Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Молекулярные основы метода ФДТ 12
1.2. Фотосенсибилизаторы, применяемые в онкологии 15
1.3. Изучение фотосенсибилизаторов различных классов in vitro 17
Производные природного хлорофилла а и бактериохлорофилла а 17
Синтетические тетрагидро- и тетраазапорфирины 19
1.4. Этапы и биологические модели при изучении фотосенсибилизаторов 21
1.5. Критерии оценки выживаемости клеток в экспериментах in vitro 22
1.6. Накопление и локализация фотосенсибилизаторов в опухолевых клетках 23
1.7. Пути гибели опухолевых клеток при ФДВ: некроз и апоптоз 26
Глава 2. Материалы и методы исследования 30
Глава 3. Результаты и обсуждение собственных исследований 38
3.1. Разработка методических подходов к изучению новых экзогенных ФС в системе in vitro на опухолевых клетках человека 38
3.2. Изучение новых экзогенных фотосенсибилизаторов 45
3.2.1. Производные природного хлорофилла а 46
3.2.1.1. Производные пирофеофорбида а 46
3.2.1.2. Производные хлорина 50
Производные хлорина е6 51 Производные хлоринарв 57
3.2.2. Производные природного бактериохлорофилла а 61
Производные бактериохлоринар 62
3.2.3. Синтетические тетрагидропорфирины 69
3.2.4. Тетраазапорфирины (фталоцианины) 77
Отрицательно заряженные производные фталоцианина 77
Положительно заряженные производные фталоцианина 86
3.3. Изучение внутриклеточной локализации ряда красителей методом КОМИРСИ 91
3.3.1. Пурпуринимиды 92
3.3.2. Отрицательно заряженные фталоцианины 94
Заключение 95
Выводы 101
Практические рекомендации 103
Список литературы 104
- Молекулярные основы метода ФДТ
- Разработка методических подходов к изучению новых экзогенных ФС в системе in vitro на опухолевых клетках человека
- Синтетические тетрагидропорфирины
- Положительно заряженные производные фталоцианина
Молекулярные основы метода ФДТ
К фотосенсибилизаторам относятся соединения, способные при поглощении света определенной длины волны индуцировать фотохимические реакции с образованием активных форм кислорода, повреждающих мембраны и органеллы клеток, наиболее интенсивно накопивших фотосенсибилизатор, вызывая их гибель по механизму некроза и апоптоза [17,116,150].
Первичные стадии фотодинамического действия одинаковы как в живых клетках, так и в растворах органических соединений. По характеру первичного процесса все фотохимические реакции можно разделить на два типа (тип I и тип II). К первому типу относятся реакции, начальной стадией которых служит реакция возбужденных молекул фотосенсибилизатора с субстратами окисления, а ко II типу - процессы, в которых первичным является взаимодействие возбужденных молекул фотосенсибилизатора с кислородом [18, 37, 78].
В реакциях I типа при поглощении кванта света молекула сенсибилизатора переходит из основного состояния в возбужденное (синглетное) состояние С. Затем происходит либо обратный переход в основное состояние, сопровождающееся излучением кванта света -флуоресценцией, либо синглетная форма переходит в триплетную. Триплетная форма ФС взаимодействует непосредственно с молекулами субстрата, отрывая у них электроны или атомы водорода, в результате чего образуются свободные радикалы, которые затем могут вступать во взаимодействие либо с другими субстратами, вызывая их окисление, либо с молекулярным кислородом, образуя перекисные радикалы. Общий механизм по типу I представлен уравнениями:
C + hv-» C
C + RH- CH + R СН + 02-»С + Н02 R +02-»R02 В живых клетках процессы еще более усложняются из-за присутствия ферментов - пероксидаз и каталазы, активирующих разложение перекисей или их реакции с биосубстратами [17].
При втором механизме (тип II) - возбужденная молекула сенсибилизатора взаимодействует с кислородом, давая активную синглетную форму кислорода !02. Последняя обладает значительно большей подвижностью по сравнению с формой С (тип I) и более активно окисляет внутриклеточные элементы клетки. Механизм по типу II обычно преобладает при ФДТ.
Молекула сенсибилизатора С (рис. 1) при облучении переходит из основного состояния So в синглетное состояние Si и затем в результате потери части энергии - в долгоживущее триплетное состояние Ті. На стадиях синглетного и частично триплетного состояний сенсибилизатор может участвовать в фотохимических реакциях типа I. При достаточном времени жизни триплетного состояния и энергии, превышающей 94 кДж, возможно образование синглетного кислорода 1Ог, согласно переходу 5. В этом случае разрушение клетки протекает, в основном, по типу II [22, 116, 138].
Таким образом, в результате фотохимических процессов, проходящих по типу I и II, образуются активные формы кислорода (АФК), приводящие к деструктивным эффектам, которые приводят к разрушению жизненно-важных структур клеток и их гибели [93, 126]. Оба типа фотохимических реакций могут протекать одновременно, преимущественный ход реакций I или II типа зависит от конкретного фотосенсибилизатора, соотношения концентраций ФС, субстрата и молекулярного кислорода в среде, а также констант скоростей реакций [17]. Молекула возбужденного фотосенсибилизатора может также переходить в основное состояние с излучением кванта света - флуоресценцией. Избирательное накопление фотосенсибилизатора в злокачественных опухолях и возможность его обнаружения по спектрам, характерной флуоресценции в области, освещаемой лазерным излучением определенной длины волны, составляют основу метода флуоресцентной диагностики.
Разработка методических подходов к изучению новых экзогенных ФС в системе in vitro на опухолевых клетках человека
В настоящее время доклиническое изучение фотосенсибилизаторов как фармакологических средств для онкологии не приобрело пока соответствующей методической базы, что приводит к произвольному использованию разнообразных методик в работе. Отсутствие единой системы оценки эффективности красителей в биологической системе влечет за собой получение неадекватных результатов в исследованиях, а также трудности при их сравнении и выбор наиболее перспективных соединений. Поэтому одной из первоочередных задач диссертационной работы являлась разработка методики скрининга красителей с учетом их физико-химических, фотофизических и биологических свойств, где наиболее сложной и неизученной являлась задача адекватной оценки фотоиндуцированной активности соединений относительно опухолевых клеток с учетом вариабельности эффективности ФДВ от множества параметров.
При разработке многопараметрической системы оценки фотоиндуцированной цитотоксичности фотосенсибилизаторов при ФДВ использовали официнальные препараты «Фотогем», «Фотосенс» и «Радахлорин».
На первом этапе исследований проводили стандартизацию биологической модели. В работе использовали культуры опухолевых клеток монослойных культур различного происхождения: НЕр2 (эпидермоидная карцинома гортаноглотки), А549 (карцинома легкого), НТ29 (карцинома толстой кишки) и Т24 (карцинома мочевого пузыря), что обусловлено спецификой проведения ФДТ в клинике. Работу с культурой начинали с изучения кривой роста [19], поскольку определение параметров ростового цикла весьма существенно как для пассирования культуры, так и для проведения экспериментов в системе in vitro. Поведение клеток и их биохимические свойства могут существенно различаться на разных фазах роста клеток, поэтому важно контролировать стадию ростового цикла, на которой в культуру добавляют различные соединения (противоопухолевые, антибиотики). На рис.9-11 представлены кривые роста некоторых клеточных культур.
Используя данные, полученные при анализе кривой роста, выбирали оптимальную концентрацию клеток, так чтобы через 24-28 часов клетки находились в экспоненциальной фазе роста (логарифмически), с образованием субконфлюэнтного монослоя, так как плотность монослоя существенным образом может влиять на фотоиндуцированную активность исследуемых соединений. Таким образом, плотность клеток при посеве в дальнейших экспериментах составила 60x104 клеток/мл.
Второй этап включал оценку фотоиндуцированной цитотоксичности фотосенсибилизаторов в мультипараметрической системе в зависимости от их концентрации в среде инкубации, дозы света при воздействии, временного интервала после внесения красителя до облучения, проведения облучения в присутствие красителей и с их удалением непосредственно перед облучением.
Поскольку одним из составляющих ФДВ in vitro является световое воздействие, которое можно избрать постоянным для всех экспериментов, сначала определяли оптимальную дозу света, используя одну клеточную линию (НЕр2) и время инкубации, равное 2 часам при варьировании концентрации соединений и плотности энергии. Результаты этих экспериментов показали, что плотность энергии 2,5 и 5 Дж/см была недостаточной для полной реализации фототоксического эффекта для всех трех фотосенсибилизаторов, в то время как эффективность ФДВ при 10 и 20 Дж/см2 оказалась сопоставимой. Поэтому в дальнейших исследованиях плотность энергии составляла 10 Дж/см (табл. 2).
Продолжая исследования на клетках культуры НЕр2 с выбранной дозой света 10 Дж/см и облучением в присутствии фотосенсибилизатора в среде в зависимости от времени инкубации с препаратами «Фотогем», «Фотосенс» и «Радахлорин» в широком диапазоне концентраций. Как видно из данных, представленных нарис. 12, концентрационная зависимость и время инкубации с препаратами, необходимые для достижения максимального эффекта, являлись индивидуальными показателями для каждого фотосенсибилизатора. Это свидетельствует о том, что для адекватной оценки фотоиндуцированной активности соединений целесообразно включить в протокол исследования оценку данных параметров.
Для косвенной оценки внутриклеточного накопления красителей облучение проводили параллельно в двух вариантах: в присутствии красителя в среде и с его удалением непосредственно перед облучением. Сопоставление эффектов, полученных в этих двух вариантах облучения, позволяет оценить вклад фотоиндуцированного повреждения, обусловленного красителем, накопившимся внутри клеток. Следует отметить, что при облучении клеток после удаления Фотогема, Фотосенса или Радахлорина из среды инкубации ИК50 возрастает. Это указывает на то, что только часть фотосенсибилизатора проникает в клетки и накапливается в них. При этом абсолютные величины, характеризующие эффективность фотосенсибилизаторов при облучении клеток после удаления препаратов из среды инкубации, не влияют на результат их сравнительной оценки (рис. 13).
Таким образом, при первоначальном изучении новых фотосенсибилизаторов целесообразно включить в протокол оценку их фотоиндуцированной цитотоксичности на одной клеточной линии, при фиксированной дозе света 10 Дж/см , в зависимости от концентрации, времени инкубации до воздействия, вариантами облучения в присутствии фотосенсибилизатора в среде и с его удалением.
По данным литературы отмечено, что фотоиндуцированная активность фотосенсибилизаторов зависит от природы опухолевых клеток в культуре и плотности монослоя на момент воздействия. Поэтому мы исследовали фотоиндуцированную цитотоксичность новых соединений на 3-х различных культурах опухолевых клеток человека (эпидермоидной карциноме гортаноглотки - НЕр2, карциноме легкого - А549, карциноме толстой кишки - НТ29) при различной плотности клеточной популяции (от 3x104 до 12x104 клеток/мл).
Показано, что эффективность при ФДВ Фотосенса и Радахлорина на разных культурах отличалась, а клетки в конфлюэнтном монослое были более устойчивы к фотодинамическому воздействию (рис. 14, 15). Эти данные подтвердили целесообразность изучения фотоиндуцированной цитотоксичности соединений на нескольких клеточных линиях (с предварительной оценкой оптимального времени инкубации до воздействия).
Таким образом, на основании полученных результатов разработана многопараметрическая методика тестирования соединений на опухолевых клетках in vitro для выявления их максимальной фотоиндуцированной активности. Для этого на первом этапе оценивали фотоиндуцированную цитотоксичность соединений на одной клеточной линии при фиксированной дозе света, варьируя концентрации красителей, время инкубации до воздействия светом, облучение в присутствии соединений в среде и с их удалением непосредственно перед воздействием. На втором этапе проводили углубленное изучение эффективности фотосенсибилизаторов при ФДВ по той же методике, расширив панель клеточных культур. Данная методика включена в «Методические указания по изучению фотоиндуцированных противоопухолевых свойств фармакологических веществ и лекарственных средств».
Поскольку физико-химические и фотофизические свойства в значительной степени определяют как фотоиндуцированную активность фотосенсибилизаторов, так и их перспективность для фармакологии, в протокол исследования перед биологическими испытаниями включали изучение растворимости соединений, их стабильности в темновых условиях и при облучении. Это дало возможность из 70 субстанции выбрать 61 и исследовать их по предложенной программе.
Таким образом, скрининг новых экзогенных фотосенсибилизаторов на первом этапе включал изучение и оценку их физико-химических и фотофизических свойств с целью выявления красителей, растворимых в биосовместимых средах и наиболее устойчивых как без воздействия света, так и при облучении. На втором этапе - изучение и оценку фотоиндуцированной активности и темновои токсичности на культурах опухолевых клеток человека с целью отбора наиболее перспективных соединений.
Синтетические тетрагидропорфирины
Поиск новых соединений бактериохлоринового ряда проводится в двух направлениях - многочисленными модификациями соединений на основе природных пигментов и получение синтетических соединений. Впервые в настоящей работе исследованы тетрагидропорфирины, полученные восстановлением соответствующих порфиринов. Эти соединения имеют максимум поглощения в области 740-760 нм, коэффициент экстинкции - 7-8х104 МҐсм-1. Квантовый выход синглетного кислорода - 0,3-0,45. Преимуществом данных фотосенсибилизаторов является гидрофильность, что делает возможным их использование в виде водных растворов. Изучены производные с различными боковыми заместителями и центральными атомами металлов (табл. 16).
1. Физико-химические свойства синтетических тетрагидропорфиринов. Стабильность красителей в динамике в культуральной среде При изучении абсорбционных и флуоресцентных спектров отмечено, красители 36-39 и 41 стабильны при выбранном временном диапазоне, тогда как соединения 40, 42 и 44 оказались менее стабильными в культуральной среде в динамике. Отмечено снижение оптической плотности и интенсивности флуоресценции в течение 24 часов в 1,5 раза без изменения максимумов поглощения и флуоресценции.
Следует отметить, что при флуоресцентном анализе цинкового комплекса тозильного производного (43) выявлено отсутствие длинноволнового пика, смещенного относительно максимума поглощения вправо (закон Стокса), интенсивность полосы с максимумом на 700 нм свидетельствовала о деградации красителя в течение короткого промежутка времени, поэтому в дальнейших исследованиях данное соединение не использовалось (табл. 17,18).
2. Оценка фотовыцветания по спектрам флуоресценции Оценена устойчивость в растворе представленного класса фотосенсибилизатора при воздействии светом. Выявлено, что интенсивное выгорание соединений 38-42 и 44 происходила при дозе света 5 Дж/см с дальнейшим снижением интенсивности флуоресценции в среднем в 1,5-3 раза при увеличении дозы света до 10 Дж/см, а фотовыцветание фотосенсибилизаторов 36 и 37 было менее интенсивным, что коррелировала с данными, полученными в биологических тестах (рис.33).
На рис. 34 и 35, в качестве демонстационного материала, представлены спектры флуоресценции тетрабромидного (36) и октабромидного (37) производных до воздействия светом и после облучения.
3. Фотоиндуцированная активность синтетических бактериохлоринов на опухолевых клетках в культуре
В скрининговой системе на культуре клеток НЕр2, при варьировании концентрацей красителей в среде инкубации и времени до воздействия, оценена фотоиндуцированная цитотоксичность тетрагидропорфиринов. Наибольшая фотоиндуцированная активность выявлена у тетрабромидного (36) и октабромидного (37) безметальных производных (величина ИК50 которых составляла 0,34±0,07 и 0,37±0,08 мкМ, соответственно) и сравнима с активностью ряда производных природного бактериохлорофилла а (32, 34). Меньшую фотоиндуцированную цитотоксичнеоть проявляли красители 39, 41, 42 и 44 (ИК50 0,7±0,08 мкМ, 1,5±0,07 мкМ, 0,79±0,09 мкМ и 2,75±0,12 мкМ, соответственно), наименее активными оказалось соединение 40 (ИК50- 9,7±1,2 мкМ) (рис. 36).
Следует отметить при этом, что введение атома цинка в макроцикл в значительной степени (в 30-35 раз) снижало фотоиндуцированную активность фотосенсибилизаторов (38), ингибирование пролиферации которых не превышало 25-30%, что не считалось значимым в экспериментах in vitro (рис. 37).
Оценка фотоиндуцированной активности фотосенсибилизатров в зависимости от времени инкубации показала, что максимальный эффект наблюдался при 2-х часах инкубации соединений с опухолевыми клетками (табл. 19).
Таким образом, при оценке физико-химических и фотофизических свойств, впервые синтезированных тетрагидропорфиринов, показано, что соединения 36-39 и 41 были стабильны в растворах без воздействия светом, а фотовыцветание фотосенсибилизаторов 36 и 37 оказалось менее интенсивным, чем других красителей данного класса.
При оценке биологических свойств фотосенсибилизатров выявлено, что фотоиндуцированная активность красителей зависела от характера боковых заместителей и центрального атома металла. Наибольшую фотоиндуцированную цитотоксичность относительно клеток в культуре проявили безметальные тетрабромидное (36) и октабромидное (37) производные (величина ИК о — 0,34±0,07мкМ и 0,37±0,08 мкМ, соответственно). Отмечено, что присутствие в боковом заместителе карбоксильной группы (40) в значительной степени снижало фотоиндуцированную активность соединения (MKso — 9,7±1,2мкМ), а введение атома цинка в макроцикл красителя (38) делало соединение не активным (ингибирование пролифирации не превышало 25-30%). Безметальные тетрабромидное (36) и октабромидное (37) производые тетрагидропорфиринов переданы для изучения противоопухолевой активности на животных.
Положительно заряженные производные фталоцианина
Положительно заряженные производные фталоцианина рассматриваются как потенциальные агенты не только для ФДТ рака, но и для антимикробной ФДТ. Изучены катионные производные фталоцианина, отличающиеся центральными атомами металла и несущими заряд заместителями (рис. 44).
1. Физико-химические свойства положительно заряженных производных фталоцианина
Стабильность красителей в динамике в кулътуральной среде
Анализ полученных данных показал, что из всех изученных соединений безметальное холиновое производное фталоцианина H2PcChol8 (59) характеризовалось наименьшей устойчивостью в среде Игла с добавлением 7%ЭТС. Так, через 2 часа инкубации отмечалось снижение величины оптического поглощения в 1,5 раза по сравнению с величиной детектированной до сразу после растворения, при увеличении времени инкубации до 24 часов выявлено дальнейшее снижении оптической плотности. Поэтому в дальнейших экспериментах H2PcChol8 не использовали.
Соединения 57, 58, 60 и 61 характеризовались стабильность в динамике. При проведении флуоресцентного анализа наблюдалась та же закономерность (табл. 23).
2. Оценка фотовыцветания по спектрам флуоресценции
Оценка фотовыцветания фотосенсибилизаторов в культуральной среде в зависимости от дозы света показала, что при 5 Дж/см происходило незначительное выгорание соединений, при увеличении плотности энергии до 10 Дж/см интенсивности флуоресценции оставалась практически неизменной, что свидетельствовало об устойчивости положительно заряженных производных фталоцианина к световому воздействию (табл. 24).
3. Фотоиндуцированная активность катионных производных фталоцианина на опухолевых клетках в культуре.
В ряду холиновых и пиридиниевых производных наибольшей фотоиндуцированной противоопухолевой активностью обладали цинковые комплексы, а менее активными - алюминиевые комплексы (рис.45).
Максимальная эффективность соединений при ФДВ выявлена при 2 х часах инкубации, увеличение временного интервала до 6 часов не приводило к изменению величины ИК50 (табл. 25).
Для наиболее активных фотосенсибилизаторов, ZnPcCholg и ZnPcPym8, показано, что красители эффективно проникали в опухолевые клетки и накапливались в них. Так, проведение облучения непосредственно после удаления фотосенсибилизаторов из среды инкубации не приводило к изменению фотоиндуцированной цитотоксичности фотосенсибилизаторов ZnPcChol8 (57) и ZnPcPymg (60) (величина ИК50 при облучении в присутствии красителей составляла 0,29±0,07 мкМ и 0,30±0,П мкМ, а при их удалении - 0,32±0,08 МкМ и 0,29±0,10 мкМ, соответственно).
По расширенной программе скринига с использованием наиболее активного положительно заряженного производного фталоцианина -холинового производного фталоцианина цинка проведено сравнительное изучение эффективности фотодинамического воздействия на различных опухолевых клетках человека эпителиального происхождения: карцинома толтой кишки человека - НТ29, карцинома мочевого пузыря человека -Т24, аденокарцинома легкого человека - А549 и эпидермоидной карциномы гортаноглотки - НЕр2 (рис.46).
Показано, что чувствительность клеток к фотодинамическому воздействию с фотосенсибилизатором возрастала в ряду: НТ29 Т24 А549 НЕр2 (величина ИК50 составляла 2,00±0,13, 1,07±0,12, 0,48±0,09 и 0,30±0,08 мкМ, соответственно). Следует отметить, что даже самые устойчивые клетки культуры (НТ29) в данном эксперименте погибали при достаточно низких концентрациях соединения, в то время как величина ИК5о официнального препарата «Фотосенс» для НТ29 составляла 19,0±0,5 мкМ.
Таким образом, изученные катионные производные фталоцианина характеризовались стабильностью в растворах и не подвергались фотовыцветанию при воздействии светом (исключением являлось безметальное холиновое производное). Показано, что фотоиндуцированная активность соединений не зависела от природы боковых заместителей, но наличие атома цинка в центре макроцикла в значительной степени повышало специфическую активность соединений. Наибольшей эффективностью при ФДВ обладал цинковый комплекс с холиновым заместителем (57), которое выбран для изучения в системе in vivo, и на его основе разработан препарат «Холосенс-лио».
![Дифференцированный подход к профилактике и лечению гестозов второй половины беременности на основе оценки состояния вегетативной нервной системы [Электронный ресурс]](/i/i/4383/208911.png "Дифференцированный подход к профилактике и лечению гестозов второй половины беременности на основе оценки состояния вегетативной нервной системы [Электронный ресурс] Мохаммад Хуссейн Касем")
