг/мл), однократно промывали 70% этанолом и растворяли в 10 мкл воды. Полученный раствор РНК использовали для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) в реакции обратной транскрипции. Для реакции обратной транскрипции использовали фермент обратную транскриптазу M-MLV (Promega) в количестве 50 единиц. Реакция проходила в объеме 20 мкл и включала, помимо M-MLV, 4 мкл 5-кратного буфера, 1 мкл праймеров - случайных гексануклеотидов (11 ое/мл), 1 мкл смеси дНТФ (содержащей по 10 мМ каждого), 8 единиц ингибитора РНКаз и 10 мкл раствора РНК. Использовался следующий температурный режим: 20С в течение 5 минут, 38С в течение 30 минут, 95С в течение 5 минут.
ПЦР в режиме реального времени. Измерение экспрессии ESR1 проводилось при помощи ПЦР в режиме реального времени (real-time PCR) на оборудовании iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules). ПЦР-реакция (суммарный объем 20 мкл) содержала 1 мкл раствора кДНК, 2.5 ед. ДНК-полимеразы "Thermostar", 1-кратный ПЦР-буфер (рН 8.3), 2.5 мМ MgCb, 200 мкМ каждого из нуклеотидтрифосфатов, 0.4 мкМ прямого и обратного праймеров гена-рефери (SDHA) или гена-мишени (ESR1), флуоресцентный краситель SYBR green І в концентрации 0,2х (исходный раствор ЮОООх; Molecular Probes). Реакция начиналась с 10-минутной активации ДНК-полимеразы при 95С; далее проводилось 45 циклов амплификации (денатурация: 15 сек при 95С; отжиг: 30 сек при 60С; синтез: 30 сек при 72С).
Уровень экспрессии оценивался путем вычисления соотношения относительных количеств копий кДНК гена-мишени и гена-рефери. Для получения дшшых значений использовался метод построения стандартных кривых (Johnson MR et al., 2000).
Статистический анализ данных
Статистическая обработка данных проводилась с использованием программного обеспечения SPSS Version 13. Различия считались значимыми при р<0.05. Уровень метилирования промотора каждого гена в каждом образце вычислялся как среднее из метилирования всех исследуемых CG-сайтов (Ст/(Ст+Сит)) и
выражался в %. Двухсторонний непараметрический тест Манна-Уитни использовался для сравнения уровня метилирования 4 генов в разных группах. Сравнение частот гиперметилирования в МРМЖ и БРМЖ проводилось при помощи теста хи-квадрат Пирсона.
Конкордантность по статусу метилирования внутри билатеральных пар опухолей оценивалась по каждому исследованному гену в отдельности. «Конкордантной» считалась пара, в которой обе опухоли были либо гиперметшшрованы (m/m), либо не метилированы (um/um), а «дискордантной», соответственно, пара, состоящая из одной гиперметилированной карциномы и одной опухоли без указанной модификации (m/um). Обнаруженная в эксперименте реальная конкордантность сравнивалась с расчетной величиной.
Ожидаемые величины конкордантности рассчитывались, исходя из следующих посылок: если предположить, что частота события (гиперметилирования) равняется р, то вероятность случайного сочетания двух гиперметилированных опухолей в паре равняется р". Частота противоположного события - отсутствия метилирования (q) -составляет q= 1 -р, а вероятность случайного сочетания двух неметилированных опухолей в паре составляет q2. Таким образом, ожидаемое число конкордантных пар (m/m+ um/um) будет равняться p2+q2, а дискордантных (m/um) - 2pq (Imyanitov EN et al., 2000). Экспериментальные и расчетные величины сравнивались при помощи теста хи-квадрат Пирсона.
Для оценки корреляций между метилированием четырех генов, а также между метилированием и клинико-биологическими параметрами использовался тест ранговой корреляции Спирмена.
