Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 19
1.1. Принципы современной клинической диагностики онкологических заболеваний 19
1.2. Опухолевые маркеры 21
1.2.1. Ассоциированные с опухолью антигены – классические онкомаркеры 21
1.2.2. Индивидуальные онкомаркеры 24
1.2.2.1. Простатический специфический антиген 24
1.2.2.2. Раковоэмбриональный антиген 27
1.2.2.3. Опухолевый антиген СА 15-3 28
1.2.2.4. Опухолевый антиген СА 125 30 1.3. Флуоресцентные нанокристаллы для многопараметрического анализа 32
1.3.1. Характеристика и свойства полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов 32
1.3.2. Области применения флуоресцентных нанокристаллов и перспективы использования в клинической диагностике 39
1.3.2.1. Иммуноцитохимия и иммуногистохимия с использованием биоконъюгатов на основе флуоресцентных нанокристаллов 39
1.3.2.2. Многоцветная проточная цитофлуориметрия с использованием биоконъюгатов на основе флуоресцентных нанокристаллов 45
1.3.2.3. Мониторинг внутриклеточных процессов и взаимодействий с помощью биконъюгатов на основе флуоресцентных нанокристаллов 48
1.3.3. Многопараметрические суспензионные системы на основе оптически кодированных микросфер 52
1.3.4. Преимущества суспензионных систем на основе микросфер, кодированных флуоресцентными нанокристаллами 62
1.4. Заключение 64
II. Материалы и методы 66
2.1. Коллекция образцов сыворотки крови человека 66
2.2. Анализ образцов сыворотки крови с помощью традиционного иммуноферментного метода 67
2.3. Получение стабильных водорастворимых флуоресцентных нанокристаллов 68
2.3.1. Солюбилизация флуоресцентных нанокристаллов цистеином .68
2.3.2. Модификация поверхности флуоресцентных нанокристаллов производным полиэтиленгликоля 69
2.3.3. Очистка модифицированных флуоресцентных нанокристаллов 70
2.4. Оптическое кодирование микросфер флуоресцентными нанокристаллами 71
2.4.1. Подготовка поверхности микросфер 71
2.4.2. Кодирование микросфер водорастворимыми флуоресцентными нанокристаллами 72
2.5. Характеризация микросфер, кодированных флуоресцентными нанокристаллами 2.6. Конъюгация распознающих биомолекул с поверхностью флуоресцентных микросфер 76
2.7. Биотинилирование детекторных моноклональных антител 79
2.8. Многопараметрический иммуноанализ образцов сыворотки крови с помощью флуоресцентных микросфер в суспензии 80
2.8.1. Количественная детекция свободного и общего ПСА в образцах сыворотки крови 82
2.8.2. Количественная детекция СА 15-3, РЭА и СА 125 в образцах сыворотки крови 84
2.9. Определение аналитических характеристик суспензионной
системы на основе флуоресцентных микросфер 86
2.9.1. Воспроизводимость анализа 86
2.9.2. Аналитическая чувствительность 86
2.9.3. Определение линейного диапазона определяемых концентраций (тест на линейность) 87
2.9.4. Оценка достоверности определения концентрации онкомаркеров в смешанных образцах сыворотки (тест на «открытие») 88
2.10. Статистическая обработка результатов 89
III. Результаты и их обсуждение 90
3.1. Получение стабильных водорастворимых флуоресцентных нанокристаллов 90
3.2. Оптическое кодирование микросфер флуоресцентными нанокристаллами 94
3.3. Характеризация микросфер, кодированных флуоресцентными нанокристаллами 103
3.4. Количественная детекция свободного и общего ПСА в образцах сыворотки крови с помощью флуоресцентных микросфер 108 3.4.1. Микросферы с адаптерными молекулами на поверхности 110
3.4.2. Антиген-специфические микросферы с распознающими антителами на поверхности 113
3.5. Диагностические характеристики суспензионной системы на основе флуоресцентных микросфер: регрессионный анализ 118
3.6. Аналитические характеристики суспензионной системы на основе флуоресцентных микросфер 121
3.6.1. Воспроизводимость анализа 122
3.6.2. Аналитическая чувствительность 125
3.6.3. Линейный диапазон определяемых концентраций 125
3.6.4. Достоверность определения концентрации онкомаркеров в смешанных образцах сыворотки 128
3.7. Принципы количественной детекции СА 15-3, РЭА и СА 125 в образцах сыворотки крови с помощью флуоресцентных микросфер 130
Заключение 136
Выводы
- Простатический специфический антиген
- Иммуноцитохимия и иммуногистохимия с использованием биоконъюгатов на основе флуоресцентных нанокристаллов
- Модификация поверхности флуоресцентных нанокристаллов производным полиэтиленгликоля
- Аналитические характеристики суспензионной системы на основе флуоресцентных микросфер
Простатический специфический антиген
Современные подходы к клинической диагностике онкологических заболеваний человека в большинстве случаев позволяют детектировать патологию уже на определенной стадии ее развития. Они ограничены набором классических методов: биохимическое и иммунологическое определение онкомаркеров, морфологическое и иммуноцитохимическое исследование биопсийных образцов тканей, инструментальные методы исследования [25].
В связи с этим, своевременная высокоточная диагностика онкологических заболеваний и разработка эффективных методов лечения являются наиболее актуальными задачами современной медицины. Для реализации этих задач прежде всего необходимо понимать основные механизмы возникновения и развития рака.
Злокачественная трансформация включает в себя изменения в экспрессии белков с последующей клональной пролиферацией измененных клеток. Аномальная экспрессия генов в опухолевых клетках обуславливает синтез эмбриональных, плацентарных и эктопических белков, ферментов, АТ и гормонов [2]. Сывороточные онкомаркеры представляют собой глико– или липопротеины, повышение концентрации в периферической крови которых коррелирует с наличием, ростом опухоли и ее метастазированием [2, 4, 26]. Поэтому сывороточные онкомаркеры являются важным информативным биохимическим показателем наличия опухолевого процесса и представляют мощный инструмент для мониторинга и оценки эффективности проводимой терапии онкологических заболеваний. Такие маркеры имеют важное значение в клинической онкологии, поскольку их концентрация в сыворотке крови может коррелировать с наличием и ростом злокачественной опухоли до появления выраженных клинических симптомов. Поиск, идентификация и качественный анализ специфических онкомаркеров в биологических жидкостях и разработка высокоточных многопараметрических систем для их количественной детекции по прежнему остаются наиболее актуальными задачами ранней диагностики и прогнозирования онкологических заболеваний.
Существуют разнообразные геномные и протеомные технологии для мониторинга многочисленных изменений и процессов, протекающих в организме на молекулярном уровне: степень опухолеспецифического метилирования ДНК [27, 28], модификация профилей мРНК [29], изменение уровня экспрессии и степени гликозилирования белков [30], появление АГ-специфических ауто-АТ [31-34] и циркулирующих раковых клеток [35, 36] и т.д.
Тем не менее, несмотря на большое количество проводимых научных исследований, подавляющее большинство потенциальных онкомаркеров нового поколения не выдерживают полноценных клинических испытаний для их регламентированного успешного применения в клинической диагностике и практике [37]. Причины такого критического отбора в процессе клинических испытаний заключаются в естественных различиях протеомных профилей пациентов; тонких вариациях методик отбора и обработки биологических проб, что может приводить к серьезным систематическим ошибкам; ограниченности технологических ресурсов и недостатках используемых количественных методов детекции и анализа.
С учетом всех этих ограничений идеальный белковый онкомаркер должен отражать истинную биологическую гетерогенность в уровне экспрессии опухолеспецифических белков в зависимости от стадии и типа заболевания, а идеальная диагностическая система должна быть многопараметрической, высокоточной, а также простой и функциональной для использования в рутинной клинической практике.
С точки зрения диагностической ценности опухолеспецифический АГ должен продуцироваться опухолевой клеткой в количествах, достаточных для обнаружения с помощью современных методов анализа. Кроме того, он не должен выявляться (или его уровень должен быть значительно меньше) в крови здоровых доноров и пациентов с незлокачественными заболеваниями. Важно, чтобы экспрессия маркера индуцировалась уже на ранних стадиях опухолевого процесса и, в дальнейшем, его концентрация в сыворотке коррелировала с результатами противораковой терапии. «Идеальных онкомаркеров», т.е. индивидуальных маркеров со 100% специфичностью (отсутствие маркера в образцах сыворотки крови контрольных групп здоровых доноров и пациентов с незлокачественными заболеваниями) и 100% чувствительностью (появление маркера в сыворотке крови онкологических пациентов) на сегодняшний день нет [4]. Поэтому в применяемых и разрабатываемых системах детекции пока используются известные онкомаркеры с ограниченной диагностической специфичностью и чувствительностью. На сегодняшний день известно более 200 онкомаркеров белковой природы, однако только часть из них эффективно применяется в лабораторной клинической практике для диагностики и/или мониторинга эффективности лечения разных типов рака, как то: ПСА (рак предстательной железы, РПЖ); РЭА (рак молочной железы, РМЖ; рак легкого; рак желудка; рак толстой кишки); СА 15-3 (РМЖ); СА 125 (рак яичников, РЯ); альфа-фетопротеин (АФП) (рак печени; герминогенные опухоли); хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) (герминогенные и трофобластические опухоли); антиген плоскоклеточной карциномы (squamous cell carcinoma antigen, SCCА) (рак шейки матки); фрагмент цитокератина 19 (сytokeratin 19 fragment, CYFRA 21.1) (рак мочевого пузыря; рак легкого); нейронспецифическая енолаза (НСЕ) (рак легкого); СА 19-9 (рак поджелудочной железы; рак желудка; рак печени); белок S100 (меланома) и т.д. [38, 39]. Продолжается поиск новых специфических онкомаркеров, поэтому их число с каждым годом увеличивается.
Иммуноцитохимия и иммуногистохимия с использованием биоконъюгатов на основе флуоресцентных нанокристаллов
С успешным развитием эпохи нанотехнологии, флуоресцентные нанокристаллы привлекают все больший научный интерес в области биологических исследований. КТ активно адаптируют для флуоресцентной визуализации биомолекул и маркеров (рецепторы клеточной поверхности, компоненты цитоскелета, ядерные и цитоплазматические АГ). Разработаны эффективные технологии адресной доставки КТ в различные структуры клетки (цитоплазматическая мембрана, цитоплазма, ядро, ядрышко и т.д.) в различных типах образцов (культуры клеток, фиксированные образцы клеток, срезы тканей), как то: эндоцитоз, прямая микроинъекция, электропорация, адресная доставка, избирательное специфическое взаимодействие с белками клеточной поверхности [99]. В настоящее время опубликовано много интересных работ в области индивидуальной и многопараметрической иммуноцито- и иммуногистохимической детекции различных клеточных мишеней с использованием КТ [87, 100-103].
Возможность использования биоконъюгатов на основе флуоресцентных нанокристаллов для детекции АГ в фиксированных образцах клеток была впервые описана Bruchez с соавт. в 1998 году [104]. Вскоре после этого, с помощью зеленых и красных КТ удалось одновременно маркировать ядерные АГ и F-актиновые филаменты в культуре фиксированных фибробластов мыши. Детализированная трехмерная структура цитоскелета была реконструирована с помощью конфокальной микроскопии. Качество изображений, параметры разрешения и правильность графического воссоздания молекулярных структур с использованием КТ оптимизированы и сопоставимы с данными по классической детекции со стандартными флуорофорами Alexa [100]. Другой группе ученых в своих исследованиях удалось комбинировать три вида КТ (КТ с максимумами флуоресценции на 655; 705 и 800 нм), классические флуорофоры DAPI и Alexa 555 и зеленый флуоресцентный белок GFP (green fluorescent protein) для одновременной детекции разных клеточных структур (микротрубочки и микрофиламенты, везикулярные структуры, генетический материал клетки) и функциональных белков (протеинкиназа С) [105]. Ness с соавт. разработали комплексную процедуру иммуногистохимического окрашивания для высокочувствительной детекции внутриклеточных АГ в тканях мозга грызунов. Предложенная схема сочетает в себе принципы маркировки с помощью биоконъюгатов КТ с молекулярными зондами и ферментативного усиления сигнала [106]. Основные иммуногистохимические исследования с использованием КТ были выполнены на клеточных линиях или свежеизолированных образцах тканей. Процедуры маркировки с помощью КТ также удалось успешно адаптировать для детекции до четырех различных биомолекул в фиксированных образцах тканей пациентов [107, 108].
Помимо этого, КТ были адаптированы для маркировки и визуализации клеточных молекул и структур в многопараметрическом анализе на тканевых микрочипах. Так называемые тканевые микрочипы позволяют исследовать большое количество образцов тканей одновременно с помощью иммуногистохимического окрашивания. Caldwell с коллегами использовали два вида КТ (КТ с максимумами флуоресценции на 605 и 705 нм) для количественной детекции белковых мишеней E3 убиквитин-лигазы MDM-2 (mouse double minute 2 homolog) и -актина одновременно в 25 образцах ткани почечной карциномы [109]. Преимущества использования КТ для иммуногистохимического окрашивания тканевых микрочипов также были продемонстрированы на модели рака легкого. Анализируя уровень кавеолина-1 и ядерного АГ пролиферирующих клеток (proliferating cell nuclear antigen, PCNA) в качестве модельных АГ, исследователи пришли к выводу, что детекция с помощью биоконъюгатов КТ превосходит классические методы окрашивания [110]. Другая группа ученых использовала конъюгаты стрептавидина с КТ, имеющими максимумы флуоресценции на 605 и 545 нм, для оценки статуса HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) и ER белка (estrogen receptor-) при РМЖ. Аналогичным образом исследователи показали, что такой подход к окрашиванию образцов характеризуется большей чувствительностью и точностью по сравнению с использованием органических флуорофоров. Это оказалось особенно критично для идентификации низкого уровня экспрессии HER2 и ER белка [111].
Большая часть разработанных биоконъюгатов и нанодиагностических проб на основе КТ предназначены для адресной доставки и маркирования определенной молекулярной мишени и представляют собой комплекс флуоресцентного нанокристалла и распознающей молекулы АТ. Классические подходы к разработке и созданию таких нанопроб основаны либо на прямой конъюгации АТ с поверхностными функциональными группами модифицированного водорастворимого нанокристалла, либо на непрямом аффинном взаимодействии КТ, конъюгированных со стрептавидином, и биотинилированных АТ. Последний способ позволяет получить пробы с хорошими оптическими свойствами, но имеющие большой размер, превышающий 40 нм [112]. Это значительно ограничивает доступность нанопробы ко многим клеточным и тканевым мишеням [113]. Более того, распознающее АТ может иметь несколько участков биотинилирования, что препятствует эффективной ориентации его относительно поверхности КТ и снижает специфичность и эффективность связывания с молекулярной мишенью. Наиболее распространены методы синтеза нанодиагностических проб с помощью прямой химической конъюгации молекулы АТ с функциональными группами на поверхности нанокристалла (например, карбодиимидным методом). Такие флуоресцентные метки широко используются в биологических исследованиях in vitro [87, 103] и in vivo [114, 115]. Тем не менее, получаемые таким способом биоконъюгаты часто оказываются нефункциональными, либо имеют низкую специфичность к молекулярным мишеням в связи с неориентированным расположением АГ-связывающих участков молекулы АТ [113] (рис. 5Б).
Решением этой проблемы стала разработка метода контролируемого частичного восстановления дисульфидных связей полноразмерной молекулы АТ с получением индивидуальных функциональных фрагментов, состоящих из тяжелой и легкой цепей молекул иммуноглобулинов и сохраняющих функциональные АГ связывающие участки [116]. С помощью химической реакции связывания сульфгидрильных групп функционального фрагмента молекулы АТ и поверхностных аминогрупп КТ были получены высокоспецифические нанопробы с усовершенствованными распознающими и оптическими свойствами. Такие биоконъюгаты доказали свою эффективность для применения в биологических исследованиях [116].
Модификация поверхности флуоресцентных нанокристаллов производным полиэтиленгликоля
Подготовленные микросферы с 5-7-слойной полимерной оболочкой и поверхностным положительно заряженным слоем полимера (РАН), суспендировали в 0,5 мл воды Milli-Q и подвергали ультразвуковой обработке на водяной бане в течение 2 мин. При непрерывном перемешивании к суспензии микросфер по каплям добавляли 100-300 мкл 3-15 мг/мл раствора КТ, модифицированных тиол-ПЭГ-COOH, в 100 mM фосфатном буфере, рН 8,0. Суспензию подвергали ультразвуковой обработке в течение 2 мин, затем инкубировали пробы на ротационном шейкере 20 мин при 25C. Проводили 4 цикла инкубаций с промежуточными ультразвуковыми обработками суспензии на водяной бане. При необходимости количество циклов и общее время инкубации микросфер с КТ могло быть увеличено до 8-10 ч. Одноцветные микросферы с адсорбированными на поверхности КТ осаждали (8 мин 3500 g), ресуспендировали и отмывали центрифугированием в 2 мл воды Milli-Q, процедуру очистки от избытка КТ повторяли три раза. Осадок микросфер ресуспендировали в 0,5 мл воды Milli-Q.
Далее по протоколу, изложенному ранее, последовательно повторяли все процедуры формирования на поверхности кодированных микросфер дополнительных защитных полимерных слоев: шестого (РАН), седьмого (PSS), восьмого (РАН), девятого (PSS) и положительно заряженного десятого (РАН) слоев.
Для создания сверхъяркого оптического кода микросфер небольшие порции модифицированных КТ-ПЭГ-COOH одного типа последовательно адсорбировались на поверхности микросфер, чередуясь с индивидуальными положительно заряженными полимерными слоями (РАН).
Для создания сложносоставного многоцветного оптического кода между отдельными полимерными пластами (3-5 чередующихся пар полимерных слоев РАН/PSS) оболочки микросфер были включены индивидуальные популяции модифицированных КТ с различными максимумами флуоресценции и различными концентрациями их стоковых растворов.
Микросферы, кодированные КТ и суммарно покрытые 10-12-слойной полимерной оболочкой, хранили в воде Milli-Q в темноте при 4C, перед использованием переосаждали центрифугированием (8 мин 3500 g), используя воду Milli-Q.
Перед процедурой химической конъюгации с адаптерными молекулами (белок А/G) или моноклональными АТ оптически кодированные микросферы покрывали дополнительным полимерным слоем полиакрилата натрия (poly(acrylic acid, sodium salt), PAA, Mw 15000, Sigma-Aldrich) по аналогичной процедуре формирования полимерных слоев, описанной ранее, для получения поверхности микросфер, с экспонированными карбоксильными группами, необходимыми для эффективного связывания с биомолекулами. 2.5. Характеризация микросфер, кодированных флуоресцентными нанокрист аллами Морфология и спектральные свойства флуоресцентных микросфер были охарактеризованы с помощью эпифлуоресцентной микроскопии (Nicon Eclipse TE2000-S) и конфокальной микроскопии (A1Rsi Spectral Imaging Confocal System).
Детальная структура микросфер была исследована с помощью уникальной технологии сканирующей зондовой нанотомографии (scanning probe nanotomography, SPNT) [161]. Традиционная сканирующая зондовая микроскопия позволяет исследовать поверхностные морфологические наноструктуры объекта, получать лишь двумерные изображения поверхности и не может дать представление об объемной структуре образца. Последние разработки в области нанобиотехнологии позволили сконструировать уникальную установку, сочетающую ультрамикротомию образцов и микроскопические методы для исследования трехмерной структуры объектов на наноразмерном уровне. Для этого готовятся ультратонкие микротомные срезы образца (20 нм), полимеризованного в смолу, которые затем исследуются методами спектроскопии и атомно-силовой микроскопии (рис. 11). Полученные данные позволяют реконструировать детализированную трехмерную структуру изучаемого объекта.
Аналитические характеристики суспензионной системы на основе флуоресцентных микросфер
При анализе разработанной суспензионной системы для детекции двух форм онкомаркера РПЖ с помощью проточной цитометрии флуоресцентный код популяций микросфер детектировали в каналах FITC (микросферы, кодированные КТ 515 нм, детекция свободного ПСА) и PE (микросферы, кодированные КТ 581 нм, детекция общего ПСА). Флуоресценцию вторичной метки, используемой для визуализации иммунного комплекса, детектировали в канале PE-Cy5 (Tri-COLOR, 670 нм).
Для успешной реализации иммунодиагностического анализа онкомаркеров в суспензионной системе флуоресцентных микросфер необходимо ориентированным образом расположить распознающие АГ-специфические АТ к свободному и общему ПСА на поверхности индивидуальных популяций микросфер, кодированных КТ 515 и 581 нм, соответственно.
Микросферы с адаптерными молекулами на поверхности Первоначально была осуществлена попытка ориентированного связывания АГ-специфических АТ через адаптерные молекулы (белок A или G). Бактериальные белки А и G содержат в своей структуре специфические участки, обладающие высоким сродством к Fc-концевым фрагментам иммуноглобулинов класса G млекопитающих [5]. Рекомбинантные белки А и G широко используются в аффинной хроматографии в качестве аффинного носителя-сорбента, с которым специфически связываются иммуноглобулины G (АТ), для высокоизбирательного выделения моноклональных АТ из разного рода биологических образцов, таких, как культуральная среда, асцитная жидкость и т.д. Преимущества такого подхода в разработанной диагностической системе заключаются в правильной ориентации АГ-специфических участков молекулы распознающего АТ на поверхности микросферы за счет связывания его Fc-фрагментов с белком-адаптером, что гарантирует формирование полноценных функциональных иммунодиагностических микрочипов для количественного определения маркеров. Использование поверхностных адаптерных белков обеспечивает принципиальную возможность создания универсальных наборов популяций флуоресцентных микрочастиц, которые можно эффективно комбинировать и адаптировать для анализа различных профилей маркеров.
Однако дальнейшее исследование показало, что присутствие белка G на поверхности микросфер обеспечивает очень высокий сигнал неспецифического связывания компонентов иммунодиагностического комплекса. Несмотря на использование Fc-специфических F(ab)2 фрагментов поликлональных АТ, лишенных своих Fc-фрагментов, в качестве вторичной метки для визуализации детекторного комплекса неспецифический сигнал флуоресценции не удалось снизить.
Модифицированные процедуры блокирования поверхности с помощью различных блокирующих реагентов (1-5% раствор БСА или казеина высокой степени чистоты) также не привели к снижению неспецифического флуоресцентного сигнала.
В случае использования белка А в качестве адаптерной молекулы сигнал неспецифического связывания был в значительной степени снижен; калибровочные графики, построенные по результатам анализа калибровочных стандартов, имели вид зависимости средней интенсивности флуоресценции от концентрации АГ в пробе. Однако при анализе образцов сыворотки крови измеренные количественные показатели содержания исследуемых онкомаркеров имели заниженные значения и не коррелировали с данными, полученными с помощью классического ИФА. Такой анализ позволял лишь качественно, но не количественно оценить наличие (онкологический пациент с завышенными показателями содержания свободного и/или общего ПСА) или отсутствие (здоровый донор с низкими показателями содержания свободного и общего ПСА) определяемого маркера в сыворотке крови, и таким образом, качественно дифференцировать сыворотки здоровых доноров и больных РПЖ (рис. 22). По-видимому, такой эффект связан с тем, что некоторые субклассы иммуноглобулинов человека, 112 содержащиеся в экспериментальных образцах сыворотки крови, имеют большую аффинность к белку А, чем используемые в диагностической системе АГ-специфические моноклональные АТ мыши, и конкурируют с ними за участки связывания Fc-фрагментов.
Качественная оценка содержания общего ПСА в сыворотке крови здорового донора и больного раком предстательной железы (РПЖ) с помощью флуоресцентных микросфер с адаптерными молекулами белка А на поверхности.
Для эффективной диагностики и мониторинга онкологических процессов необходимо количественно контролировать уровень и соотношение ряда специфических маркеров и отслеживать изменение количественных показателей на самых начальных этапах при низких концентрациях, что, как правило, свидетельствует о начале развития патологического процесса. В этом случае эффективность терапии и вероятность выздоровления пациента будет значительно выше. Таким образом, разработанный вариант диагностической системы оказался неэффективным для определения количественного содержания специфических онкомаркеров в сыворотке крови.
Антиген-специфические микросферы с распознающими антителами на поверхности Следующим этапом в разработке эффективной диагностической суспензионной системы стало использование АГ-специфических популяций микросфер, полученных с помощью прямой конъюгации распознающих моноклональных АТ с суспензионными микрочастицами. Такой формат иммунодиагностического анализа позволяет исключить вторичные компоненты и упростить процедуру инкубаций, сократить время анализа и снизить вероятность возникновения неспецифического сигнала.
В этом случае распознающие моноклональные АТ против свободного и общего ПСА были напрямую конъюгированы с поверхностью флуоресцентных микросфер, кодированных КТ 515 нм и КТ 581 нм, соответственно, карбодиимидным методом. Химическая реакция конъюгации реализуется по механизму образования ковалентных связей между карбоксильными группами поверхностного полиакрилатного слоя микросфер и многочисленными аминогруппами белковой молекулы АТ при участии молекул-посредников. Поскольку белковые молекулы содержат большое количество аминогрупп, контроль ориентированной конъюгации АТ на поверхности микросферы затруднен и этот процесс носит вероятностный характер. Тем не менее, в дальнейших исследованиях было показано, что при определенном подобранном соотношении количества АТ на единицу поверхности микросферы происходит эффективное формирование полноценных иммунных комплексов с возможностью количественного определения специфических онкомаркеров в сыворотке крови.
Были протестированы различные количественные соотношения распознающих моноклональных АТ, взятых для конъюгации, в расчете на единицу поверхности микросфер: 5, 10, 20, 30 мкг на 106 микросфер с диаметром 4,08 мкм. Было установлено, что при использовании менее 10 мкг АТ для конъюгации разработанная суспензионная система достигает порога насыщения при связывании детектируемого маркера АГ специфическими микросферами уже в пределах выбранного диапазона калибровочных стандартов и не позволяет с достаточной точностью определить высокие сывороточные концентрации маркеров. При дальнейшем увеличении количества АТ, взятых для реакции конъюгации, не происходит значительного повышения эффективности связывания онкомаркеров и изменения характера (наклона) калибровочных кривых в выбранных диапазонах концентраций АГ. Это можно объяснить стерическими эффектами взаимодействия молекул и низкой эффективностью правильной ориентации распознающих центров АТ на поверхности микросфер и/или избыточностью их количества для выбранного диапазона определяемых концентраций маркеров. Таким образом, было установлено, что оптимальное и эффективное количество АГ-распознающих АТ составляет 10 мкг в расчете на 106 микросфер с диаметром 4,08 мкм.
![Формирование групп повышенного риска для выявления рака тела матки на основе многофакторного анализа экзо- и эндогенных факторов [Электронный ресурс]](/i/i/4334/195698.png "Формирование групп повышенного риска для выявления рака тела матки на основе многофакторного анализа экзо- и эндогенных факторов [Электронный ресурс] Маликова Лилия Владимировна")
