Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1 Заболеваемость раком желудка, проблемы диагностики 12
1.2 Белковые маркеры рака желудка 12
1.3 Молекулярно-генетические маркеры рака желудка 15
1.3.1 Генетические изменения 16
1.3.2 Эпигенетические изменения 21
1.4 Циркулирующие ДНК 27
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 30
2.1 Материалы 30
2.1.1 Клинические характеристики здоровых доноров и больных раком желудка 30
2.1.2 Реактивы и препараты 32
2.1.3 Оборудование 33
2.2 Методы 33
2.2.1 Взятие образцов крови 33
2.2.2 Приготовление элюатов с поверхности форменных элементов крови 34
2.2.3 Определение концентрации циркулирующих ДНК в крови 34
2.2.3.1 Метод сорбции циркулирующих ДНК на модифицированном стекле 34
2.2.3.2 Линии клеток и методы культивирования 35
2.2.3.3 Приготовление раствора ДНК с целью построения калибровочной кривой... 35
2.2.3.4 Определение концентрации циркулирующих ДНК в плазме и элюатах, выделенных с клеточной поверхности форменных элементов клеток крови 36
2.2.4 Определение статуса метилирования промоторных областей генов опухолевой супрессии MGMT, р15 и hMLHl в цирДНК 37
2.2.4.1. Выделение циркулирующих ДНК из плазмы и элюатов с клеточной поверхности 37
2.2.4.2 Бисульфитная модификация ДНК 37
2.2.4.3. Получение геномной ДНК для положительного и отрицательного контроля в мет-ПЦР 38
2.2.4.4. Полимеразная цепная реакция, специфичная к метилированию 38
2.2.4.5. Визуализация продуктов мет-ПЦР 41
2.2.5. Иммунохимический анализ маркеров РЭА, СА 19.9 и СА 72.4 в плазме крови больных раком желудка и здоровых людей 41
2.3. Статистическая обработка данных . 41
ГЛАВА 3. Собственные результаты 43
3.1 Исследование концентраций циркулирующих ДНК 43
3.1.1. Приготовление растворов ДНК для построения калибровочных кривых 43
3.1.2 Концентрация цирДНК плазмы и связанных с поверхностью форменных элементов в крови здоровых доноров 43
3.1.3 Особенности циркуляции внеклеточных ДНК в крови больных раком желудка 46
3.2 Анализ статуса метилирования промоторных областей генов mmm опухолевой супрессии р15, MGMT, hMLHl в циркулирующих ДНК плазмы и связанных с поверхностью форменных элементов в крови клинически здоровых людей и больных раком желудка 54
3.2.1. Контроль на наличие ДНК в вьщеленных образцах ДНК плазмы и связанных с клеточной поверхностью 54
3.2.2. Исследование профиля метилирования промоторной области гена р15 55
3.2.3. Исследование профиля метилирования промоторной области гена hMLHl 56
3.2.4 Исследование профиля метилирования промоторной области гена MGMT 57
3.3. Сравнительное исследование чувствительности и специфичности анализов эпигенетических маркеров (р15, MGMT, hMLHl) в цирДНК и стандартных онкоспецифических белков (РЭА, СА 19.9, СА 72.4) при раке желудка 62
3.3.1 Иммунохимический анализ онкомаркеров РЭА, СА 19.9, СА 72.4 62
3.3.2. Сравнительный анализ методов основанных на определении белковых маркеров и статуса метилирования генов опухолевой супрессии 64
Заключение 68
Выводы 81
Практические рекомендации 82
Список литературы 83
- Генетические изменения
- Циркулирующие ДНК
- Концентрация цирДНК плазмы и связанных с поверхностью форменных элементов в крови здоровых доноров
- Исследование профиля метилирования промоторной области гена MGMT
Введение к работе
Актуальность Несмотря на тенденцию к снижению заболеваемости рак желудка (РЖ) является четвертой по частоте формой злокачественных новообразований (около 8,6 от общего числа онкологических больных в мире) и занимает второе место в структуре общей летальности от злокачественных новообразований (700.000 смертей ежегодно) [106]. Самый высокий показатель 5-летней выживаемости больных раком желудка 52% зафиксирован в Японии, где с 1960 г. в рамках общей программы медицинского обследования внедрен метод фотофлюрографии. Этот опыт не нашел широкого применения в других странах мира в связи с необходимостью больших затрат, чем объясняется более низкий показатель 5-летней выживаемости (27%) в странах Западной Европы [10]. В России по сравнению с 1990 годом за последнее десятилетие число вновь выявленных больных раком желудка снизилось на 16%, однако в общем числе умерших от злокачественных новообразований органов пищеварения на рак желудка приходится 38,5%. Среди 45 стран мира Россия стоит на 1-м месте по уровню смертности от данного заболевания [1]. Статистические данные объясняются поздним выявлением РЖ, когда хирургический метод (основной метод радикального лечения этого заболевания) лечения является малоэффективным. Показатель 5-летней выживаемости при радикальном лечении составляет: при I стадии 80-100%; II 40-65%; III 15-35%; IV 0%. Однако частота обнаружения ранних форм рака желудка не превышает 10-20%, а доля больных раком III стадии, поступающих в стационар, составляет 31,4 IV стадии 42,6%, и у 83% больных при первично выявленном раке желудка уже существуют регионарные метастазы [12]. Причинами поздней диагностики РЖ при современной возможности эндоскопии, рентгенографии остается несовершенство этих методов для распознавания патологии в пределах слизистой оболочки желудка [15], что объясняется сложностью визуальной дифференциальной диагностики ранних форм рака и доброкачественных изменений, противоречивыми данными морфологических исследований, недостаточной квалификацией врачей, использованием несовершенной аппаратуры и экономические причины. Не отвечают поставленной задаче и применяющиеся сегодня иммунохимические и биохимические методы, основанные на выявлении белковых онкомаркеров, концентрация которых повышается в крови пациентов при наличии сформировавшейся опухоли. При РЖ чаще всего используются следующие маркеры: альфа-фетопротеин (АФП), раковый антиген С А 72.4 (СА 72.4), раковый эмбриональный антиген (РЭА), углеводный антиген С А 19.9 (СА 19.9) [5]. Однако даже одновременное исследование всех опухолевых маркеров не приводит к существенному повышению чувствительности и специфичности первичной диагностики РЖ в силу того, что эти белковые маркеры характеризуются поздним появлением в крови и не все онкотрасформированные клетки экспрессируют повышенный уровень искомых маркеров. Основным применением данных маркеров является мониторинг течения заболевания, оценка эффективности лечения и отслеживание рецидива опухоли Таким образом, существуют объективные причины, осложняющие выявление ранних форм рака желудка. Отсутствуют критерии формирования групп риска среди населения, есть сложности экономического характера, есть недостатки в техническом оснащении соответствующих служб и имеются проблемы, связанные с инструментальной диагностики. несовершенством клинико- Совершенно очевидно, что для кардинального решения проблемы диагностики рака желудка необходимы надежные и простые методы детекции опухолевого процесса, которые позволяли бы выявлять небольшую по размерам опухоль на доклинических стадиях (рак in situ) и ранние стадии злокачественного перерождения клеток у пациентов с предраковыми заболеваниями. Известно, что трансформация клеток в раковые и прогрессия онкологического процесса связаны с накоплением генетических и эпигенетических изменений в геноме, поэтому анализ подобных изменений с использованием современных молекулярногенетических методов представляется в настоящее время особенно перспективным для ранней онкодиагностики. Высокая частота обнаружения подобных изменений генов в ткани опухоли открывает большие возможности для разработки методов ранней диагностики рака желудка. Однако, анализ ткани опухоли это инвазивньш метод и проводится при измененной слизистой оболочке, что снижает ценность данного метода для выявления ранних стадий рака желудка. Наиболее перспективным для ранней диагностики рака желудка представляется выявление ДНК-онкомаркеров в крови. Это стало возможным в связи с обнаружением в цирДНК плазмы крови онкологических больных генетических и эпигенетических изменений, идентичных таковым в ДНК клеток опухоли [64]. Использование эпигенетических изменений, а именно анализ статуса метилирования промоторных областей генов опухолевой супрессии, в качестве маркеров онкологического заболевания имеет ряд преимуществ по сравнению с генетическими изменениями ДНК. Вопервых, на сегодняшний день известно, что аберрантное метилирование ДНК является одним из наиболее распространенных и ранних событий, приводящих к опухолевой трансформации клетки при раке желудка [62]. Во-вторых, чувствительность детекции аберрантно метилированного гена в условиях избытка неметилированного аллеля выше, чем мутантного аллеля [99]. В-третьих, описано большое число генов, инактивированных путем изменения статуса метилирования CpG-островков промоторных областей, характерных для онкотрансформированных клеток [62, 81]. Накоплен большой материал об эпигенетических изменениях, наблюдающихся в образцах опухолевой ткани при раке желудка. Однако исследователями отмечается, что частота выявления онкомаркеров в цирДНК плазмы крови больных раком желудка значительна ниже по сравнению частотой их выявления в опухолевой ткани [108]. Как было показано в недавних исследованиях, внеклеточные ДНК не только свободно циркулируют в плазме крови, но также могут быть связаны с поверхностью форменных элементов крови [34]. Эти данные позволяют надеяться, что проблема более низкой частоты
Генетические изменения
Мутации генов являются одной из главных причин, лежащей в основе канцерогенеза, ведущей к активации протоонкогенов (K-Ras, (З-catenin) или инактивации генов опухолевой супрессии (р53, АРС, ріб). В основном они возникают в результате замещения, инсерции, делеции нуклеотидов. На данный момент обнаружено небольшое количество генов, вносящих вклад в развитие рака желудка в результате мутаций. Наиболее исследуемые при этом онкологическом заболевании гены р53, АРС, p-catenin, K-Ras, BRAF [79].
Ген р53- ген опухолевой супрессии. Продукт данного гена является модулятором транскрипции, специфически взаимодействует с ДНК, трансактивируя гены, являющиеся ингибиторами циклинзависимых киназ и участвующих в апоптозе клеток. Мутации в гене р53 самые часто встречающиеся при раке желудка. Большинство описанных мутаций преимущественно располагаются в 4-11 экзонах с горячими точками в кодонах 175, 248, 273, 282, 245, 213. Наиболее часто происходит замена пары гуанин-цитозин на аденин-тимин в CpG сайтах [134]. Частота выявления мутаций гена р53 в опухолевой ткани больных раком желудка варьирует от 0 до 77% [20, 23, 52, 70, 75, 79, 129, 134]. Данные о корреляции между частотой мутирования гена р53 и клинико-патологическими характеристиками противоречивы. Согласно многим исследованиям, частота мутаций в гене р53 возрастает при локализации опухоли в кардиальном отделе по сравнению с дистальными отделами желудка [52, 134]. Ряд исследователей говорят о преобладании мутаций в данном гене при интестинальном типе рака [60, 79, 130, 138], другие подобной корреляции не находят [100, 129]. Имеется ряд наблюдений, что мутации в р53 чаще детектируются в метастазах, чем в очагах первичной опухоли рака. Выявлен высокий процент обнаружения мутированного гена р53 при высокой степени дисплазии, метаплазии эпителия желудка (до 67%) [100,134]. С другой стороны, ряд авторов говорит о мутациях в р53 преимущественно на ранней стадии дисплазии [105, 60] и при хроническом гастрите, ассоциированном с Н. Pylori (52%) [26]. Подобные расхождения понижают специфичность метода диагностики рака желудка, основанного на детекции мутаций в гене р53.
Ген АРС. Продукт гена обеспечивает пути деградации протоонкобелка р-катенина. Инактивация гена АРС приводит к усилению транскрипции и увеличению времени жизни транскрипционного фактора р-катенина, который ведет к активации циклинзависимых киназ, обусловливающих вхождение клетки в фазу S клеточного цикла [8]. Изменения гена АРС- ключевой момент в развитии рака толстой кишки (более 90% опухолей толстой кишки имеют изменения данного гена) [100]. У больных с заболеваниями желудка мутации гена АРС чаще встречаются при доброкачественных заболеваниях (полипы желудка) (76%), чем при аденокарциноме (до 32,4%) [23, 52, 70, 79, 88, 100]. Следует отметить, что корреляции между частотой мутированного АРС и степенью дисплазии/полипа желудка, а также между другими клинико-патологическими характеристиками не наблюдается.
Мутации в сопряженном с геном АРС гене P-catenin при раке желудка в опухолевой ткани наблюдаются с частотой от 0-27% [24, 68, 69, 88] и специфичны для злокачественного процесса. W. Park с соавторами отмечают корреляцию мутированного гена с интестинальным типом рака [68].
Ген K-ras принадлежит семейству генов RAS [29]. Белки семейства RAS обладают ГТФазной активностью и являются важным звеном в регуляции сигнальной трансдукции. При стимулировании клеток факторами роста активированный RAS белок стимулирует митоген-активированные белки киназного пути (RAS-RAF-MEK-ERK-MAP киназный путь), который играет важную роль в клеточной пролиферации и часто активирован в опухолевой клетке [29]. Мутации в гене K-ras могут приводить к появлению постоянно активированной GTP-связанной формы белка. Высокий процент точечных мутации в гене K-ras наблюдается при раке поджелудочной железы (70 - 100%), толстой кишки (7 - 80%), легкого (10 - 50%) [64, 103]. Частота встречаемости точечных мутаций гена K-ras при раке желудка в опухолевой ткани варьирует в диапазоне 0-28% [20, 28, 29, 64, 70, 91, 102]. При хронических гастритах, ассоциированных с Н.руїогі, в образцах ткани, взятой из патологического очага, также обнаруживаются мутации гена K-ras. Т. Hiyama с соавторами обнаружили, что частота встречаемости мутации этого гена в группе больных хроническим гастритом, ассоциированном с Н.руїогі, выше у больных, имеющих сопутствующее заболевание- рак желудка. [91]. Отмечается корреляция частоты мутаций гена K-ras с гистологическим типом опухоли (выше при дифференцированном типе рака) [91].
Ген E-cadherin (CDH1), продукт гена относится к семейству кадхеринов-трансмембранных кальций-зависимых гликопротеинов. Наружная часть белка принимает участие в межклеточных контактах, осуществляя кальций - зависимую межклеточную адгезию. Его внутриклеточная часть связывается с Р-катенином, вследствие чего р-катенин перестает функционировать в качестве трансактивирующего транскрипционного фактора. Генетические или эпигенетические изменения гена Е-кадхерина приводят к освобождению р-катенина и индукции его транскрипционной активности. [8]. В результате стимулируется размножение клеток, нарушаются межклеточные контакты, и увеличивается способность клеток к инвазии. Относительно высокая частота мутаций (28-56%) в гене E-cadherin наблюдается при наследственном диффузном раке желудка [60]. Однако в развитии спорадического рака желудка мутации данного гена не играют ключевой роли.
Было показано, что мутации в генах B-raf, BAD, ЕРНВ2, часто обнаруживаемые при меланоме, колоректальном раке, практически не выявляются у больных раком желудка [29, 37, 74, 86, 102].
Одним из распространенных явлений, приводящих к опухолевому перерождению клетки, является изменение числа копий последовательности ДНК, которые выявляются методом сравнительной геномной гибридизации (CGH). В ходе этого метода одну ДНК-пробу получают из анализируемых тканей пациента, другую — из здоровых тканей. Далее пробы одновременно гибридизуют с хромосомами человека. Различия в результатах гибридизации позволяют выявить увеличение или уменьшение числа копий хромосомных районов в исследуемом образце. Этим методом можно обнаружить утраченные области генома размером около 10 млн. пар оснований [13]. Амплификация (повышение числа копий) может быть обнаружена и в случае меньшего размера затронутых участков генома, но при условии большого числа повторов в этих участках. Отдельные гены становятся видимыми, если они амплифицированы 40 и более раз.
Показано, что увеличение количества тандемно-повторенных копий ДНК (за счет амплификации, транслокации) стимулирует активацию соответствующего протоонкогена. Например, при раке желудка амплификация ДНК в областях хромосом 17ql2, 10q26, 7q31, 8q23-24, 20ql3, соответственно усиливает активность онкогенов ERBB2, K-SAM, С-МЕТ, c-MYC, STK6 [77,138].
Циркулирующие ДНК
Описанное в предыдущей главе исследование молекулярно-генетических маркеров было выполнено на образцах опухолевых тканей, полученных при помощи биопсии или после операции. Однако, проведение биопсии возможно лишь при визуально детектируемой опухоли, и, таким образом, этот метод не может быть использован ни для выявления ранних стадий развития опухолей ни для мониторинга рецидивов. Наиболее перспективным представляется неинвазивное выявление онкомаркеров путем анализа биологических жидкостей, таких как кровь, моча, бронхо альвеолярный смыв, внутрипротоковая жидкость и другие [6, 64]. Разработка таких методов анализа стала возможной сравнительно недавно, когда было обнаружено, что свободные циркулирующие ДНК (цирДНК) присутствуют в плазме крови у здоровых людей, а при некоторых заболеваниях (аутоиммунные патологии, диабет, травмы, опухоли) содержание ДНК в плазме даже заметно возрастает [27, 64]. Особенный интерес вызвал тот факт, что в цирДНК крови больных выявляются изменения (генетические и эпигенетические), идентичные изменениям ДНК в клетках опухоли [27]. Однако, в большинстве случаев частота выявления молекулярно-генетических маркеров в плазме крови больных раком значительна ниже по сравнению с частотой их выявления в образцах опухолевой ткани [64].
Были предприняты попытки поиска молекулярно-генетических и эпигенетических маркеров, в составе циркулирующих ДНК крови больных раком желудка. J-Y. Wang с соавторами обнаружили мутации генов р53, АРС в образцах сыворотки крови 59% больных раком желудка, у которых эти же мутации были обнаружены в опухолевой ткани [23]. В работе T-L. Lee с соавторами [49] сравнивали частоту выявления метилированного гена р15 в опухолевой ткани и в пуле ДНК выделенной из сыворотки крови. В образцах ткани 68% больных было обнаружено гиперметилированние промоторной области гена, а у 81% больных из этой группы аналогичные изменения были обнаружены и в ДНК сыворотки.
При сравнении статуса метилирования гена ріб в биоптатах и в сыворотке Y. Kanyama с соавторами обнаружили метилирование в сыворотке только у 26% пациентов, в биоптатах которых было обнаружено искомое метилирование гена р16 [50].
На основании исследования метилирования генов АРС, E-cadherin, hMLHl, ТІМР-3 в сыворотке и соответствующих образцах ткани аденокарциномы желудка W.K. Leung с соавторами пришли к выводу, что детекция гиперметилированной формы гена в сыворотке позволяет со 100% уверенностью говорить о присутствии этого же изменения в соответствующей опухолевой ткани [108].
Как было показано С.Н. Тамкович с соавторами в недавних исследованиях, внеклеточные ДНК не только свободно циркулируют в плазме крови, но также связаны с поверхностью форменных элементов крови. Связанные с поверхностью форменных элементов крови цирДНК составляют основную часть цирДНК крови здоровых доноров (более 90%), а при опухолях различной локализации наблюдается изменение соотношения между свободными цирДНК плазмы и связанными с клеточной поверхностью цирДНК [34]. Следует также отметить, что в составе цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, как и в ДНК плазмы, обнаруживаются онкоспецифические последовательности ДНК [89]. Использование в ПЦР суммарной внеклеточной ДНК крови позволяет существенно повысить чувствительность анализа метилирования генов опухолевой супрессии. Т.Э. Скворцовой с соавторами было показано, что гиперметилированная форма генов RARp2 RASSF1A, HIC-1 выявляется в ДНК плазмы крови у 15-55% больных раком молочной железы, а в суммарной ДНК у 65-90% больных [31]. Эти данные позволяют надеяться, что проблема более низкой частоты детекции молекулярно-генетических маркеров в крови по сравнению исследованием опухолевой ткани при раке желудка может быть успешна преодолена.
В настоящее время с успехом проводятся исследования онкоспецифических последовательностей во внеклеточных ДНК других биологических жидкостей при онкологических заболеваниях различной локализации. Большую часть всех злокачественных новообразований человека составляют опухоли, происходящие из выстилающего полости тела эпителия. Слущиваясь, опухолевые клетки попадают в просвет соответствующего органа и выводятся из организма. Таким образом, выявление в естественных выделениях организма специфических ДНК-маркеров является чувствительным способом диагностики и мониторинга опухолей соответствующего органа. При раке толстой и прямой кишки проводится анализ кала, при раке поджелудочной железы исследуется ДНК секрета поджелудочной железы, при раке предстательной железы и мочевого пузыря ДНК мочи [64]. При раке желудка подобные исследования не нашли широкого распространения. Очевидно, это связано,с трудностями забора и ограниченным выделением в естественные биологические жидкости необходимого для анализа материала.
Таким образом, несмотря на успехи, достигнутые в развитии молекулярно-диагностических методов онкодиагностики, в диагностике рака желудка остаются нерешенными вопросы, связанные с повышением чувствительности и специфичности этих методов. Большинство генетических и эпигенетических изменений, перечисленных в обзоре генов, имеют место не только при раке желудка, но и при незлокачественных заболеваниях. До сих пор не ясно, могут ли молекулярно-генетические (и эпигенетические) маркеры, обнаруженные в доброкачественных новообразованиях, свидетельствовать о возможном злокачественном перерождении опухоли. Необходим анализ корреляции генетических и эпигенетических модификаций с возрастом, поскольку существуют данные о накоплении таких изменений со временем. По-видимому, необходим дальнейший поиск генов, избирательно задействованных в развитии рака желудка.
Тем не менее, очевидна перспективность развития молекулярно-генетических методов анализа и направления, которые позволят повысить их диагностическую ценность. Использование суммарных циркулирующих ДНК крови, повышение чувствительности и специфичности ПЦР анализа за счет детекции продукта реакции в реальном времени, совместное использование нескольких маркеров, долговременные исследования, направленные на выявления корреляций обнаруженных маркеров с развитием опухолей, вполне вероятно позволят в ближайшее время создать востребованные в практической медицине диагностические тесты.
Концентрация цирДНК плазмы и связанных с поверхностью форменных элементов в крови здоровых доноров
Концентрация циркулирующих ДНК в плазме клинически здоровых людей варьировала от 0 до 28 нг/мл и в среднем составляла 10 нг/мл. Концентрация цирДНК плазмы здоровых мужчин (среднее значение 13 нг/мл) достоверно не отличалась от концентрации цирДНК плазмы здоровых женщин (8 нг/мл) (р=0,1) (табл. 5). Полученные нами значения согласуются с данными других авторов, измерявших концентрацию цирДНК в крови здоровых доноров [64].
ЦирДНК, связанные с клеточной поверхностью, были выделены из ФБ-ЭДТА и трипсинового элюатов изолированно. Было обнаружено, что в трипсиновом элюате всегда присутствовала цирДНК, тогда как в ФБ-ЭДТА у 10% клинически здоровых людей концентрация цирДНК была ниже уровня детекции. Вклад каждого из элюатов в общую сумму цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, индивидуален для каждого обследуемого. В дальнейшем мы исследовали суммарную концентарцию цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, объединяя результаты, полученные ФБ-ЭДТА и трипсинового элюатов по отдельности (табл. 4).
Нами было обнаружено, что в крови клинически здоровых людей основная часть (в среднем 97%) цирДНК связана с поверхностью форменных элементов крови. При этом даже если в плазме цирДНК не были выявлены, значительное количество нуклеиновых кислот было обнаружено на поверхности форменных элементов крови. Достоверной корреляции между концентрацией цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, и количеством форменных элементов клеток крови (лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов) по критерию Спирмена не обнаружено.
Общая концентрация связанных с поверхностью клеток нуклеиновых кислот была достоверно выше у мужчин (среднее значение 703 нг/мл), чем у женщин (429 нг/мл) при сравнении выборок по критерию Манна-Уитни (р-0,04) (табл. 5). Исходя из представленных данных о корреляции концентрации циркулирующих нуклеиновых кислот на поверхности клеток с полом у клинически здоровых людей, становится ясно, что при исследовании уровня циркулирующих ДНК, связанных с клеточной поверхностью, при различных патологиях необходимо учитывать пол пациента.
Концентрация циркулирующих ДНК в плазме крови превышала норму у 21 пациента из 30 (70 %) варьировала от 32 до 537 нг/мл, и в среднем составляла 99 нг/мл крови. Концентрация цирДНК плазмы в пределах нормы регистрировалась у 5 из 17 мужчин (29%), и у 4 из 13 женщин (31%). У мужчин больных раком желудка среднее значение концентрации цирДНК плазмы составило 116 нг/мл, для женщин данный показатель составлял 77 нг/мл. Концентрация цирДНК в плазме больных женщин достоверно не отличалась от концентрации ДНК в плазме больных мужчин (р =0,07 при сравнении выборок по критерию Манна-Уитни) (табл. 5). Таким образом, концентрация цирДНК плазмы больных раком желудка достоверно выше по сравнению с контрольной группой, как у мужчин, так и у женщин, (критерий Манна-Уитни р=0,001).
Концентрация цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, у больных раком желудка достоверно не отличалась между мужчинами (442 нг/мл) и женщинами (685 нг/мл) (критерий Манна-Уитни р=0,17) (табл. 5).
У больных раком желудка мужчин отмечалось снижение концентрации цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, по сравнению со здоровыми мужчинами (табл. 5, критерий Манна-Уитни р=0,04). Было выявлено также снижение процента цирДНК, связанных с поверхностью клеток крови, от общего количества цирДНК (сумма цирДНК плазмы и связанных с поверхностью клеток крови) (в среднем 76% у больных и 98% у здоровых доноров, критерий Манна-Уитни р=0,01). У больных РЖ женщин показано отсутствие достоверных отличий концентрации цирДНК, связанных с клеточной поверхностью (табл. 5, критерий Манна-Уитни р 0,05), и их процента от суммарных цирДНК по сравнению с клинически здоровыми женщинами (87% и 97%, соответственно, критерий Манна-Уитни р 0,05).
Таким образом, независимо от пола пациента концентрация цирДНК плазмы у больных раком желудка достоверно повышена по сравнению со здоровыми людьми. Следует отметить, что концентрация цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, в крови мужчин, больных раком желудка, достоверно понижена по сравнению со здоровыми мужчинами (442 нг/мл и 703 нг/мл), тогда как между группами здоровых и больных раком желудка женщин не выявлены достоверные различия по концентрации цирДНК, связанных с клеточной поверхностью (рис. 4).
Интегральным методом выражения соотношения специфичности и чувствительности является построение характеристической кривой (ROC-кривой), которая визуально позволяет оценить диагностический эффективность показателя. Для оценки информативности показателя концентрации цирДНК плазмы мы проводили построение ROC-кривоіі с определением ее площади. Как видно из представленного графика, при пороговом значении концентрации цирДНК плазмы 25 нг/мл, рак желудка с максимальной специфичностью и чувствительностью можно отличить от клинической нормы (рис. 5).
Корреляционные связи концентрации цирДНК с клинико-патологическими параметрами не отличались при анализе в группах больных РЖ мужчин и женщин. Поэтому дальнейшее исследование особенностей циркуляции внеклеточных ДНК было проведено в объединенной группе больных РЖ независимо от пола.
В подгруппах больных РЖ, сформированных по критерию распространенности онкологического процесса (табл. 6, 7), было обнаружено, что среднее значение концентрации цирДНК плазмы у больных с неблагоприятными факторами прогноза (146 нг/мл) было достоверно повышено по сравнению с подгруппой с благоприятным прогнозом (72 нг/мл) (критерий Манна-Уитни р=0,04) (табл. 8).
Исследование профиля метилирования промоторной области гена MGMT
Рак желудка (РЖ) является четвертой по частоте формой злокачественных новообразований и занимает второе место в структуре общей летальности от злокачественных новообразований [106]. Статистические данные объясняются поздним выявлением РЖ, когда основной метод радикального лечения этого заболевания, а именно хирургический, является мало эффективным [12]. Совершенно очевидно, что решения проблемы ранней диагностики рака желудка необходимы надежные и простые методы детекции опухолевого процесса, которые позволяли бы выявлять опухоль на доклинических стадиях. Известно, что трансформация клеток в раковые и прогрессия онкологического процесса связаны с накоплением генетических и эпигенетических изменений в геноме [61, 93]. На сегодняшний день известно, что аберрантное метилирование ДНК является одним из наиболее распространенных и ранних событий, приводящих к опухолевой трансформации клетки при новообразованиях различной локализации, в том числе и при раке желудка [62]. С наибольшей частотой в опухолевой ткани при раке желудка распространено аберрантное метилирование трех генов опухолевой супрессии: р15, hMLHl, MGMT [41, 42, 126], что открывает большие возможности для разработки методов ранней диагностики рака желудка. Однако, проведение исследования ткани опухоли возможно лишь при визуально детектируемом изменении слизистой оболочки желудка, и, таким образом, этот метод не может быть использован ни для выявления ранних стадий развития опухолей, ни для мониторинга рецидивов. Наиболее перспективным представляется малоинвазивное выявление ДНК-онкомаркеров в крови. Разработка таких методов анализа стала возможной сравнительно недавно, когда было обнаружено, что в составе свободно циркулирующих ДНК (цирДНК) плазмы крови больных выявляются изменения (генетические и эпигенетические), идентичные изменениям ДНК в клетках опухоли [27]. Такие онкоспецифические ДНК присутствуют в крови в низкой концентрации, что приводит к более низкой частоте выявления эпигенетических маркеров в плазме крови больных раком желудка по сравнению с частотой их выявления в образцах опухолевой ткани [49].
В настоящее время получены убедительные данные, демонстрирующие, что внеклеточные ДНК не только свободно циркулируют в плазме крови, но также могут быть связаны с поверхностью форменных элементов крови [65]. Особый интерес вызвал тот факт, что в составе цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, как и в ДНК плазмы, обнаруживаются онкоспецифические последовательности ДНК [89]. Эти данные позволяют надеяться, что проблема более низкой частоты детекции гиперметилированных генов опухолевой супрессии в крови по сравнению с исследованием опухолевой ткани при раке желудка может быть успешна преодолена. Все сказанное определяет актуальность исследования распределения аберрантного метилирования генов опухолевой супрессии в циркулирующих ДНК крови больных раком желудка.
Поэтому целью нашего исследования являлась изучение особенностей циркуляции внеклеточных ДНК и распределения онкоспецифических последовательностей в крови больных раком желудка с разными клинико-морфологическими параметрами течения заболевания. Для решения этой цели ставились следующие задачи: Определить концентрацию цирДНК и изучить распределение между фракциями плазмы и связанных с клеточной поверхностью форменных элементов крови у больных раком желудка на разных стадиях заболевания. Проанализировать частоту выявления аберрантно метилированных форм генов опухолевой супрессии р15, MGMT, hMLHl в цирДНК плазмы и фракции связанной с поверхностью клеток крови у больных раком желудка на разных стадиях заболевания. Провести сравнительное исследование чувствительности и специфичности анализов эпигенетических маркеров (р15, MGMT, hMLHl) в цирДНК и стандартных онкоспецифических белков (РЭА, СА 19.9, СА 72.4) при раке желудка. Концентрация цирДНК плазмы здоровых доноров составила в среднем 10 нг/мл и не отличалась между мужчинами и женщинами, что согласуется с данными других авторов, измерявших концентрацию цирДНК крови в норме [64]. У больных раком желудка выявлено статистически достоверное увеличение концентрации ДНК в плазме крови по сравнению с клинически здоровыми людьми (99 нг/мл и 10 нг/мл, соответственно, критерий Манна-Уитни р=0,001). Статистически значимых отличий концентрации цирДНК плазмы в зависимости от пола у больных раком желудка нами выявлено не бьшо. Полученные нами данные о повышении концентрации цирДНК плазмы у больных раком желудка по сравнению с нормой согласуются с результатами работы Шапиро М. с соавторами [51], в которой методом радиоиммунного анализа была исследована концентрация цирДНК плазмы 17 больных раком желудка. Повышенные концентрации цирДНК плазмы были выявлены для рака молочной железы, толстой кишки, предастательной железы [64], однако, это изменение не является универсальным для опухолей различных локализаций. Например, при раке легкого показано отсутствие достоверного увеличения количества цирДНК в плазме крови [32]. Несмотря на интенсивные исследования, мало известно о механизмах, приводящих к изменению концентрации цирДНК плазмы крови при развитии онкологических заболеваний. Предполагается, что цирДНК могут гидролизоваться ДНК-гидролизующими ферментами крови. Известно, что за дезоксирибонуклеазную активность крови отвечает в основном ДНКаза I, хотя в крови выявляется также дезоксирибонуклеаза II, фосфодиэстераза и ряд других ферментов [4]. Активость ферментов в плазме определяется не только их концентрацией, но также регулируется ингибиторами нуклеаз, присутствующими в крови [3].
Проведенные недавно исследования выявили корреляцию повышения уровня цирДНК плазмы крови и понижения ДНКазной активности в плазме крови при онкологических заболеваниях предстательной железы и желудка по сравнению с нормой [2, 3, 47]. Причины снижения дезоксирибонуклеазной активности в крови онкологических больных по сравнению со здоровыми донорами не исследованы. Возможно, при развитии новообразований в крови повышается концентрация ингибиторов дезоксирибонуклеаз [3], что может приводить к снижению нуклеазнои активности. Кроме того, при некоторых типах рака наблюдается повышенный уровень протеаз крови, активность которых может приводить к деградации и снижению концентрации нуклеаз в плазме крови.
