Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. Обзор литературы 13
Глава 1. Фотодинамическая терапия и флуоресцентная диагностика 13
1.1. Механизмы фотодинамического эффекта и поражения новообразований 13
1.2. Использование флуоресцентных свойств фотосенсибилизаторов для
флуоресцентной диагностики 17
Глава 2. Фотосенсибилизаторы 19
2.1. Требования к фотосенсибилизаторам 19
2.2. Фотосенсибилизаторы первого поколения - порфирины 20
2.3. Фотосенсибилизаторы второго поколения 21
2.3.1. Тетраазапорфирины 21
2.3.2. Фотосенсибилизаторы на основе гидрированных форм порфиринов 24
* 2.3.3. Производные бактериохлорофилла и бактериохлорофиллид-серин 25
Глава 3. Липосомы в фотохимиотерапии 28
3.1. Липосомы как средство для введения и адресной доставки фотосенсибилизаторов 28
3.2. Липосомы в ФДТ 33
3.3. Катионные лекарственные формы для доставки лекарств к патологическим неоваскуляризациям 38
3.4. Фотоактивируемые липосомальные препараты 39
3.5. Липосомы в качестве моделей и средств для исследования и совершенствования механизмов фотосенсибилизации и ФДТ 44
ЧАСТЬ II. Материалы и методы 51
2Л.Бактериохлорофиллид-серин 51
2.2. Фенилтиопроизводные фталоцианинов 53
2.3. Получение липосомальных форм препаратов фенилтиопроизводных фталоцианинов 55
2.4. Аппаратура и методики для исследования фотосенсибилизаторов in vivo и проведения ФДТ 60
2.5. Экспериментальные животные и опухолевые модели 69
ЧАСТЬ III. Собственные исследования 73
Глава 1. Исследование спектральных, фармакокинетических и
фотодинамических свойств бактериохлорофиллид-серина 73
1.1. Исследования бактериохлорофиллид-серина в растворах 73
1.2. Исследование поглощения бактериохлорофиллид-с ерина in vivo 75
1.3. Исследования особенностей флуоресценции бактериохлорофиллид-серина, динамики и селективности его накопления в тканях экспериментальных животных 78
1.4. Изучение фотодинамического действия бактериохлорофиллид-серина in vivo. 83
Глава 2. Исследование фенилтиопроизводных фталоцианинов в липосомальной форме в качестве потенциальных агентов для фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики 87
2.1. Исследование тетра-3-фенилтиофталоцианина гидроксиалюминия 87
2.1.1. Исследование внутритканевого поглощения и флуоресцентных свойств тетра-3-фенилтиофталоцианина гидроксиалюминия 87
2.1.2. Исследование динамики и селективности накопления тетра-3-фенилтиофтапоцианина гидроксиалюминия 91
2.1.3. Исследование эффективности фотодинамического действия тетра-3-фенилтиофталоцианина гидроксиалюминия 94
2.2. Исследование безметального тетра-З-фенилтио-тетра-5-тре/и-бутилфталоцианина 98
| 2.2.1. Исследование внутритканевого поглощения и флуоресцентных свойств
безметального тетра-З-фенилтио-тетра-5-трет-бутилфталоцианина 98
2.2.2. Исследование динамики и селективности накопления безметального
тетра-фенилтио-тетра-5-трет-6утилфталоцианина 101
2.2.1.. Исследование эффективности фотодинамического действия
безметального тетра-3-фенилтио-тетра-5-треш-бутилфталоцианина 103
2,3. Исследование тетра-3-фенилтиофталоцианина цинка 107
2.3.1. Исследование внутритканевого поглощения и флуоресцентных свойств тетра-3-фенилтиофталоцианина цинка 107
2.3.2. Исследование динамики и селективности накопления тетра-3-фенилтиофталоцианина цинка 110
2.3.3. Исследование эффективности фотодинамического действия тетра-3-фенилтиофталоцианина цинка 111
ЧАСТЬ IV. Обсуждение результатов 113
4.1. Возможные механизмы селективности бактериохлорофиллид-серина в опухолевой ткани 113
4.2. Некоторые возможности использования особенностей флуоресценции бактериохлорофиллид-серина для флуоресцентной диагностики 116
4.3. Эффективность ФДТ с бактериохлорофиллид-серином и пути ее повышения 121
4.4. Особенности накопления фенилтиозамещенных фталоцианинов в опухоли 123
4.5. Анализ результатов ФДТ с фотосенсибилизаторами на основе липосомальных форм фенилтиозамещенных фталоцианинов и некоторые
возможности повышения ее эффективности 125
Выводы 128
Список литературы 130
- Механизмы фотодинамического эффекта и поражения новообразований
- Фотосенсибилизаторы первого поколения - порфирины
- Катионные лекарственные формы для доставки лекарств к патологическим неоваскуляризациям
- Получение липосомальных форм препаратов фенилтиопроизводных фталоцианинов
Введение к работе
Актуальность темы
Одной из актуальных задач современной онкологии является разработка новых противоопухолевых препаратов, обеспечивающих максимальное разрушение опухоли при минимальном повреждении нормальных клеток и тканей организма. Сложность этой задачи обусловлена тем, что цитотоксическая активность препарата проявляется прежде всего по отношению к наиболее чувствительным клеткам организма (ретикулоэндотелиальной и иммунной систем, кроветворных органов и т.д.). Одним из перспективных путей совершенствования химиотерапии является повышение избирательности действия препарата на опухоль за счет адресации его воздействия дополнительными факторами.
Фотохимиотерапия новообразований - направление противоопухолевой терапии, в котором воздействие на ткань введенного химиотерапевтического агента инициируется облучением сенсибилизированных патологических тканей световым излучением, поглощаемым этим агентом.
Фотодинамическая терапия (ФДТ) является наиболее активно развивающимся направлением фотохимиотерапии. При проведении ФДТ в организм пациента вводят препарат-фотосенсибилизатор, а затем облучают патологический участок оптическим излучением, поглощаемым фотосенсибилизатором (ФС). Свет выполняет функции адресации воздействия и является источником энергии для фотобиохимической реакции, приводящей к образованию в опухолевой ткани и/или сосудах опухоли цитотоксических агентов (активных форм кислорода).
ФДТ обладает рядом преимуществ по сравнению с химио-и радиотерапией, в частности:
-избирательность фотодинамического воздействия определяется как селективностью накопления фотосенсибилизатора, так и локальностью светового облучения;
-фотодинамическое воздействие ослабляет иммунную систему пациента в меньшей степени, чем химио- и радиотерапия.
В последнее время в онкологической диагностике широкое распространение получили методы, основанные на использовании флуоресцирующих ФС, которые избирательно накапливаются в патологических тканях. Это позволяет, обнаружив участок с повышенной интенсивностью флуоресценции, предположить наличие в нем патологического процесса. Несомненные достоинства метода флуоресцентной диагностики (ФД): неинвазивность, быстродействие, возможность совмещения процедуры с терапевтическим лазерным воздействием для проведения ФДТ -делают этот метод перспективным для обнаружения очагов рада заболеваний преимущественно поверхностной и внутриполостных локализаций.
Однако созданные к настоящему времени ФС на основе производных гематопрофирина ("Photofrin-2", "Фотогем"), сульфофталоцианинов ("Фотосенс"), хлоринов ("Foscan") обладают недостаточно высокой селективностью накопления в опухоли по сравнению с нормальной тканью (индекс селективности лежит обьгано в диапазоне 1,5-3). Возбуждение этих ФС осуществляется светом в диапазоне 600-700 нм, сильно поглощаемым самой биологической тканью, что ограничивает глубину воздействия и снижает эффективность ФДТ и ФД. Многие ФС в течение длительного времени (от недель до месяцев) сохраняют высокую концентрацию в коже, что приводит к длительной кожной фототоксичности и необходимости соблюдения пациентом "темнового" режима, снижая тем самим качество его жизни.
Необходимость совершенствования методов фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики опухолей делает актуальной задачу создания
ФС с высокой фотодинамической активностью и селективностью накопления в опухолях по отношению к нормальным тканям.
Не менее важными и актуальными являются задачи оптимизации фармакокинетики ФС. Их биораспределение и динамика изменения концентрации в тканях и органах должны обеспечить:
достижение высокой селективности накопления ФС в опухоли по отношению к нормальной ткани и коже;
сохранение высокой концентрации ФС в опухоли в течение времени, небходимого для проведения терапевтических и/или диагностических процедур;
- достаточно большую скорость снижения концентрации ФС после
завершения процедур за счет выведения из организма и/или метаболизма до
значений, обеспечивающих отсутствие или минимизацию остаточных
последствий их применения.
Одним из важных и актуальных направлений повышения эффективности фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики является поиск ФС с поглощением в спектральном диапазоне 700-800 нм, в котором собственное поглощение биологических тканей минимально. Использование таких ФС позволяет минимизировать потери на собственное поглощение ткани, увеличить глубину проникновения возбуждающего света и, за счет оптимального выбора их концентрации в тканях, обеспечить преимущественное воздействие на патологический очаг, расположенный на определенной глубине под облучаемой поверхностью.
Цель исследования
Исследование бактериохлорофиллид-серина и фенилтиопроизводных фталоцианинов в качестве потенциальных фотосенсибилизаторов для фото динамической терапии и флуоресцентной диагностики новообразований.
Задачи исследования
Исследование in vivo поглощения и флуоресценции бактериохлорофиллид-серина, изучение динамики и селективности его накопления в опухоли по сравнению с нормальной тканью.
Исследование фотодинамической активности бактериохлорофиллид-серина.
Получение липосомальных дисперсий фенилтиопроизводных фталоцианинов.
Исследование in vivo поглощения и флуоресценции фотосенсибилизаторов на основе липосомальных дисперсий фенилтиопроизводных фталоцианинов, изучение динамики и селективности их накопления в опухоли по сравнению с нормальной тканью.
Исследование фото динамической активности фотосенсибилизаторов на основе липосомальных дисперсий фенилтиопроизводных фталоцианинов.
Научная новизна
Впервые спектрально-флуоресцентным методом изучена
фармакокинетика бактериохлорофиллид-серина в ранний период после его
введения и показано, что максимум концентрации этого ФС в тканях и органах
достигается через 15-20 минут после введения. Селективность накопления
препарата в опухоли по сравнению с нормальной тканью в этом временном
промежутке составляет примерно 4:1, а через 4 часа после введения достигает
значения 9:1. Обнаружены особенности спектров флуоресценции в опухоли и
нормальных тканях, обусловленные различиями в них метаболизма
бактериохлорофиллид-серина и позволяющие совершенствовать
флуоресцентный метод обнаружения опухолей и определения их границ. Показано, что терапевтическое действие ФДТ с использованием бактерихлорофиллид-серина осуществляется, в основном, за счет нарушения
кровотока в сосудистой системе опухоли, а также некроза и апоптоза опухолевых клеток.
Впервые получены фотосенсибилизаторы на основе липосомальных дисперсий фенилтиопроизводных фталоцианина с поглощением в спектральном диапазоне 710-750 нм. Проведены экспериментальные исследования их фармакокинетики и фотодинамической эффективности. Показана перспективность исследования этого класса ФС для флуоресцентной диагностики и фото динамической терапии новообразований.
Практическая значимость работы
Получены и исследованы новые высокоэффективные
фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики на основе липосомальных дисперсий ряда фенилтиопроизводных фталоцианинов с поглощением в спектральном диапазоне максимальной прозрачности биологической ткани.
Уточнена фармакокинетика фотосенсибилизатора
бактериохлорофиллид-серин, что позволило оптимизировать время проведения ФДТ и обеспечить ее высокую эффективность.
Предложен новый подход для флуоресцентного обнаружения и определения границ опухолей, основанный на различиях в форме спектра флуоресценции бактериохлорофиллид-серина в опухоли и нормальных тканях.
Апробация работы
Материалы приведенных в диссертационной работе исследований были представлены на следующих научных сообществах:
- Congress ILLA7003, VIII International Conference on Laser and laser-information technologies: fundamental problems and applications (Plovdiv, September 27 - October 1,2003);
*
-Всероссийской научно-практической конференции "Отечественные
противоопухолевые препараты" (Москва, 17-19 марта 2004 г);
- III съезде онкологов и радиологов СНГ (Минск, 25-28 мая 2004 г);
-16th International Congress of Anti-Cancer Treatment (Paris, February 1-4, 2005).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ.
Объем и структура диссертации
Диссертация содержит 153 страницы машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, трех глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение, общих выводов и списка литературы, включающего 26 отечественных и 206 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 64 рисунками и 1 таблицей.
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Механизмы фотодинамического эффекта и поражения новообразований
Фотодинамическая терапия основана на совместном воздействии света, фотосенсибилизаторов и физиологически содержащегося в биологических тканях молекулярного кислорода, приводящем к цитотоксическому эффекту [56,59,119].
Общим свойством всех фотосенсибилизаторов (ФС) является их способность превращать энергию поглощенного светового излучения в энергию химических превращений [5,6,24,72,74,96,141]. При поглощении фотона с определенной энергией молекула ФС переходит в одно из верхних возбужденных электронных состояний, а затем, в результате быстрой релаксации, на самый нижний уровень синглетного возбужденного состояния ]S (рис.1), время жизни которого составляет примерно 10 наносекунд, что очень мало для существенного взаимодействия с окружающими молекулами.
Кроме того, для триплетных возбужденных состояний характерны значительно большие значения времени жизни, чем для синглетных возбужденных состояний (в диапазоне микро- и миллисекунд), что повышает вероятность взаимодействия возбужденных молекул ФС с другими молекулами. Благодаря этому, одним из основных путей дезактивации метастабильного триплетного состояния фотосенсибилизатора S является его взаимодействие с органическим субстратом или молекулярным кислородом.
Различают фотохимические процессы двух типов. Фотодинамический процесс по типу I проходит через образование свободных радикалов ФС в результате реакции переноса электрона между фотовозбужденным ФС и субстратом, с образованием в итоге активных форм кислорода в виде радикал-ионов и свободных радикалов, наибольшим цитотоксическим действием из которых обладают ОН, 02 . и R02\
Процессы типа I становятся доминирующими при высокой концентрации ФС, особенно в условиях гипоксии [8].
Фотодинамический процесс по типу П происходит через обменно-резонансный перенос энергии возбужденного состояния ФС на молекулярный кислород с образованием активного синглетного кислорода Ог, который и производит цитотоксические повреждения; 3S + 302 - Оз + S0 + субстрат - фотоокисление субстрата
В последнем случае химической трансформации фотосенсибилизатора не происходит, молекула возвращается в свое основное состояние S0 [5,24]. В целом различные пути дезактивации 3S с генерацией активных форм кислорода можно представить следующей схемой (рис. 2): с генерацией активных форм кислорода (взято из [8]) RH - окисляющийся субстрат (фенолы, амины и др.), 3СЬ - молекулярный кислород, Q - восстанавливающийся субстрат (хиноны и др.) ФДТ с использованием большинства известных ФС протекает в основном по типу II [72,73,79,169,172,188,196], хотя существует и целый ряд ФС, работающих по смешанному механизму [8].
Принято считать, что эффективность фотодинамического воздействия зависит в первую очередь от содержания ФС в опухоли, квантовых выходов генерации активных форм кислорода, а также реакций между
фотогенерированными активными формами кислорода и близлежащими клеточными мишенями.
ФДТ оказывает многофакторное повреждающее действие на опухоль, включающее прямые механизмы разрушения опухолевых клеток через некроз и апоптоз, нарушение кровоснабжения опухоли из-за тромбоза и/или разрушения сосудов (вплоть до геморрагии) и последующий ишемический некроз опухолевой ткани, а также вызывает воспалительную и иммунную реакцию [114,126,127,151,229].
На клеточном уровне мишенями активных форм кислорода, поражаемыми при фотодинамическом воздействии, могут являться клеточная мембрана, митохондрии, лизосомы, аппарат Гольджи и другие органеллы клеток [61,229].
Природа фотосенсибилизатора оказывает очень большое влияние на механизм повреждения опухоли при ФДТ. Например, протопорфирин ГХ накапливается в опухолевых клетках в результате нарушения метаболизма 5-аминолевулиновой кислоты и, соответственно, воздействует только на них [105,201]. Фотосенсибилизатор «Тукад» на основе бактериофеофорбида палладия оказывает фотодинамическое воздействие только на сосуды опухоли [45,46,129]. Препарат «Фотосенс», являющийся композицией производных сульфофталоцианина алюминия, оказывает повреждающее воздействие как на клетки опухоли, так и на ее сосудистую систему [127,150].
Важную роль играет амфифильность ФС, а также лекарственная форма, в которой он вводится в организм. Многочисленные исследования показывают, что липофильные ФС, а также препараты, вводимые в липосомальной форме, легче проникают в опухолевые клетки и, соответственно, с большей вероятностью могут вызвать клеточную гибель прямым воздействием на ее органеллы [36]. Механизмы фотодинамического повреждения опухоли при ФДТ в значительной мере зависят и от основных параметров лазерного облучения: используемой плотности мощности и дозы света, а также от выбранного исследователем, или врачом временного интервала между введением ФС и началом облучения, что было продемонстрировано на примере «Фотосенса» [150].
Фотосенсибилизаторы первого поколения - порфирины
Традиционными и наиболее изученными фотодинамическими агентами являются порфирины. Молекула порфирина представляет собой сопряженное макроциклическое кольцо, состоящее из четырех пиррольных остатков, соединенных между собой метановыми мостиками. Молекула имеет плоское строение, что связано с сильным я-электронным взаимодействием по макрокольцу. Наличие четырех симметрично расположенных атомов азота приводит к возникновению комплексов металлов с порфиринами.
Спектры поглощения и флуоресценции порфиринов хорошо изучены [217]. Для фотодинамического облучения используется пик поглощения в красной области вблизи 630 нм. Коэффициент экстинкции в этой области у порфиринов сравнительно невелик и не превышает 104 M 1CM"J.
В качестве потенциальных агентов для ФДТ были исследованы гематопорфирин (HP), протопорфирин IX, уропорфирин [60], тетра-(а-гидроксифенил)-порфирин, сульфонат тетраметилпорфина [156] и другие порфирины. Однако наилучшие результаты среди порфиринов были получены для смеси производных дигематопорфирина (HPD), синтезированной по стандартной методике [44], в которой используется щелочной гидролиз ацетатов HP, и для очищенной активной фракции HPD, так называемого дигематопорфиринового эфира (DHE) [81].
Порфириновые фотосенсибилизаторы (HPD, DHE и другие) имеют относительно невысокую системную токсичность. Исключение составляет тетрафеншшорфин, высокотоксичный в отношении клеток мозга [58]. Недостатком этих ФС являются неоптимальный спектр поглощения, неопределенный химический состав, недостаточная опухолетропность и длительное удержание порфиринов в коже, что ограничивает возможность их применения.
К фотосенсибилизаторам второго поколения относятся фотоактивные соединения, имеющие спектр поглощения с максимумом в длинноволновой красной и ближней инфракрасной области. Это позволяет использовать для облучения опухолей свет, более глубоко проникающий в ткани, что в свою очередь способствует значительному увеличению глубины фотодинамического воздействия. Такими ФС, в частности, являются производные тетраазапорфиринов, прежде всего фталоцианинов (Рс) и нафталоцианинов (Nc), а также производные хлоринов, пурпуринов, порфиценов и бзктериохлорофиллов (ВсЫ) [107,157].
Все эти вещества характеризуются полициклической химической структурой. Они имеют определенный химический состав (в отличие от гетерогенной природы порфириновых ФС) и приемлемую для реализации ФДТ фотоустойчивость.
Тетраазапорфирины можно рассматривать как соединения порфиринового ряда, у которых четыре мезо-углеродных мостика в макроцикле замещены на атомы азота. Для тетраазапорфиринов характерно наличие интенсивного поглощения в красной и ближней инфракрасной областях. Наиболее изученными тетраазапорфиринами являются фталоцианины и близкие к ним по структуре нафталоцианины. Экспериментальные исследования свидетельствуют о большой перспективности этих ФС для фотодинамической терапии новообразований [53,199]. Фталоцианины
Характерной особенностью структуры фталоцианина является наличие четырех бензольных колец, сопряженных с макроциклом. Фталоцианины образуют устойчивые комплексы с различными металлами и могут быть получены либо из свободных оснований, либо непосредственно при синтезе макроцикла из четырех молекул пиррола и соли соответствующего металла [35,199]. Большой тетраазаиндольный макроцикл обуславливает высокую степень гидрофобности фталопианинов, поэтому применение in vivo этих ФС требует введения гидрофильных заместителей или использования подходящих систем доставки.
Фталоцианины имеют основной пик поглощения в ультрафиолетовой области в диапазоне 300-400 нм (полоса Соре) и один или два пика в видимой области 600-750 нм. Коэффициент экстинюши в максимуме последнего пика для многих фталоцианинов превышает 105 М см"1 [158]. Спектральный максимум поглощения водорастворимых Рс может несколько изменяться с изменением рН.
Флуоресцентное поведение металлосодержащих фталоцианинов определяется главным образом влиянием центрального атома [199]. Фталоцианины, содержащие ионы Zn2+, Al3+, Ga3+, дают высокие квантовые выходы триплета (более 0,4) со временами жизни более 200 мкс, энергия этих триплетных состояний составляет 110-126 кД ж/моль [28]. Синтезировано большое количество фталоцианинов с различными заместителями. Производные фталоцианинов, в основном, с возбуждением в красном диапазоне широко изучаются в экспериментальных и клинических работах.
Катионные лекарственные формы для доставки лекарств к патологическим неоваскуляризациям
G. Thurston et.ai [209] изучали в эксперименте на мышах селективность накопления катионных липосомальных форм. Изучалась модель ангиогенеза неоваскуляризаций, стимулированных ростом опухоли поджелудочной железы. Мышам вводили катионные липосомы с включенным в лшшдный состав 1,2-диолеил-3-тршйетиламмоний-пропаном (DOTAP) или диметшгоктадецил-аммонийбромидом (DDAB), меченые флуоресцентной либо золотой меткой. В качестве контроля также вводились нейтральные, анионные и стерически-стабилизированные липосомы. Эксперименты показали, что неоваскуляризации связывают катионные липосомы активнее, чем соответствующие нормальные сосуды. Через 20 минут после внутривенного введения большая часть липосом была связана на люмннальной поверхности клеток эндотелия неоваскуляризации либо в везикулах или мультивезикулярных образованиях внутри клеток. Накопление, измеренное с использованием конфокальной микроскопии, в неовасуляризациях было в 15-33 раза больше, чем в нормальных тканях. Эндотелиальные клетки не связывали анионные, нейтральные или стерически стабилизированные липосомы.
В этой же работе обсуждался вопрос, обусловлено ли взаимодействие катионных липосом с неоваскуляризациями связыванием эндотелиальными клетками либо выходом липосом за пределы сосуда. В экспериментах был получен ряд подтверждений в пользу клеточного связывания. Конфокальная микроскопия флуоресцеин-меченых липосом и окрашенных лектином сосудов показала, что липосомы остаются связанными близко к люминальной поверхности эндотелиальных клеток как в опухолевой, так и в инфекционной модели. Наблюдения с использованием электронного микроскопа также показали, что 85% липосом, ассоциированных с сосудами опухолей мышей, были прикреплены к люминальной поверхности эндотелия либо находились внутри эндотелиальных клетов. Лишь 15% липосом, ассоциированных с сосудами опухоли, пересекли эндотелий за 20 минут наблюдения. Наконец, интенсивный захват липосом был специфичным для катионных липосом, но не наблюдался в случаях анионных, нейтральных или стерически стабилизированных липосом, несмотря на то, что последние способны к экстравазации из опухолевых сосудов.
Солюбилизация сенсибилизатора в липидном бислое дает возможность предложить новые способы регулирования процесса поступления в опухоль препаратов, включенных в липосомы. Использование фотосенсибилизированных везикул, называемых также светочувствительными липосомами, позволяет обеспечить высокоселективное выделение цитостатиков в зоне опухоли, подвергающейся световому облучению, и снизить их токсичность для нормальных тканей [48,88,89,173].
Основным путем создания липосом с контролируемой инициацией и регуляцией высвобождения лекарства является введение в липидные бислои фотохромных молекул [48]. К примеру, сенсибилизатор, внедренный в липосомы, может изомеризовать или индуцировать фоторазрушение компонентов мембраны, в частности, ненасыщенных липидов, приводя к дестабилизации структуры и высвобождению лекарственного материала, что подтверждается методом электронного спинового резонанса (ЭСР) [49] и измерениями деполяризации флюоресценции [160].
C.G. Morgan et al проводили обширные исследования фотоиндуцируемого высвобождения препаратов из липосом, приготовленных на основе дипальмитошіфосфатидилхолина с добавлением сенсибилизаторов на основе фотоизомеризуемых липидов с фенилоазо-группами, в частности, [ 1,2-(4 -п-бутил фенил азо -у-фенибутироил] -глицеро-3-фосфохолина. При облучении импульсным ультрафиолетовым лазером (355 нм, 15 мДж в импульсе) происходила изомеризация фотохромного липида. Это приводило к дестабилизации структуры липидного бислоя и быстрому высвобождению из липосом заключенных в них веществ (доксорубицин, акридиновый оранжевый) [37,39].
Были изучены зависимости высвобождения заключенного в липосомах вещества от длины материнской липидной цепи, концентрации сенсибилизатора, температуры, а также пределы стабильности липосом. Найдено, что при низких концентрациях сенсибилизатора импульсное лазерное излучение приводит к некоторому высвобождению растворенного вещества, тогда как непрерывное облучение ультрафиолетовым лазером оказывается неэффективным [37]. Также было обнаружено, что инициирование высвобождения инкапсулированного вещества сильно зависит от содержания в бислое холестерина. Кроме того, холестерин заметно влияет на температурный профиль зависимости высвобождения растворенного вещества от длины материнских липидных цепей [38].
Получение липосомальных форм препаратов фенилтиопроизводных фталоцианинов
Учитывая гидрофобность фенилтиопроизводных фталоцианинов, для создания ФС на их основе были разработаны липосомальные композиции на основе лецитина (Lee), холестерина (Choi) и кардиолипина (CL). Исходя из технологичности процесса получения липосом, соотношение лецитина и холестерина было выбрано в пределах (10-13):4, что несколько выше предлагаемого в ряде работ (см. например [95,104]) соотношения 2:1.
Кардиолипин был включен в липидную композицию, поскольку его введение в липосомы повышает сродство липосомальной мембраны к биологическим мембранам и увеличивает накопление ФС в жизненно важных органеллах клетки, особенно в митохондриях [ 176-179,181,182].
Кроме того, наши предварительные эксперименты показывают, что содержание кардиолипина в липидном составе влияет на включение в липидный бислой фенилтиопроизводных фталоцианинов в мономерной (фотодинамически активной) . форме. Относительное количество ФС, включенного в мономерной форме, оценивалось по интенсивности полосы флуоресценции с длиной волны спектрального максимума 729 нм. (рис. 6). При предварительном исследовании липосомальных композиций с разным содержанием кардиолипина на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton-Dickinson Scientific, США), была получена зависимость суммарной интенсивности флуоресценции липосом от параметра фронтального рассеяния FSC, пропорционального линейному размеру липосом. Обнаружено, что основной вклад в суммарную флуоресценцию липосом с высоким содержанием кардиолипина оказывается фракциями липосом большого размера (в поддиапазоне значений FSC от 50 до 300), в то время как для липосом с содержанием кардиолипина 0,7-1,4% преобладающим является вклад фракции малого размера (в поддиапазоне FSC от 0 до 50) (рис.7). Этот результат важен для оптимизации состава лекарственной формы, так как именно липосомы небольших размеров (100-200 нм) играют основную роль в биораспределении и селективности накопления липосомальных препаратов в опухоли [98].
Липосомы приготовляли по методу Бенгема [27,83,133] смыванием водной фазой однородной пленки, полученной упариванием хлороформного раствора смеси липидов и ФС, с применением ультразвуковой соникации для уменьшения размеров везикул [133]. Распределение липосом по размеру контролировали прибором "Submicron Particle Sizer NICOMP-380" (Particle Sizing Systems, США).
Получение липосомальной дисперсии тетра-З-фенилтиофталоцианина гидроксиалюмшгая
Навески лецитина (0,30 г) и холестерина (0,06 г) объединяли и растворяли в 5 мл хлороформа. К раствору добавляли 3,6 мл 0,5% раствора кардиолипина в этаноле. Полученный раствор переносили в круглодонную колбу и к нему прибавляли раствор 2,5 мг тетра-З-фенилтиофталоцианина гидроксиалюминия в 5 мл хлороформа. Содержимое колбы перемешивали и упаривали на роторном испарителе при 30 С до образования однородной прозрачной липидной пленки. Затем в колбу добавляли 5 мл воды для инъекций и взбалтывали до полного смывания пленки со стенок колбы. Полученную дисперсию выдерживали в ультразвуковой ванне в течение 30 минут. Получаемая таким образом липосомальная дисперсия имела молярное соотношение лецитина, холестерина и кардиолипина 10:4:0,2 и соотношение "суммарный липид: фталоцианин" 236 :1, при содержании тетра-З-фенилтиофталоцианина гидроксиалюминия 0,5 мг/мл. По результатам измерений на приборе NICOMP-380 полученная дисперсия в основном состояла из двух фракций: с диаметром липосом около 85 нм (примерно 40% от общего количества) и 260 нм (примерно 60%).
Получение липосомальной дисперсии безметального тетра-3-фенилтио-тетра-5-т т-бутилфталоцианина
Навески лецитина (0,28 г) и холестерина (0,05 г) объединяли и растворяли в 5 мл хлороформа. К раствору добавляли 3,6 мл 0,5% спиртового раствора кардиолипина. Полученный раствор переносили в круглодонную колбу и к нему добавляли раствор 2,5 мг безметального тетра-3-фенилтио тетра-5-/и/7е«-бутил-фталоцианина в 5 мл хлороформа. Содержимое колбы перемешивали и упаривали на роторном испарителе при 30 С до образования однородной липидной пленки. В колбу добавляли 5 мл воды для инъекций и взбалтывали до полного смывания пленки со стенок колбы. Полученную дисперсию выдерживали в ультразвуковой ванне в течение 30 минут. Получаемая таким образом липосомальная дисперсия имела молярное соотношение лецитина, холестерина и кардиолипина 13:4:0,2 и соотношение "общий липид : фгалоцианин" 208 : 1, при содержании безметального тетра-3-фенилтио-тетра-5-т/7Є№ї-бутилфталоцианина 0,5 мг/мл. Согласно результатам измерений на приборе NICOMP-380 полученная дисперсия в основном состояла из двух фракций: с диаметром липосом около 47 им (примерно 43% от общего количества) и 156 нм (примерно 57%).
Получение липосомальной дисперсии тетра-3-феиилтиофталоцианина цинка.
Навески лецитина (0,50 г) и холестерина (0,09 г) объединяли и растворяли в 5 мл хлороформа. К раствору добавляли 3,6 мл 0,5% раствора кардиолипина з этаноле. Затем раствор переносили в круглодонную колбу и к нему добавляли раствор 2,5 мг тетра-3-фенилтиофталоцианина цинка в 5 мл хлороформа. Содержимое колбы перемешивали и упаривали на роторном испарителе при 30 С до образования однородной липидной пленки. В колбу добавляли 5 мл воды для инъекций и взбалтывали до полного смывания пленки со стенок колбы. Полученную дисперсию выдерживали в ультразвуковой ванне в течение 30 минут. Полученная липосомальная дисперсия имела молярное соотношение лецитина, холестерина и кардиолипина 12:4:0,2 и соотношение "общий липид: фталоцианин" 313:1, при содержании безметального тетра-3-фенилтиофталоциашша цинка 0,5 мг/мл. Согласно результатам измерений на NICOMP-380 полученная дисперсия в основном состояла из двух фракций: с диаметром липосом около 84 нм (основная, примерно 94% от общего количества) и 320 нм (примерно 6%).
