Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 15
1.1 Эпидемиологические и этиологические аспекты рака предстательной железы 15
1.2 Диагностика рака предстательной железы 21
1.3 Особенности иммунного статуса у больных раком предстательной железы 28
Глава II. Общая характеристика больных и методы лечения 38
2.1Общая характеристика больных 38
2.2 Методы стандартного обследования больных раком предстательной железы 41
2.3 Методы иммунодиагностики 44
2.3.1 Количественное определение субпопуляций лимфоцитов методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител 44
2.3.2 Оценка иммунного статуса 45
2.3.3 Исследование активированных субпопуляций Т-хелперов и Т-цитотоксических клеток, методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител 47
2.3.4 Исследование функциональной активности Т-клеточного звена иммунитета in vitro 48
2.3.5 Определение содержания Т-регуляторных клеток в сывортке крови, с использованием моноклональных антител 49
2.3.6 Определение функциональной активности моноцитов методом проточной цитометрии, с использованием моноклональных антител, меченых флуоресцентными метками 50
2.3.7 Оценка функциональной активности нейтрофилов в реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) 51
2.3.8 Определение концентрации иммуноглобулинов M, G и A в сыворотке крови методом количественного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) 53
2.3.9 Определение цитокинового профиля 54
2.4 Характеристика методов лечения 55
Глава III. Результаты собственных исследований и их обсуждение 57
3.1 Особенности иммунного ответа у больных раком предстательной железы 57
3.2 Сравнительное исследование показателей врожденного иммунитета до операции 58
3.2.1Лейкоциты 58
3.2.2 Исследование функциональной активности нейтрофилов в реакции восстановления нитросинего тетеразолия (НСТ-тест) 59
3.2.3 Моноциты 61
3.2.4 Исследование активированных субпопуляций моноцитов в сыворотке крови с использованием метода проточной цитометрии 62
3.3 Исследование клеточного звена адаптивного иммунитета до операции 66
3.3.1 Лимфоциты 66
3.3.2 CD3+T-лимфоциты 68
3.3.3 CD3+/CD4+T-лимфоциты (Т-хелперы, Th1) 72
3.3.4 CD4+/CD25+/CD127-Т-лимфоциты (Т-регуляторные клетки) 74
3.3.5 CD3+/CD8+Т-лимфоциты (Т-цитотоксические, CTL) 76
3.3.6 Исследование активированных субпопуляций Т-хелперов и Т-цитотоксических лимфоцитов, методом проточной цитометрии 78
3.3.7 Сравнительное исследование функциональной активности Т-клеточного звена иммунитета in vitro 81
3.3.8 CD16+56+-клетки (NK-клетки) 85
3.3.9 CD3+/CD16+56+-клетки (NKT-клетки) 87
3.3.10 CD19+В-лимфоциты и гуморальное звено иммунитета 89
3.4 Сравнительное исследование концентрации цитокинов (IFN, IL-1, TNF, IL-10) в сыворотке крови 93
3.5 Алгоритм иммунологического обследования больных раком предстательной железы 102
3.6. Особенности иммунного ответа у больных раком предстательной железы после радикальной простатэктомии 105
3.6.1 Лейкоциты 106
3.6.2 Исследование функциональной активности нейтрофилов в реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) 107
3.6.3 Моноциты 108
3.6.4 Лимфоциты 110
3.6.5 Комплексная оценка количественного содержания CD3+, CD4+, CD8+, CD4+/CD8+ 111
3.6.6 Сравнительное исследование функциональной активности Т-клеточного звена иммунитета in vitro 111
3.6.7 Исследование активированных субпопуляций Т-хелперов и Т-цитотоксических клеток, методом проточной цитометрии 114
3.6.8 Определение содержания Т-регуляторных клеток в сыворотке крови у иммуносупрессированных больных раком предстательной железы на 10-е сутки после операции 119
3.6.9 Содержания NK- и NKT-клеток, в сыворотке крови у иммуносупрессированных бльных раком предстательной железы на 10-е сутки после операции 121
3.6.10 Сравнительное исследование концентрации цитокинов (IFN, IL-1,
TNF, IL-10) в сыворотке крови 123
Заключение 128
Выводы 153
Практические рекомендации 155
Список литературы 156
- Особенности иммунного статуса у больных раком предстательной железы
- Определение содержания Т-регуляторных клеток в сывортке крови, с использованием моноклональных антител
- Исследование активированных субпопуляций моноцитов в сыворотке крови с использованием метода проточной цитометрии
- Сравнительное исследование функциональной активности Т-клеточного звена иммунитета in vitro
Введение к работе
Актуальность темы
В структуре онкологических заболеваний рак предстательной железы опережает такие грозные заболевания, как рак легкого и желудка, занимая 2-3 место. В то же время, в США оно выходит на первое место, являясь причиной смерти мужчин от онкологического заболевания в 30% случаев [81, 93]. Существующие проблемы в диагностике и лечении онкологических заболеваний говорят о незаконченности современных положений об их этиологии и патогенезе. Известно, что дисбаланс гормональных факторов играет одну из ведущих ролей в развитии РПЖ [188]. Не последнюю роль в патогенезе РПЖ играют иммунодефицитные состояния. Например, у больных страдающих врожденными иммунодефицитными состояниями, онкологические заболевания встречаются в 150 раз чаще, чем у пациентов без этих расстройств. Процесс канцерогенеза тесно связан с расстройствами иммунного ответа [74, 160]. Кроме того, длительное индолентное течение, характерное для РПЖ, также указывает на тонкие нарушения в механизмах естественной защиты, которые на уровне рутинных методов при скрининг – диагностике выявить не возможно.
Таким образом, тот факт, что опухолевый рост связан с нарушениями иммунных
реакций, сегодня уже не вызывает сомнений. В очагах опухолевого роста определяются
дефектные иммунокомпетентные клетки с резко сниженной защитной функцией.
Снижение и прогрессирующее подавление иммунологического контроля можно обнаружить уже на начальных стадиях РПЖ [136]. Угнетение активности Т-клеточного звена иммунитета, функций NK-клеток, активизация гуморального звена иммунитета при прогрессии заболевания – вот только часть изменений, которые наблюдаются у больных РПЖ [31, 102, 192].
Иммунологические расстройства у больных РПЖ изучались и ранее, однако
целесообразность использования результатов мониторинга иммунологических
показателей с целью коррекции тактики лечения, окончательно не решен до сих пор. В основе концепции иммунологического надзора лежит клонально-селекционная теория: злокачественная опухоль – источник чужеродной информации, являющийся объектом защитной реакции со стороны иммунной системы. Признаком адекватно развитой иммунной системы являлось обратное развитие опухоли, а прогрессия последней рассматривалась, как признак выраженного иммунодефицитного состояния.
В 90-е годы интенсивно развивалась клеточная и молекулярная иммунобиология. Пристального внимания заслуживало изучение функций Т-клеток и роли цитокинов в канцерогенезе. В основе новой концепции, рассматриваемые иммунологические
параметры имели прогностическое значение и являлись предикторами клинического ответа [74, 166].
Как известно, функционирование клеток иммунной системы осуществляется посредством тесного взаимодействия системы цитокинов, которые сегодня подвергаются глубокому анализу и широко применяются в иммунотерапии новообразовании. В то же время, функциональные резервы противоракового иммунитета мало изучены. Имеются лишь немногочисленные ссылки в литературных источниках, описывающие клеточное и гуморальное звенья иммунитета у больных РПЖ [74, 123].
Стали формироваться представления о том, что на процесс канцерогенеза можно оказывать биологическое воздействие применяя не только методы иммунореабилитации, но и направленной иммунотерапии.
На сегодняшний день, некоторые особенности иммунного статуса у пациентов, страдающих онкологическими заболеваниями и РПЖ в частности, известны, но практически все они носят описательный характер. Это создает необходимость оценки в динамике иммунного статуса больных РПЖ с учетом клинико-морфологических показателей т.к. полученные результаты могут иметь диагностическую значимость. Кроме того, широкое использование гормональной, лучевой, химиотерапии, а также их сочетаний в лечении больных РПЖ происходит без учета иммунного статуса, что безусловно ведет к потери качества диагностики и, как следствие, ухудшения результатов лечения больных РПЖ. Таким образом, исследование иммунного статуса и его изменений у больных РПЖ представляется актуальным. В то же время, в литературе неоправданно мало публикаций посвящено изучению иммунного статуса при РПЖ, и акцент сделан в сторону разработок в скрининг-диагностике и новых подходов комбинированного лечения. Не исключено, что оценка иммунного статуса в сочетании с традиционными подходами активной диагностики позволит отдифференцировать РПЖ индолентного и агрессивного течения. Все вышеперечисленное свидетельствует о сложных реципрокных взаимодействиях опухоли и иммунной системы. Это объясняет актуальность и необходимость комплексного количественно – качественного анализа иммунной системы больных РПЖ до и на этапах лечения.
Цель исследования
Улучшение результатов диагностики и лечения больных РПЖ путем качественно – количественного анализа отдельных показателей иммунного статуса до и после РПЭ.
Задачи исследований
-
Исследовать количественные показатели клеточного и гуморального иммунитета у больных РПЖ, в сравнении с больными ДГПЖ.
-
Исследовать функциональную активность клеточных субпопуляций врожденного иммунитета (нейтрофилов и моноцитов) у больных РПЖ, в сравнении с больными ДГПЖ.
-
Исследовать функциональную активность основных субпопуляций Т-клеточного звена иммунитета - СБ4+Т-хелперов и CD8+Т-цитотоксических эффекторов у больных РПЖ, в сравнении с больными ДГПЖ.
-
Путем корреляционного анализа и статистической обработки выявить значимые изменения иммунного статуса у исследуемых категорий больных.
-
Разработать алгоритм индивидуального иммунологического обследования для больных РПЖ, с целью раннего выявления иммуносупрессии, прогнозирования постоперационных осложнений и изменения тактики предоперационной подготовки. Сформировать по иммунологическим показателям группы риска.
Научная новизна
Впервые разработан индивидуальный комплексный алгоритм функциональной оценки противоопухолевого иммунитета у больных РПЖ до и после РПЭ.
Впервые для оценки функциональной активности врожденного иммунитета при РПЖ, помимо исследования функциональной активности нейтрофилов, нами было внедрено исследование минорной субпопуляции моноцитов CD14+CD16+, которые по данным литературы, обладают способностью к выработке воспалительных интерлейкинов и характеризуются свойствами тканевых макрофагов. В нашей работе впервые было показано стабильное увеличение процентного содержания этой субпопуляции в крови больных РПЖ, по сравнению с контрольной группой.
При оценке Т-клеточного иммунитета методом проточной цитометрии, нами было внедрено исследование активированных субпопуляций Т-хелперов и Т-цитотоксических: CD4+/CD38 и CD4+/HLA-DR+, а также CD8+/CD38+ и CD8+/HLA-DR+. Было показано увеличение в крови больных РПЖ, в отличие от контрольной группы, активированных CD8+/С038+Т-лимфоцитов эффекторов, которые выявлялись у этих больных, как до операции, так и после нее. Однако, помимо этих исследований, учитывая пластичность активированных клеток и возможность их перехода в состояние иммуносупрессии при РПЖ, было проведено диагностическое исследование Т-клеточного иммунитета и активности NK-клеток у обследуемых по продукции интерлейкинов. Для этих целей нами была применена
достаточно простая оценка продукции IL-2, IFN, IL-10, вырабатываемых лимфоцитами больного в системе in vitro через 24 часа после стимуляции поликлональным Т-клеточным активатором ФГА. Об активации Т-клеточного иммунитета судили по определению в культуральном супернатанте методом твердофазного ИФА концентрации IL-2 и IFN, о супрессии - по снижению выработки IL-2 и IFN, с нарастанием концентрации IL-10. Исследование интерлейкинов в супернатанте является более чувствительным и специфичным, по сравнению с оценкой их в сыворотке. На основании определения концентрации IL-2 в супернатанте активированных лимфоцитов больных РПЖ, до и после операции, обследуемые были разделены на группы: с иммуносупрессией и без нее.
В разработанный алгоритм было включено определение в сыворотке больных провоспалительных IL-1, TNF и IFN, также было проведено исследование противовоспалительного иммуносупрессорного IL-10.
Для клинико-иммунологического мониторинга за состоянием больных после РПЭ, нами был составлен еще один упрощенный алгоритм иммунологического обследования. При этом предлагается оценивать:
-
функциональную активность нейтрофилов, исследовать относительное содержание в крови минорной субпопуляции моноцитов CD14+CD16+;
-
функциональную активность Т-клеточного иммунитета, а также NK-клеток - по выработке IL-2, IFN и IL-10 в системе in vitro, с последующим определением их концентрации в тест-системах ИФА;
-
в случае выявления снижения выработки IL-2, IFN и IL-10, необходимо проводить развернутое клинико-иммунологическое обследование.
Практическая значимость работы
Была показана важность иммунологического дооперационного обследования больных РПЖ, в связи с прогнозированием послеоперационных осложнений, связанных с развитием иммуносупрессии. Разработан алгоритм иммунологического обследования до и после РПЭ.
Была предложена методическая основа для осуществления функциональных исследований показателей иммунитета, с целью ранней диагностики иммуносупрессии.
Были количественно охарактеризованы показатели иммунитета, предполагающие наличие или развитие иммуносупрессии после операции. Состояние иммуносупрессии у больных РПЖ до операции, сопровождалось снижением функциональной активности нейтрофилов (снижение стимулированного НСТ менее 40%), повышением в циркуляции минорной субпопуляции моноцитов CD14+CD16+ (9,9%(+\-3,5), повышением
концентрации сывороточного IL-1 (до 0,44пг\мл), снижением выработки лимфоцитами больных в системе in vitro – IL-2 (9,9 – 15пг\мл), IFN (0,99 – 60пг\мл), с некоторым повышением концентрации IL-10 (1,5 – 30пг\мл). На 10-е сутки после операции у больных этой группы развивалась послеоперационная супрессия, которая сопровождалась низкой выработкой IL-2 (9,9 – 15пг\мл), IFN (0,99 – 60пг\мл) в системе in vitro, снижением абсолютного содержания NK-клеток (<100 кл\мкл), повышенным содержанием в сыворотке IL-1 и сниженной концентрацией IFN. Среди пациентов II группы, с умеренной выработкой в системе in vitro IL-2 (50 – 80пг\мл), IFN (60 – 100пг\мл) до операции, также могла развиваться на 10-е сутки после операции иммуносупрессия, со сниженными показателями в супернатанте культур лимфоцитов IL-2 (9,9 – 15пг\мл), IFN (20 – 80пг\мл), кроме того у них выявлялось повышение сывороточного IL-1, с одновременным снижением IFN. Все эти данные, полезны для выработки адекватной тактики диагностических и лечебных мероприятий. Кроме того, они используются для клинико-иммунологического мониторинга за состоянием больных после операции.
При РПЖ T2b – T3aN0M0 целесообразно исследовать содержание NK/NKT-клеток и IFN в качестве дополнительных факторов прогноза течения заболевания.
Особенности иммунного статуса у больных раком предстательной железы
Установлено, что РПЖ отличается от других злокачественных новообразований характером иммунологической реактивности, что частично можно объяснить особенностями патогенеза РПЖ, где одну из ключевых ролей играет гормональный фактор, оказывающий иммуносупрессивный эффект. При РПЖ отмечено частое повреждение Т-клеточного звена и цитотоксических клеток [74, 143, 166].
Группа зарубежных авторов в 2013 так же занимались оценкой иммунного статуса больных РПЖ. Ученые опирались на критерии состояния клеток тканевого и гуморального иммунитета: Т- и В-лимфоцитов, макрофагов, NK-клеток, нейтрофилов, эозинофилов и тучных клеток. С помощью иммунногистохимических методов исследования ученые продемонстрировали, что все эти клетки неравномерно проникают в опухоли и вырабатывают цитокины, воспалительные и цитотоксические медиаторы, что отражается на биологическом разнообразии опухоли и противоопухолевом ответе при лечении. В своем исследовании авторы сделали акцент на состояние тканевого иммунитета, а именно – тучных клетках. Известно, что тучные клетки в основном продуцируют IgE, участвующий в иммунных реакциях, а также являющийся мощным триггером иммунной системы и процессов воспаления. Тучные клетки одни из первых инфильтрируют соединительную ткань при ранних стадиях РПЖ, причем могут активно стимулировать ангиогенез и лимфангиогенез в различных солидных опухолях. Оценив инфильтрацию ткани предстательной железы тучными клетками 104-х больных РПЖ, было выявлено, что количество тучных клеток было выше вокруг фокусов рака у пациентов с более высокими баллами по шкале Глисона, чем у больных с более низким баллом (p 0,001). Отмечен интересный факт, что на поздних стадиях РПЖ количество тучных клеток снижается, за счет их дегрануляции. Т.е. наличие базофильных гранул или «истощенных» тучных клеток в соединительной ткани предстательной железы свидетельствует о поздних стадиях пролиферации опухоли. Многофакторный анализ показал, что количество тучных клеток в гистологическом материале является важным прогностическим фактором тяжести РПЖ ( p 0,005 ). К сожалению, большая часть исследования так же выполнялась in vitro. [194] На основании анализа литературы можно сделать заключение, что для больных РПЖ характерны изменения в основном клеточного иммунитета, наиболее отчетливо выражающиеся в уменьшении количества лимфоцитов, Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+, и CD8+ составляющих 70%, и CD16+ составляющих менее 30% популяции), увеличении содержания клеток-супрессоров [43, 190]. Стадия заболевания существенно влияет на уровень иммунологических реакций, даже на ранних стадиях [90, 101, 125, 193, 199].
Однако в настоящее время окончательно не определено, какие иммунологические показатели и как коррелируют со стадиями РПЖ [177, 207]. У онкологических больных, в том числе у больных РПЖ, очень важна оценка функциональных характеристик и согласованности работы всех компонентов иммунной системы, так как количественные показатели, особенно у больных локализованным РПЖ, могут быть не изменены [74, 123, 163].
В 2009г. Топузов М.Э. проанализировал иммунологический статус больных РПЖ [69]. В своих исследованиях автор доказал, что при данном заболевании достоверно повышается число CD8+Т - лимфоцитов и снижается иммунорегуляторный индекс, увеличивается уровень значений IFN, остальные изученные показатели цитокинового статуса остаются неизменными. РПЖ достоверно сопровождается снижением функциональной активности нейтрофилов, на что указывает снижение показателей теста НСТ и фагоцитарной активности. У больных с показателями, равными или превышающими дискриминационные значения уровня IFN (40,36 пг/мл) и кластеров дифференцировки лимфоцитов – CD8+ (30%), имеется высокая вероятность обнаружения РПЖ. В то же время у пациентов с показателями, превышающими дискриминационные значения теста на НСТ (18%) и фагоцитарного числа (70%), имеется высокая вероятность отсутствия РПЖ [69, 90].
Другая группа ученых провела сравнение иммунного статуса у больных ДГПЖ и РПЖ. Авторы обнаружили, что у больных ДГПЖ существуют статистически значимые изменения иммунного статуса, заключающиеся в снижении уровня СD8+Т-лимфоцитов и в увеличении иммунорегуляторного индекса, причем изменений иммунитета по данным показателям у больных РПЖ зарегистрировано не было. Но, в культуре лимфоцитов больных РПЖ выявлен низкий уровень количества СD8+-клеток и более низкий уровень продукции IFN лимфоцитами в ответ на стимуляцию. Авторы сделали выводы, что у больных РПЖ и ДГПЖ обнаружено повышение количества регуляторных Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+ и CD25+ до 0,33 — 0,47% против 0,11% в контрольной группе (здоровые добровольцы), которое коррелирует с повышенным уровнем ПСА и может служить отрицательным прогностическим признаком течения заболевания. Данная работа убедительно демонстрирует, что подавление иммунного ответа на опухолевые антигены у больных РПЖ определяется особенностями лимфоцитов последних, и этот фактор можно использовать в качестве маркера данного заболевания, но, большая часть исследования была направлена на изучение биологического «поведения» РПЖ и проводилась in vitro. Также авторы не проводили оценку состояния иммунного статуса в динамике у пациентов после того или иного лечения РПЖ [2].
Определение содержания Т-регуляторных клеток в сывортке крови, с использованием моноклональных антител
Моноциты периферической крови относятся к мононуклеарной фагоцитарной системе, которая играет центральную роль в иммунорегуляции и защите против патогенных микроорганизмов. Моноциты активируются через рецепторные сигналы от микроорганизмов, воспалительных медиаторов или хемотаксических факторов, выделяемых другими клетками. Моноциты крови – это гетерогенная популяция клеток по морфологии, экспрессии мембранных антигенов и высвобождению медиаторов воспаления. Среди прочих, выделяют две главных субпопуляции: классические моноциты (CD14+CD16-), которые составляют большинство и не классические (CD14+CD16+), которые в крови здоровых пациентов обнаруживаются в количестве не более 10%. При инфекционных и воспалительных заболеваниях возрастает субпопуляция CD14+CD16+ моноцитов, которые обладают сильными провоспалительными свойствами и характеризуют иммунопатологический процесс [181,182]. В качестве материала исследования была использована венозная кровь, взятая натощак в пробирки Vacutainer, содержащих гель и ЭДТА. Для цитофлуориметрического исследования методом прямой иммунофлуоресценции, моноциты окрашивали с использованием моноклональных антител, конъюгированных с флуорохромами: ФИТЦ- анти – CD14, ФЭ-анти – CD16, ФЭ\Ц5-анти – HLA-DR. Для этого в промаркированные пробирки добавляли по 100 мкл крови и по 20 мкл меченых флуорохромами моноклональных антител, либо соответствующий изотипический контроль антител. Инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 15 минут. Для лизиса эритроцитов добавляли в пробирки по 2 мл лизирующего раствора (BectonDickinson), тщательно размешивали (на Вортексе) и инкубировали 10 мин. при комнатной температуре в темноте. После инкубации пробирки центрифугировали при 1500 об/мин.5 мин., после удаления супернатанта, клетки отмывали ФСБ и фиксировали, добавляя 0,5мл – 2% параформальдегида. Фиксированные клетки анализировали с использованием проточной цитометрии.
Анализ окрашенных моноцитов проводили следующим образом: 1) моноциты выделяли на экране компьютера (гейтировали) по светорассеянию; 2) в моноцитарной популяции исследовали ФИТЦ – CD14 и ФЭ – CD16; ФИТЦ –CD14 и ФЭ/Ц5– HLA-DR.
Оценка функциональной активности нейтрофилов в реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест).
Центральное место в функциональной активности фагоцитирующих клеток периферической крови занимает «кислородный или респираторный взрыв», вследствие чего генерируются активные формы кислорода в системе НАДФН-оксидазы. Оценивая образование внутриклеточных ионов водорода и супероксидных анионов после стимуляции лейкоцитов в системе in vitro, судят о функциональной активности клеток врожденного иммунитета [45].
Для оценки «кислородного взрыва» используются различные методы, в частности метод восстановления нитросинего тетразолия (тест НСТ).
Принцип метода основан на способности активированных нейтрофилов поглощать этот краситель и восстанавливать его, в ходе внутриклеточных окислительно-восстановительных реакций, с образованиемв цитоплазме клеток темно-синихгранул нерастворимого диформазана.
Для проведения теста был использован НСТ («Sigma», с молеклярным весом 817,6), в концентрации 1мг на 2 мл ФСБ (рН 7,2 – 7,4). Для стимуляции нейтрофилов использовали 0,05% раствор опсонизированного Зимозана А («Sigma»). В качестве опсонинов была использована сыворотка доноров IV группы.
Реакцию восстановления НСТ в суспензии нейтрофилов проводили на предметных стеклах, в ФСБ (рН 7,2 – 7,4) («Пан Эко»Россия). Перед подсчетом клеток под микроскопом, нейтрофилы докрашивали 0,5% водным раствором сафранина. В качестве материала исследования была использована венозная кровь, взятая натощак в пробирки Vacutainer, содержащих гель и ЭДТА. После расслоения крови, из пробирки автоматической пипеткой отбирали 200 мкл лейковзвеси в чистую маркированную пробирку и центрифугировали 7минут при 1000 об/мин. После удаления супернатанта, клеточный осадок ресуспендировали в 100 мкл ФСБ.
Постановка реакции проводилась следующим образом: тест НСТ для каждого пациента проводили на двух предметных стеклах: 1 – НСТ спонтанный; 2 – НСТ стимулированный. На оба стекла наносили по 20 мкл суспезии лейкоцитов. Далее добавляли к лейкоцитам на первом стекле – 20 мкл ФСБ и 20 мкл раствора НСТ, к клеткам на втором стекле – 20 мкл опсонизированного зимозана (стандартный стимулятор) и 20 мкл раствора НСТ. Оба стекла помещали во влажную камеру и инкубировали 20 мин. В термостате при Т0 37С. После инкубации препараты высушивали на воздухе, фиксировали 950 этанолом, после чего препараты докрашивали в 0,5% растворе сафранина. (Сафранин окрашивает ядра нейтрофилов в розовый цвет). После промывания препаратов под струей проточной воды, их высушивали на воздухе. Учет результатов проводили под световым микроскопом (ув.х100). Высчитывали процентное содержание нейтрофилов с голубой «вуалью» или синими вкраплениями, образуемыми диформазаном, на 100 лейкоцитов (активированные нейтрофилы поглощают НСТ, в отличие от покоящихся, которые будут окрашены в розовый цвет).
Известны нормальные значения вышеуказанного теста:
НСТ-спонтанный – определяется менее 15% активированных нейтрофилов, с окрашенной цитоплазмой.
НСТ-стимулированный, под действием опсонизированного зимозана – определяется более 40% активированных лейкоцитов.
У здоровых доноров при воспалительном процессе, НСТ-спонтанный становится выше 15%, при этом стимулированный НСТ-тест превышает спонтанный НСТ и всегда выше 40%. При воспалительном процессе у иммунодефицитных пациентов НСТ-спонтанный повышается, в то время как, стимулированный НСТ снижен и не достигает 40%.
Исследование активированных субпопуляций моноцитов в сыворотке крови с использованием метода проточной цитометрии
Моноциты периферической крови относятся к мононуклеарной фагоцитарной системе, которая играет центральную роль в иммунорегуляции и защите против патогенных микроорганизмов. Моноциты активируются через рецепторные сигналы от микроорганизмов, воспалительных медиаторов и/или хемотаксических факторов, выделяемых другими клетками. Они являются важными клеткам иммунной системы. Выходя из крови в ткани, они начинают дифференцироваться в макрофаги и в моноцитарные ДК-клетки, АПК, активирующие противоопухолевые Тh1. Активированные моноциты в числе прочих маркеров, характеризуются поверхностноклеточными молекулами HLA-DR+, необходимыми в дальнейшем для презентации антигенов при запуске иммунного ответа. Было показано, что при хронических воспалительных заболеваниях в периферической крови больных возрастает минорная субпопуляция активированных CD14+CD16+ моноцитов (у здоровых людей таких клеток около 10%), которые обладают сильными провоспалительными свойствами и повышенной фагоцитарной активностью, по сравнению с CD14+ моноцитами крови, что характерно для тканевых макрофагов [114, 181,182]. Появление этой субпопуляции может характеризовать хронический воспалительный процесс, связанный с иммуносупрессией, возможной причиной развития которой может являться нарушение дифференцировки моноцитов в моноцитарные ДК-клетки .
Показано, что CD14+CD16+-клетки оказывают противоопухолевое действие, как тканевые макрофаги, путем выделения TNF и других провоспалительных интерлейкинов (IL-1, IL-6) при контакте с опухолевыми клетками, и не превращаются, как CD14+CD16- моноциты, под действием опухоли в супрессоры.
Так как в задачи проводимого исследования входило выявление при РПЖ, дополнительных к определению ПСА, скрининговых иммунологических маркеров, было проведено сравнительное исследование возможности выявления в крови больных РПЖ активированной минорной CD14+CD16+субпопуляции моноцитов, в качестве дополнительного, к определению ПСА, иммунологического скринингового теста.
Методом проточной цитометрии, проводили исследование активированных моноцитов – CD14+/HLA-DR+, а также минорной субпопуляции моноцитов – CD14+CD16+. Результаты исследования представлены в таблице 15.
Из представленных результатов в таблице 15 видно, что относительное содержание CD14+/HLA-DR+ в контрольной группе составляет 12,5 – 22,5% от относительного содержания CD14+моноцитов крови, что достоверно не отличается от данного показателя в группе здоровых доноров (13,5 – 22,5%). У больных РПЖ на стадиях T2bN0M0, T2cN0M0 и T3aN0M0 наблюдается снижение процентного содержания CD14+/HLA-DR+ моноцитов, по сравнению с контрольной группой, и со здоровыми донорами. При этом обращает на себя внимание тот факт, что и в группах больных РПЖ на ранних стадиях T1cN0M0 и T2aN0M0 имеется около 5% пациентов со сниженными показателями этой субпопуляции. Полученные данные могут свидетельствовать о выявлении иммуносупрессии на уровне врожденного иммунитета, а именно снижении экспрессии маркера активации HLA-DR+ на моноцитах крови, в зависимости от категории «T» (p 0,05).
Параллельно проводилось исследование CD14+CD16+ субпопуляции моноцитов. Полученные данные представлены в таблице 16.
Из таблицы 16 видно, что процентное содержание минорной субпопуляции активированных СD14+CD16+ моноцитов в контрольной группе составляет 2,3 – 8,0% CD14+клеток. На стадиях T1cN0M0, T2aN0M0, Т2bN0M0, T2cN0M0 и T3aN0M0 имеется достоверное повышение процентного содержания этой субпопуляции, как по сравнению с контрольной группой, так и со здоровыми.
Сопоставляя между собой данные по процентному содержанию субпопуляций моноцитов CD14+/HLA-DR+ и CD14+CD16+ (табл. 15, 16) видно, что у больных имеется обратная зависимость между активированными моноцитами CD14+/HLA-DR+, предшественниками АПК и провоспалительными клетками CD14+CD16+. Полученные результаты могут являться подтверждением того, что появление в организме опухоли, сопровождается изменениями дифференцировки моноцитов в АПК, с преобладанием тканевых макрофагов. Отражением этих процессов может являться увеличение в крови субпопуляции CD14+CD16+. В контрольной группе, а также у здоровых доноров не было выявлено таких изменений.
Таким образом, у больных РПЖ, по сравнению с контрольной группой, были зарегистрированы изменения на уровне врожденного иммунитета, которые сопровождаются не только снижением функциональной активности нейтрофилов (в тесте НСТ), но и увеличением субпопуляции CD14+CD16+ моноцитов, являющегося возможно, ранним иммунологическим маркером, сопутствующим РПЖ.
Сравнительное исследование функциональной активности Т-клеточного звена иммунитета in vitro
Анализ абсолютного содержания лимфоцитов, а также иммунограмм в раннем и позднем постоперационных периодах, не выявил каких-либо достоверных изменений в количестве субпопуляций CD3+/CD4+ и CD3+/CD8+, а также показателя соотношения этих клеток CD4+/CD8+. В связи с этим, в соответствии с разработанным нами алгоритмом, мы перешли к оценке функциональной активности различных субпопуляций Т лимфоцитов, как в системе in vitro, по выработке интерлейкинов, так и по поверхностно-клеточным активационным маркерам в иммунограмме.
Сравнительное исследование функциональной активности Т-клеточного звена иммунитета in vitro
Во время исследования функции Т-клеточного иммунитета по выработке IL-2, IFN и IL-10 в системе in vitro, до операции, было выявлено 3 группы больных РПЖ (табл. 35). В I группу вошли иммуносупрессированные пациенты, на стадиях T2bN0M0, T2cN0M0 и T3aN0M0, со сниженной выработкой IL-2, IFN и повышенной IL-10. Во II и III группу были включены больные, соответственно со «средней» и «высокой» выработкой IL-2, IFN. IL-10 выявлялся у больных РПЖ всех групп. По результатам исследования выработки IL-2, IFN и IL-10, больные РПЖ, включенные во II и III группы, не были отнесены к иммуносупрессированным. Наблюдение за пациентами из этих трех групп, были продолжены и в послеоперационном периоде. Полученные результаты представлены в таблице 59.
Как видно из таблицы 59, на 10 день после РПЭ, в системе in vitro, через 24 часа после инкубации с ФГА, в супернатанте клеточных культур были определены интерлейкины IL-2, IFN и IL-10. Было показано, что у иммуносупрессированных пациентов I группы, с низким дооперационным уровнем концентрации IL-2, IFN и повышенным IL-10, после операции наблюдались теже закономерности, в отношении исследуемых интерлейкинов. Т.e больные РПЖ, на стадиях заболевания T2bN0M0, T2cN0M0 и T3aN0M0, по выработке интерлейкинов, относятся к группе риска, по развитию послеоперационных осложнений.
Среди пациентов II группы, были выявлены послеоперационные различия. У всех пациентов II группы, на стадии заболевания T2aN0M0, а также у 40% пациентов на стадии РПЖ T2bN0M0 не наблюдалось послеоперационного снижения выработки IL-2, IFN и IL-10. Значения были близки к полученным до операции. Таким образом, у них не развивалась послеоперационная иммуносупрессия. В тоже время, у 60% пациентов II группы, при стадиях T2bN0M0, было выявлено снижение выработки in vitro IL-2, IFN и повышение IL-10 (p 0,05). Таким образом, у них выявилась иммуносупрессия на 10-й день после РПЭ, и они также, как и пациенты I группы, составили группу риска послеоперационных осложнений, и были обозначены как группа IIA
После разделения пациентов РПЖ на I, II, IIA и III группы по выработке интерлейкинов в системе in vitro, до и после РПЭ, были проанализированы и другие иммунологические параметры, выполненные каждому пациенту, в соответствии с модифицированным алгоритмом до и после операции.
Исследование активированных субпопуляций T-хелперов и T-цитотоксических лимфоцитов, методом проточной цитометрии Все больные РПЖ были до операции разделены по функциональной активности Т-клеточного звена иммунитета на 3 группы, в одну из которых входили иммуносупрессированные пациенты. В результате послеоперационного обследования, помимо больных из I группы, среди пациентов II группы, было выявлено 60% иммуносупрессированных больных РПЖ на стадии T2bN0M0 с нарушенной выработкой в системе in vitro IL-2 и IFN, по сравнению с дооперационным обследованием.
В связи с полученными данными, необходимо было оценить, как влияют выявленные в нашей работе функциональные изменения Т-клеточного звена иммунитета на субпопуляционный состав эффекторных цитотоксических Т-лимфоцитов и Т-клеток памяти, Т-регуляторных, а также на NK-клетки у имуносупрессированных пациентов в послеоперационном периоде.
Согласно полученным данным, в I и IIА группу иммуносупрессированных пациентов, выявленных как до так и после операции, относились больные РПЖ на стадиях заболевания T2bN0M0, T2cN0M0 и T3aN0M0. Поэтому анализ иммунограмм, в первую очередь, проводили для этих больных.
Результаты сравнительного исследования активированных CD4+Т-хелперов у иммуносупрессированных больных РПЖ I и IIА групп на 3-й и 10-й дни после операции представлены в таблице 60.
Похожие диссертации на Особенности иммунного статуса у больных раком предстательной железы до и после радикальной простатэктомии
