Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературных данных 14
1.1 Общая характеристика натуральных киллерных клеток. Роль натуральных киллерных клеток при онкологических заболеваниях ... 14
1.2. Общие механизмы, регуляции эритропоэза, особенности при онкологических процессах 20
1.3. Роль ВНС, НК и эритропоэза в опухолевой прогрессии 34
Глава 2. Материалы и методы 47
2.1 Общая характеристика обследованной группы 47
2.2 Определение функциональной активности вегетативной нервной системы 48
2.3 Выделение мононуклеаров крови. Культивирование мононуклеаров крови 50
2.4 Мембраноцитотоксический тест. Оценка влияния нейромедиаторов на уровень цитотоксичности 51
2.5 Исследование цитотоксическои активности мононуклеаров регионарных лимфоузлов желудка, к аутологичным опухолевым клеткам рака желудка 51
2.6 Оценка колониеобразования из мононуклеаров крови. Определение эффекта нейромедиаторов на рост колоний 52
2.7 Статистическая обработка полученных результатов 53
Глава 3. Результаты исследований 54
3.1 Характеристика обследованной группы 54
3.2 Анализ ближайших и отдаленных результатов лечения больных раком желудка 62
3.3 Определение уровня цитотоксичности мононуклеаров регионарных лимфоузлов желудка к аутологичным клеткам рака желудка in vitro . 68
3.4 Сравнительная оценка натуральной киллерной активности клеток крови у больных раком желудка и здоровых людей (доноров). Взаимосвязь активности натуральных киллеров и результатов лечения больных раком желудка 69
3.5 Регуляторное влияние нейромедиаторов на НК - активность in vitro у больных раком желудка 72
3.6 Параметры периферической крови у больных раком желудка и здоровых людей (доноров) 75
3.7 Колониеобразующая способность мононуклеаров периферической крови in vitro у больных раком желудка и здоровых людей (доноров). 79
3.8 Колониеобразующая способность мононуклеаров периферической крови у больных раком желудка in vitro с разной активностью СО ВНС и у здоровых людей (доноров) 81
3.9 Воздействие нейромедиаторов на колониеобразование in vitro у больных раком желудка. Оценка эффекта нейромедиаторов у больных с различной НК - активностью и разным типом активности СО ВНС. 83
3.10 Взаимосвязь параметров активности СО ВНС, НК - активности и показателей колониеобразования эритроцитов у больных раком желудка; 87
Глава 4. Обсуждение собственных результатов 90
Заключение 107
Выводы 111
Список литературы 112
- Общая характеристика натуральных киллерных клеток. Роль натуральных киллерных клеток при онкологических заболеваниях
- Определение функциональной активности вегетативной нервной системы
- Определение уровня цитотоксичности мононуклеаров регионарных лимфоузлов желудка к аутологичным клеткам рака желудка in vitro
- Регуляторное влияние нейромедиаторов на НК - активность in vitro у больных раком желудка
Введение к работе
Актуальность темы.
Несмотря на определенные достижения в лечении и диагностике рака желудка за последнее время, их результаты нельзя назвать удовлетворительными. По данным Национального института рака США за 2006 год заболеваемость раком желудка среди жителей Северной Америки составляет 22,3 на 100 000 населения. Причем этот показатель среди мужчин почти на треть больше чем у женщин, 13,4 и 8,8 случаев на 100 000 населения соответственно. Смертность, по данным того же источника, 11,4 на 100 000. Смертность у мужчин составляет 6,7 и 4,7 у женщин на 100 000. Ежегодно на земном шаре заболевает раком желудка более 1 млн. человек (Мирабишвили В.М., 2001). В подавляющем большинстве стран заболеваемость раком желудка мужчин в 2 раза выше, чем у женщин. Уровень заболеваемости колеблется в достаточно широких пределах.
Так, по данным последнего издания МАИР, «Рак на 5 континентах» (т.7) максимальный уровень заболеваемости раком желудка отмечен у мужчин Японии (114,7), а минимальный - у белых женщин США (3,1). В структуре онкологической заболеваемости и смертности населения России рак желудка занимает второе место после рака легкого (Чиссов В.В., Старинский В.И., 2000). Ежегодно в России учитывается 48,8 тыс. новых случаев рака желудка, что составляет более .11 % от всех злокачественных опухолей. 45,0, тыс. больных умирают от рака желудка. Индекс достоверности учета составляет 0,92. Необходимо отметить, что наиболее высокий уровень заболеваемости раком желудка- характерен для мужчин в возрасте 70 лет и старше (307,2 случаев на 100 000 населения), что в 68,2 раза больше, чем у 30 летних, у женщин отмечена та же тенденция, но на меньших в 2 раза показателях (Мирабишвили В.М., 2001).
По уровню заболеваемости раком желудка Россия занимает 2-е место в мире после Японии.
По данным годового отчета онкологической службы г. Новосибирска за 2006 год заболеваемость раком желудка составляет 30,8 на 100 000 населения, что сопоставимо с аналогичным показателем по России — 31,4. Больные с I-II стадией составляют 30,4%, сШ- 31,2 % , и с IV- 38,4%. Смертность от рака желудка по г. Новосибирску составляет 24,7, по России - 28,3 на 100 000 населения. Запущенность - 38%), летальность на 1-м году с момента установления диагноза до 55,5%>.
По сути дела, за последние 2 десятилетия в терапии рака желудка, исключая хирургическую тактику, не произошло никаких кардинальных изменений. Недостаточная результативность лечения данной патологии диктует не только усовершенствование традиционных методов лечения, но и более глубокое изучение этиологии и патогенеза рака желудка, поиск новых путей решения проблемы.
Одним из важных направлений в изучении патогенеза
злокачественных опухолей является исследование взаимодействия иммунной системы и злокачественной опухоли, в том числе при раке желудка. Активно изучается состояние клеточного и гуморального иммунитета у больных онкозаболеваниями (Теплоухова И.М. и др., 1991; Кшивец О.М.,1992; Takeuchi Н, 2001, 2003; Wald О., 2006).
Открытие в 70-х годах прошлого столетия феномена естественной клеточной цитотоксичности позволило предположить существование особого класса иммунокомпетентных клеток, получивших название натуральных или естественных киллеров — НК-клеток (Манских В.Н.,2006). Согласно данным литературы, важнейшим звеном противоопухолевой защиты организма является спонтанная клеточная цитотоксичность. В реализации данного феномена, помимо моноцитов/макрофагов, Т-
лимфоцитов важная роль отводится натуральным киллерным (НК) клеткам.
Данные клетки и, в частности НК, принимают активное участие в процессах
цитолиза вирусинфицированных клеток организма, бактерий и
внутриклеточных паразитов, обладают иммунорегуляторной активностью и
влияют на гемопоэз (Ломакин М.С., 1990; Семененя И.Н., 1991; Чекнев СБ.,
1993, 1995; Манских В.Н.,2006; Пинегин Б. В., Дамбаева С. В.,2007). С
другой стороны, сами опухолевые клетки способны угнетать активность НК
через продукцию ими ряда биоактивных веществ (простагландин Е2,
трансформирующий ростовой фактор (ТРФ)-|3) (Lotzova Е., 1987; Pardali К.,
Moustakas А., 2007). В последние годы четко показан механизм действия НК
- лимфоцитов, как первой линии защиты от злокачественных
новообразований, реализующийся при взаимодействии NKG2D рецепторов
со специфическими лигандами, экспрессирующимися на клетках с
поврежденной ДНК, которые обладают высоким потенциалом к озлокачествлению, а также на опухолевых клетках (Gasser S. & David Н. Raulet, 2006). Доказана важная роль НК-клеток в регуляции процессов пролиферации, дифференцировки и элиминации измененных клеток. Есть сведения о связи между активностью НК - клеток и выживаемостью больных злокачественными новообразованиями, в том числе, при раке желудка (Takeuchi Н., еа., 2001).
Вместе с тем, механизмы, лежащие в основе супрессии цитотоксической активности НК клеток крови у больных раком желудка, изучены недостаточно.
Важным в течении заболевания, прогнозе, выживаемости и эффективности послеоперационной терапии у больных раком желудка является наличие паранеопластических синдромов и, в частности, анемии.
Имеющиеся в литературе данные о природе анемии, механизмах ее развития при онкологической патологии свидетельствуют о чрезвычайной важности этого паранеопластического процесса. Поскольку одной из основ
жизнедеятельности организма является адекватная оксигенация, невозможно представить себе эффективное лечение той или иной патологии, не уделив достаточного внимания анемии. Существующие в литературе данные о качественных изменениях эритропоэза у больных с онкопатологией диктуют необходимость разработки патогенетически обоснованных методов коррекции нарушений в эритроне.
Общепризнанными факторами прогноза при раке желудка (РЖ) являются глубина инвазии опухоли, лимфогенное и гематогенное метастазирование, стадия заболевания, морфологическое строение опухоли и радикальность оперативного лечения (Егоров Д.Н. и др., 2006). Функциональное состояние организма и взаимодействие его адаптационных систем с опухолевым процессом изучены в меньшей степени, чем , основные характеристики новообразования. Тем не менее, в последние годы появились исследования, посвященные этой теме. Одной из основных адаптационных систем организма человека является" вегетативная нервная система (ВНС). Накоплен большой фактический материал, свидетельствующий о значительной роли ВНС в канцерогенезе (Абрамов В.В., 1998; Егоров Д.Н. и др., 2006). Показано, что высокий уровень активности симпатического отдела ВНС (СО ВНС) ассоциируется с худшими отдаленными результатами лечения злокачественных новообразований (Егоров Д.Н. и др.,2006; Егоров Д.Н., 1997; Абрамов В.В. и др., 1998). Описано преобладание тонуса симпатического отдела ВНС и снижение вариабельности сердечного ритма у больных раком молочной железы (Гарбуков Е.Ю., Слонимская Е.М., 1996, 1999).1 Одним из основных путей реализации регулирующего влияния ВНС на периферические органы и ткани является иммунная система (Абрамов В.В. идр.,1998).
Установлено влияние ВНС и ее нейромедиаторов на эритропоэз и активность ЕКК. Вместе с тем, считается совершенно неизученным вопрос о совместной роли ВНС, эритропоэза и НК в патогенезе опухолей, в частности
рака желудка. Изучение взаимодействий в этой области у больных злокачественными опухолями открывает новые возможности в прогнозировании течения заболевания, разработке дифференциального подхода к терапии и, в конечном итоге, улучшении результатов лечения рака желудка.
В связи с этим, цель работы: Охарактеризовать состояние вегетативной нервной системы, эритропоэза и цитотоксической активности натуральных киллеров у больных раком желудка. Оценить их взаимосвязь с особенностями клинического течения заболевания.
В процессе исследования решались следующие задачи:
Определить функциональное состояние отделов вегетативной нервной системы (ВНС) у больных раком желудка и оценить его взаимосвязь с особенностями опухолевого процесса.
Оценить активность НК - клеток крови у больных раком желудка с разной активностью отделов вегетативной нервной системы.
Охарактеризовать состояние периферического звена эритрона у больных раком желудка с разной активностью отделов вегетативной нервной системы.
Изучить характер регуляторного воздействия нейромедиаторов симпатического и парасимпатического отделов вегетативной нервной системы (адреналина, норадреналина и ацетилхолина) на функциональную активность НК - клеток и периферическое звено эритрона у больных раком желудка.
Провести анализ взаимосвязи состояния вегетативной нервной системы, цитотоксической активности НК - клеток, периферического звена эритрона с клиническим течением и исходом заболевания.
Основные результаты исследования и их новизна.
Впервые проведено комплексное изучение состояния НК, эритропоэза и функциональной активности ВНС у больных раком желудка. При этом
выявлена сопряженность изменений показателей НК-активности и эритропоэза с состоянием ВНС. Более выраженное снижение активности НК, максимальное снижение уровня гемоглобина и количества эритроцитов отмечено в группе больных РЖ с высоким уровнем активности симпатического отдела ВНС.
Получены новые данные о подавлении активности НК нейромедиаторами (адреналин, норадреналин) на ранних стадиях злокачественного процесса и повышение ее при местно-распространенных и распространенных формах рака желудка.
Впервые показано максимальное снижение уровня гемоглобина и количества эритроцитов в группе больных с высоким уровнем активности симпатического отдела ВНС, особенно при IV стадии заболевания. У больных с высоким уровнем активности симпатического отдела ВНС отмечается угнетение КОЕ-Э по мере прогрессирования заболевания, а в группе с низким уровнем активности симпатического отдела ВНС выявлены изменения противоположной направленности.
Проведённый нами анализ изменений в иммунной и кроветворной системах у больных раком желудка в зависимости от типа дифференцировки аденокарциномы, выявил некоторые различия у больных с разной активностью СО ВНС.
Впервые показано, что высокий уровень активности симпатического отдела ВНС у больных раком желудка ассоциируется со снижением естественной цитотоксичности, меньшей интенсивностью эритропоэза и худшей выживаемостью. Научная значимость работы.
Впервые проведено комплексное изучение состояния НК, эритропоэза и функциональной активности ВНС у больных раком желудка. При этом выявлена сопряженность изменений показателей НК-активности и эритропоэза с состоянием ВНС. Более выраженное снижение активности НК,
максимальное снижение уровня гемоглобина и количества эритроцитов отмечено в группе больных РЖ с высоким уровнем активности симпатического отдела ВНС.
У больных с высоким уровнем активности симпатического отдела ВНС отмечается угнетение КОЕ-Э * по мере прогрессирования заболевания, а в группе с низким уровнем активности симпатического отдела ВНС выявлено увеличение КОЕ-Э.
Впервые показано, что высокий уровень активности симпатического отдела ВНС у больных раком желудка ассоциируется со снижением естественной цитотоксичности, меньшей интенсивностью эритропоэза и худшей выживаемостью. Практическая значимость работы.
Впервые показаны различия клинического течения рака желудка, уровня естественной цитотоксичности НК-клеток и активности периферического звена эритрона в зависимости от типа вегетативной регуляции. Показана совместная роль ВНС, естественной цитотоксичности НК - клеток и периферического звена эритрона в патогенезе рака желудка. Выявленные изменения, зависящие от типа активности ВНС, расширяют знания о роли естественной цитотоксичности НК - клеток и периферического звена эритрона в клиническом течении рака желудка.
Полученные результаты позволяют рекомендовать метод комплексного обследования нервной, иммунной, и кроветворной систем у больных раком желудка с целью разработки дифференцированного подхода к лечению и* прогнозу клинического течения данной патологии.
Обнаруженное влияние нейромедиаторов симпатического и
парасимпатического отделов ВНС на цитотоксическую активность НК и эритропоэз, указывают на перспективу использования нейромодуляторов для коррекции выявленных нарушений у больных раком желудка с учётом стадии онкозаболевания и типа активности ВНС.
Основные положения, выносимые на защиту.
Показатели активности натуральных киллерных клеток и эритропоэза зависят от стадии рака желудка. Прогрессирование рака желудка сопровождается снижением противоопухолевой цитотоксической активности НК- клеток и ухудшением параметров эритропоэза.
Уровень активности симпатического отдела ВНС определяет особенности естественной цитотоксичности НК - клеток и периферического звена эритрона у больных с разными стадиями рака желудка.
Более низкие показатели 2"х, 3"х летней выживаемости у больных с высокой активностью симпатического отдела ВНС ассоциированы со снижением НК - активности и колониеобразующей способности < периферического звена эритрона.
Апробация материалов диссертации
Основные положения диссертации доложены и обсуждены: на отчётной конференции ГУ НИИ КИ СО РАМН (2003), научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы современной медицины» (Новосибирск, 2005), семинаре лаборатории нейроиммунологии Института клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН (Новосибирск, 2007), отчётном заседании кафедры хирургических болезней Новосибирского государственного университета (2007).
По теме диссертации опубликовано 11 научных работ. Объем и структура работы.
Диссертация изложена на 139 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов; результатов исследования, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа содержит 26 таблиц и 10 рисунков. Список литературы включает 95 отечественных и 146 зарубежных источников.
Общая характеристика натуральных киллерных клеток. Роль натуральных киллерных клеток при онкологических заболеваниях
Роль НК - клеток, как первой линии противоопухолевой защиты неоспорима. Имеется прямая связь между активностью НК - клеток и выживаемостью больных злокачественными новообразованиями и, в частности, при раке желудка (Takeuchi Н., еа., 2001).
Натуральные киллерные (НК) клетки были определены по их способности лизировать клетки опухолевых линий, вирус инфицированные и некоторые нормальные клетки организма с нарушенной цитодифференцировкой, без предварительной сенсибилизации, по отсутствию рестрикции по главному комплексу гистосовместимости, по независимости от антител, а также, кратковременной экспозиции с клетками-мишенями (Семененя И.Н.,1991; Коо G.C., Manyak C.L., 1991). 10-15% мононуклеаров периферической крови являются НК, в большинстве своём имеющих морфологию больших гранулярных лимфоцитов (БГЛ) (Шпарык Я.В., Билынский Б.Т.,1994, 1990; Лыков А. Н., Козлов В. А., 2001). НК являются CD3-, TCR (а, Р, 5, у)-, CD16+, CD56+ БГЛ (Чекнев С.Б.,1993, 1995, 1999; Engleman F.E., 1995; Ortlando J.R., 1991; Пинегин Б. В., Дамбаева С. В.,2007). Помимо вышеперечисленных антигенов, на поверхности клеточной мембраны НК экспрессированы антигены, характерные для Т-лимфоцитов (CD2, CD3, CD7, CD8), моноцитов/макрофагов (CDlla-c/CD18) (Семененя И.Н.,1991; Шпарык Я.В., Билынский Б.Т., 1994; Pistoia V. еа, 1989; Ray С.А. еа., 1992; Samstag Y. 1991; Tripp C.S., 1993). НК также экспрессируют селектины, р- интегрины, VLA-4, 5, 6 и антигенные детерминанты к гликопротеидам (Ludwig Н., Fritz Е., 1998). CD56 является гомофильной, адгезивной молекулой из семейства молекул адгезии клеток нервной системы (N-CAM) из суперсемейства иммуноглобулинов. Эта молекула также представлена на небольшой части Т-клеток. Молекула CD 16 (FcylllR) является низкоаффинным рецептором для Fc-фрагмента IgG. Эта молекула представлена не только на НК-клетках, но и практически на всех гранулоцитах, моноцитах/макрофагах. На НК-клетках имеются два пан-Т-клеточных антигена (CD2 и CD7), молекула CD8 - маркер Т-киллеров, а также молекулы адгезии CDlla и CD lib из семейства интегринов. Таким образом, NK-клетки не содержат поверхностных маркеров, типичных только для этой популяции (Пинегин Б. В., Дамбаева С. В.,2007).
Источником НК, циркулирующих в крови, является костный мозг (Levitt LJ. еа., 1991; Rabinowich Н:, еа.,1994). Зрелые НК-клетки выселяются из костного мозга и расселяются в различных органах и тканях. Они обнаруживаются в крови, где составляют 5—15% от всех лимфоцитов, в селезенке, печени и матке. Мало НК-клеток содержится в лимфатических узлах. Полупериод жизни зрелых НК-клеток на периферии составляет 7—10 дней (Пинегин Б. В., Дамбаева С. В.,2007).
В пользу самостоятельности пула НК может свидетельствовать факт существования лейкозов из БГЛ. Более того, показана возможность генерации НК из CD34+ CD33+Lin- in vitro при инкубации с рядом ростовых факторов (c-k.it, интерлейкин 2, 7, 15) (Aiba Y., 1997; McCubrey J.A., еа., 2000; Sentman Ch.L.,1991). О важности интерлейкина (ИЛ)-15 в генерации НК свидетельствует тот факт, что при развитии бипотенциального Т/НК (IL-2R (3+ TCR- клетки) предшественника в присутствии больших доз ИЛ-15 генерируются НК (Aiba Y., 1997; Carayol G., 1998; McCubrey J.A., еа., 2000; PuzanovU., 1997).
Имеются убедительные данные о противоопухолевой активности НК in vivo в отношении спонтанных и индуцированных канцерогеном опухолей. У мышей выявлена прямая зависимость между уровнем НК - активности и резистентностью к трансплантируемым сингенным опухолям (Пивник А.В., 2000; Barlozzari Т., 1985; Tiberghien Р., 1990). Однако у пациентов с хроническим лимфолейкозом при нормальном количестве НК определяется угнетение цитотоксической активности в отношении опухолевых клеток, обусловленное ингибирующим влиянием опухолевых клеток на НК (Poddack E.R., 1983; Rajaram N., 1990). В последнее время отмечена динамика снижения уровня НК в популяции здоровых людей и возрастание частоты опухолей (Чекнев СБ., 1999).
Начальным этапом цитолитического механизма является образование специфических коньюгатов между клетками-эффекторами и клетками-мишенями, с вовлечением в этот процесс CD1 la/CD 18 и CD2 на поверхности НК и их лигандов на поверхности клеток-мишений CD54- и CD58, соответственно. На стадии лизиса существенную роль играют продукты секреции азурофильных цитолитических гранул из цитоплазмы НК (Defino D., 1991). А именно, перфоринов, сериновых эстераз и протеогликанов, что приводит к формированию цилиндрических трансмембранных пор и к последующему осмотическому лизису клеток-мишеней (Johnson L.N., 1996). Помимо этого, в процессе цитолиза значимая роль отводится цитолитическому фактору НК, фактору некрозу опухоли (ФНО)-{3.
В большинстве случаев опухолевые клетки слабоиммуногенны. Защитную роль НК - клетки выполняют с помощью активационного рецептора NKG2D и активационных рецепторов семейства NCR. Неясным остается вопрос, при каком соотношении ингибиторных и активационных рецепторов НК-клетка может лизировать опухолевую клетку (Пинегин Б. В., Дамбаева С. В.,2007).
Определение функциональной активности вегетативной нервной системы
Исследование параметров вегетативной регуляции проводилось с использованием метода вариационной пульсометрии по Р.М.Баевскому (БаевскийР.М., и др., 1984), основанной на анализе колебаний (вариаций)-сердечного ритма. Определение функциональной активности BHG проводили через 2-3 дня после поступления больного в клинику. Такой срок необходим для адаптации больного к новым условиям и снижения напряжения, вызванного "стрессом поступления". Исследование проводили во второй половине дня (с 15 до 17 часов), через 2-3 часа после обеда в теплом помещении. Обследование проводилось в положении лежа на спине, после 5-минутного периода адаптации, необходимого для стабилизации параметров сердечно-сосудистой системы.
Частоту сердечных сокращений и измерение длительности R-R интервалов (временной промежуток между предыдущим1 и последующим зубцом ЭКГ) производили с помощью ритмокардиометра РКМ-001\ Ритмокардиометр подключали к компьютеру IBM-486 через последовательный порт. Информация о длительности R-R интервалов автоматически вводилась в память компьютера. На дисплее формировалась ритмограмма. Первые 100 кардиоинтервалов в анализ не включали, чтобы исключить последствия волнения пациента на начало исследования. Следующие 150 R-R интервалов записывали в состоянии полного покоя больного. Затем, обследуемому предлагалось вести устный счет двузначных цифр (умножение; сложение) в условиях ограниченного времени. Во время этой умственной работы регистрировали следующие 150 R-R интервалов. Устный счет прекращали и в течении последующих 100 кардиоинтервалов частота сердечных сокращений возвращалась к исходной. Последние 150 R-R интервалов записывали на фоне фиксированной частоты дыхания (8 раз в минуту). Для анализа отбирали 150 кардиоинтервалов, полученных в состоянии покоя, 150 - на фоне напряженной умственной работы и 150 - во время фиксированного дыхания.
Указанные функциональные пробы вызывают изменение активности ВНС. Напряженная умственная работа сопровождается повышением активности симпатического" отдела ВНС, а фиксированная частота дыхания -повышением парасимпатического влияния. Таким образом, определение вегетативной регуляции у каждого больного проводили в состоянии покоя и во время- активизации отделов ВНС. Расчеты выполняли с помощью компьютерной программы "Пульсар 9".
Определяли следующие показатели вариационной пульсометрии: 1. мода (Мо) - диапазон значений наиболее часто встречающихся R-R интервалов; 2. амплитуда моды (Амо) - число-кардиоинтервалов, соответствующих значению моды (чем стабильнее сердечный ритм, тем больше превалирует симпатическая регуляция сердечного ритма, тем выше Амо); 3. вариационный размах (X) отражает степень изменчивости кардиоинтервалов, указывает на максимальную амплитуду колебаний длительности R-R интервалов и отражает величину парасимпатических влияний, на сердечный ритм. На основании описанных параметров вариационной пульсометрии вычисляли индекс напряжения (ИН) с помощью формулы: ИН = АМ6/2 ХМо.
Указанный индекс-отражает выраженность тонуса СО ВНС. Второй индекс, отражающий- тонус парасимпатического- отдела ВНС (индекс парасимпатических влияний - ИПВ) вычисляли по алгоритму, основанному на анализе гистограммы и спектральных составляющих ритмограммы. Оба индекса имеют условное цифровое значение и обратно пропорциональны друг другу (чем выше ИН, тем ниже ИПВ и наоборот). Оба индекса вычисляли трижды на разных отрезках кардиоритмограммы (состояние покоя, умственная работа и фиксированное дыхание), содержащих по 150 интервалов. Когда величина ИН на 50% и более превышала ИПВ, считали, что симпатическая регуляция преобладает над парасимпатической. Если ИПВ на 50% и более превышал величину ИН, отмечали, что преобладал парасимпатический тонус. Такое сравнение индексов проводили трижды, по числу анализируемых отрезков ритмограммы и делали общее заключение о преобладании тонуса (активности) одного из отделов ВНС. Выделяли 2типа вегетативной регуляции: высокая активность симпатического отдела (СО) ВНС, низкая активность СО ВНС. і Для исследований использовали гепаринизированную венозную кровь. Мононуклеарные клетки крови получали традиционным методом на градиенте плотности фиколл-верографин в модификации В.С.Кожевникова. МНК собирали из интерфазы, дважды отмывали фосфат-забуференным физиологическим раствором (рН = 7,2), однократно - средой RPMI 1640 (НПО "Вектор", п. Кольцово, НСО). Клеточную суспензию помещали в полную культуральную среду, состоявшую из среды RPMI 1640 (НПО "Вектор", п. Кольцово, НСО) с добавлением 5 мМ Hepes-буфера, 0,3 мг/мл L-глютамина, 100 мкг/мл гентамицина (все реактивы фирмы Flow Lab.) и 10% фетальной телячьей сыворотки- (НПО "Вектор", п. Кольцово, НСО). Культивирование клеток проводили в планшетах для иммунологических исследований (завод медицинских полимеров, г. С-Петербург) при 37 С в увлажненной углекисло-воздушной атмосфере (5% СОг). Все результаты исследований представлены как средние значения, полученные в троекратно повторяемых культурах.
Определение уровня цитотоксичности мононуклеаров регионарных лимфоузлов желудка к аутологичным клеткам рака желудка in vitro
Одной из важнейших составляющих функционирования- иммунной системы человека и животных является осуществление естественных цитотоксических реакций, формирующих первую линию противоопухолевой и противовирусной защиты организма. Эта реакция опосредуется отдельной популяцией лимфоцитов - натуральными киллерами; способными-элиминировать прямым цитотоксическим воздействием широкий спектр злокачественно трансформированных, и модифицированных вирусами клеток. Учитывая, значимость- НК-клеток в поддержании- внутреннего гомеостаза; киллинга опухолевых и-вирусинфицированных клеток, наличие иммунорегуляторной активности (продукция ряда цитокинов и других биоактивных веществ) (Билынский Б.Т., 1991; Семененя И.Н., 1991; Degliantoni G., 1985; Лыков А. Н., Козлов В. А.,2001), нами исследована НК-активность у больных раком желудка.
Нами показано, что в общей группе больных раком желудка выявлено достоверное снижение НК активности (р 0,05), в сравнении с контрольной группой-(таблица 20).
Нами показано, что уровень НК - активности у больных раком желудка имеет волнообразный характер, который зависит от стадии онкологического процесса. А именно, низкий уровень при дебюте заболевания, повышение при прогрессировании ЗН (II стадия) и опять снижение по мере продвижения к IV стадии заболевания (таблица 20).
Среди возможных причин, обусловливающих низкую НК - активность у больных раком желудка, необходимо указать на роль простагландина Ег. Так добавление индометацина (1 мкг/мл, Merck) in vitro к культуре мононуклеаров крови приводило к повышению цитотоксического потенциала НК (23,1 ± 2,8 и 36,3 ± 4,7, р 0,05) в общей группе.
При анализе активности НК в общих группах больных (независимо от стадии процесса) с высокой и низкой активностью СО ВНС не получено статистически значимых различий. Разделение по стадиям позволило выявить существенное снижение НК активности по сравнению с контролем у больных I и IY стадии, более выраженное при высокой активности СО ВНС. Нами выявлены достоверные различия по уровню цитотоксичности у больных раком желудка, в зависимости от типа активности ВНС (таблица 21). различия с группой контроля, # - различия между соответствующими по стадиям группами.
Следует отметить, что по мере прогрессирования заболевания сохраняется волнообразность изменения уровня цитотоксичности НК -клеток в обеих группах обследованных пациентов.
Уровень НК - активности был меньше в первой группе как при I, так и при IV стадиях заболевания. В обеих группах этот параметр был меньше чем у доноров.
Таким образом, установлено, что у большинства обследованных больных определяется супрессия НК — активности разной степени выраженности, зависящая от стадии заболевания и от типа активности СО вне.
Известно, что одна НК клетка способна вступать в процесс киллинга неоднократно по завершению рециклинга (Семененя И.Н., 1991). Однако при дефиците НК - клеток в организме наблюдается увеличение частоты онкологических заболеваний (Ломакин М.С., 1990), обусловленное снижением противоопухолевой защиты организма. Таким образом, выявленные различия являются немаловажными в течении и прогнозе рака желудка у обследованных нами пациентов.
Поскольку функциональная активность НК подвержена влиянию гормонов; интерлейкинов, пептидов, следующим этапом работы было изучение влияния медиаторов (адреналин, норадреналин, ацетилхолин) ВНС. 3.5 Регуляторное влияние нейромедиаторов на НК - активность in vitro у-больных раком желудка.
Показано, что у больных с онкологической патологией часто выявляются признаки депрессии (Абрамов В.В., и- др., 1998). Для этапа, предшествующего появлению злокачественного роста, характерна стрессорная отягощенность, приводящая к структурно-функциональным нарушениям различных отделов нервной системы (гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и, следовательно, вегетативной) (Абрамов В.В., и др., 1998). Это, в свою очередь, вызывает изменения в концентрации гормонов, нейропептидов, интерлейкинов, что способствует изменению (снижению) функциональной активности иммунокомпетентных клеток, в том числе и НК - клеток.
Регуляторное влияние нейромедиаторов на НК - активность in vitro у больных раком желудка
Учитывая тот факт, что нервные окончания являются составной частью гемопоэзиндуцирующего микроокружения и оказывают существенное влияние на процесс кроветворения в норме, представлялось важным изучить возможные эффекты преобладания активности симпатического или же парасимпатического отдела ВНС на показатели красного ростка кроветворения больных раком желудка.
Тенденция к активации периферического звена системы эритропоэза в группе с низким уровнем активности СО ВНС находит свое отражение и в клинике, так как, ранее нами показано, что по мере прогрессирования опухоли развивается анемия. Изучение процесса колониеобразования эритроидных предшественников in vitro у больных раком желудка позволило выявить некоторые особенности (рисунок 6).
Характер изменений колониеобразующей активности мононуклеарных клеток крови (КОЕ-Э) зависел от стадии рака желудка и степени активности СО ВНС. А именно для больных с высокой активностью симпатического отдела ВНС характерным оказалось повышение эритропоэза на ранних стадиях рака желудка и снижение его на более поздних стадиях. В группе больных с низкой симпатической активностью наблюдается противоположная картина: активацияі процессов эритропоэза на поздних стадиях рака желудка.
Таким образом, тенденция к активации эритропоэза выявляется в обеих группах больных, но на разных стадиях, однако независимо от состояния СО ВНС, у всех больных по мере прогрессирования опухоли развивается анемия. Следует отметить, что в группе больных с низкой активностью СО ВНС выявлено более активное колониеобразование эритроцитов и меньшая глубина анемии при распространенных формах рака желудка. Следовательно, можно заключить, что высокая симпатическая активность является одним из факторов, способствующих развитию анемии в условиях прогрессирования рака желудка. 14,1 В Группа I и 24 Ш Группа 2 п=22 В Все бальные п=46 доноры п=Я Рисунок 6. Показатели эритропоэза in vitro у больных с разными стадиями рака желудка в зависимости от активности СО ВНС. Примечание: , 0, - различия статистически значимы (р 0,05): -различия между группами 1 и 2 при I-IV стадии и при III-IV стадии, о -различия между группами больных и доноров.
Выявлена также большая активность периферического звена эритрона в общей группе больных в сравнении с донорами, что свидетельствует о раздражении красного кровяного ростка в условиях заболевания.
Тенденция к активации эритропоэза выявляется в обеих группах больных, но на разных стадиях, и, не смотря на это, у всех больных по мере прогрессирования опухоли развивается анемия. Такая неэффективность эритропоэза может быть связана с рядом факторов. Так, анемия, у онкологических больных может развиваться в результате активации опухолью иммунной системы. Продуцирующиеся при этом провоспа-лительные цитокины интерлейкин-1 (ИЛ-1), фактор некроза опухоли (ФНО) и интерферон-у (ИФН) оказывают многофакторное воздействие па продукцию эритроцитов и обмен железа. В частности, ФНО способен тормозить утилизацию железа и разрушать мембрану эритроцитов, укорачивая срок их жизни. В ряде исследований было показано, что средняя продолжительность жизни эритроцитов у пациентов с опухолевыми заболеваниями снижается со 120 дней (нормальный показатель) до 90-60 дней. ФНО способен также взаимодействовать с рецепторами предшественников эритроцитов костного мозга, склоняя-их к апоптозу и уменьшая продукцию эритроцитов костным мозгом. Кроме того, известно, что уровень циркулирующего эндогенного эритропоэтина (ЭП) у пациентов ,с анемией опухолевого заболевания ниже; чем у больных с аналогичной степенью анемии вследствие недостатка-железа. Также известно, что НК клетки могут проявлять супрессорное влияние на эритрон. В развитии анемии играют немаловажную- роль недостаток алиментарных факторов, витамин В12, железо, распад опухоли и кровотечения.
