Введение к работе
Актуальность проблемы. Рак желудка (РЖ) является четвертой по частоте формой злокачественных новообразований и занимает второе место в структуре общей летальности от злокачественных новообразований (Parkin М. et al., 2005). Статистические данные объясняются поздним выявлением РЖ, когда основной метод радикального лечения этого заболевания, а именно хирургический, является мало эффективным (Симонов Н.Н. с соавт., 2001). Совершенно очевидно, что решения проблемы ранней диагностики рака желудка необходимы надежные и простые методы детекции опухолевого процесса, которые позволяли бы выявлять опухоль на доклинических стадиях. Известно, что трансформация клеток в раковые и прогрессия онкологического процесса связаны с накоплением генетических и эпигенетических изменений в геноме (Lengauer С. et al., 1998, Egger G. et al, 2004). На сегодняшний день известно, что аберрантное метилирование ДНК является одним из наиболее распространенных и ранних событий, приводящих к опухолевой трансформации клетки при новообразованиях различной локализации, в том числе и при раке желудка (Esteller М., 2005). С наибольшей частотой в опухолевой ткани при раке желудка распространено аберрантное метилирование трех генов опухолевой супрессии: р15, hMLHl, MGMT (Sato F. et al., 2006, Leung W.K. et al., 2001, Carvalho B. et al., 2003), что открывает большие возможности для разработки методов ранней диагностики рака желудка. Однако, проведение исследования ткани опухоли возможно лишь при визуально детектируемом изменении слизистой оболочки желудка, и, таким образом, этот метод не может быть использован ни для выявления ранних стадий развития опухолей, ни для мониторинга рецидивов. Наиболее перспективным представляется малоинвазивное выявление ДНК-онкомаркеров в крови. Разработка таких методов анализа стала возможной сравнительно недавно, когда было обнаружено, что в составе свободно циркулирующих ДНК (цирДНК) плазмы крови больных выявляются изменения (генетические и эпигенетические), идентичные изменениям ДНК в клетках опухоли (Anker Р., 2003). Такие онкоспецифические ДНК присутствуют в крови в низкой концентрации, что приводит к более низкой частоте выявления эпигенетических маркеров в плазме крови больных раком желудка по сравнению с частотой их выявления в образцах опухолевой ткани (Lee T-L. et al., 2002).
В настоящее время получены убедительные данные, демонстрирующие, что внеклеточные ДНК не только свободно
циркулируют в плазме крови, но также могут быть связаны с поверхностью форменных элементов крови (Laktionov P.P. et al., 2004). Особый интерес вызвал тот факт, что в составе цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, как и в ДНК плазмы, обнаруживаются онкоспецифические последовательности ДНК (Rykova E.Y. et al., 2004). Эти данные позволяют надеяться, что проблема более низкой частоты детекции гиперметилированных генов опухолевой супрессии в крови по сравнению с исследованием опухолевой ткани при раке желудка может быть успешна преодолена. Все сказанное определяет актуальность исследования распределения аберрантного метилирования генов опухолевой супрессии в циркулирующих ДНК крови больных раком желудка. Цель исследования. Изучение особенностей циркуляции внеклеточных ДНК и распределения онкоспецифических последовательностей в крови больных раком желудка с разными клинико-морфологическими параметрами течения заболевания Задачи исследования:
Определить концентрацию цирДНК и изучить распределение между фракциями плазмы и связанных с клеточной поверхностью форменных элементов крови у больных раком желудка на разных стадиях заболевания.
Проанализировать частоту выявления аберрантно метилированных форм генов опухолевой супрессии р15, MGMT, hMLHl в цирДНК плазмы и фракции связанной с поверхностью клеток крови у больных раком желудка на разных стадиях заболевания.
Провести сравнительное исследование чувствительности и специфичности анализов эпигенетических маркеров (р15, MGMT, hMLHl) в цирДНК и стандартных онкоспецифических белков (РЭА, СА 19.9, СА 72.4) при раке желудка.
Научная новизна.
Впервые показано, что по мере распространенности рака желудка происходит достоверное увеличение концентрации цирДНК плазмы, тогда как концентрация цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, достоверно не изменяется.
Получены новые данные о возможности выявления у больных раком желудка онкоспецифических последовательностей в цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, что значительно повышает частоту выявления эпигенетических маркеров по сравнению с использованием только цирДНК плазмы. Показано, что аберрантное
метилирование является характерным изменением для всех исследуемых стадий рака желудка.
Между детекцией эпигенетических маркеров и повышенным уровнем опухолеспецифических белков (РЭА, СА 19.9 и СА 72.4) отсутствует корреляционная зависимость, таким образом, данные изменения имеют независимое значение при развитии рака желудка и отражают разные стороны патогенеза. Теоретическая и практическая значимость.
Достоверное увеличение концентрации цирДНК плазмы у больных раком желудка по мере распространения опухолевого процесса свидетельствуют о том, что анализ концентрации цирДНК плазмы является эффективным показателем при дифференцировке больных раком желудка и могут быть использованы для оценки стадии заболевания.
Суммарная цирДНК, а именно ДНК плазмы и связанная с клеточной поверхностью, повышает чувствительность детекции метилированных аллелей генов опухолевой супрессии (MGMT, р15, hMLHl) по сравнению с использованием только цирДНК плазмы у больных раком желудка. Положения, выносимые на защиту.
У больных раком желудка по мере распространенности заболевания статистически значимо возрастает уровень цирДНК плазмы. В то время как уровень цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, не изменяется.
При раке желудка использование суммарных цирДНК крови позволяет детектировать опухолевые изменения (метилирование аллелей генов р15 и hMLHl) с чувствительностью 63% и специфичностью 63%. Метилированные формы генов выявляются в суммарных цирДНК при раке желудка с одинаковой частотой на разных стадиях заболевания.
При раке желудка частота выявления ДНК-маркеров (метилированных аллелей генов MGMT, р15 и hMLHl) существенно выше по сравнению с выявлением повышенного уровня белковых маркеров РЭА, СА 19.9 и СА 72.4. Показано отсутствие достоверной корреляции между детекцией эпигенетических и белковых маркеров опухолевого процесса.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 17 тезисов. Результаты работы были представлены на конференциях «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии»
(Россия, 2004), «Biotechnology and oncology» и «Новые технологии в онкологической практике» (Россия, 2005), «Петровские чтения-2006» и «Актуальные вопросы экспериментальный и клинической онкологии» (Россия, 2006), «Фундаментальные науки-медицине», XI Российский Онкологический конгресс и II Молодежный Медицинский Конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения» (Россия, 2007). Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования и их обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Работы изложена на 93 страницах машинописного текста (12 шрифт, двойной интервал), содержит 11 рисунков и 19 таблиц. Библиография включает 127 литературных источников.
