Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Физиологические основы увлажнения глазной поверхности 12
1.1.1. Железы, участвующие в продукции слезной жидкости 12
1.1.2. Слезная жидкость и ее функции 13
1.2. Этипатогенетическая основа синдрома «сухого глаза» 15
1.2.1. Этиология ксеротического процесса 16
1.2.2. Виды синдрома «сухого глаза» 17
1.2.3. Клиническая картина синдрома «сухого глаза» 19
1.3. Клиническая картина конъюнктивитов 22
1.3.1. Острые конъюнктивиты 23
1.3.2. Хронические конъюнктивиты 26
1.3.2.1. Характеристика микоплазменной инфекции 28
1.3.2.2. Характеристика бактероидной инфекции 32
1.3.2.3. Характеристика хламидийной инфекции 38
1.3.3. Патогенез хламидийного поражения органа зрения 43
1.3.3.1. Клинические формы хламидийного поражения органа зрения 46
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Общая характеристика обследованных больных 52
2.2. Методы исследования хламидийной, микоплазменной, уреаплазменной и бактероидной инфекции 57
2.2.1. Метод прямой иммунофлюоресценции 57
2.2.2. Метод полимеразной цепной реакции 59
2.2.3. Культуральный метод 60
2.2.4. Бактериологическое исследование 62
2.2.5. Морфофункциональное исследование конъюнктивы 65
2.2.6. Гистологическое исследование конъюнктивы 67
2.2.7. Оценка стабильности слезной пленки (проба Норна) 70
2.2.8. Оценка суммарной слезопродукции (проба Ширмера) 70
2.3. Статистический анализ результатов 71
Глава 3. Результаты собственных исследований
3.1. Структура обследованных больных 72
3.2. Структура инфекционных агентов, выявленных в конъюнктиве 74
3.3. Хламидийная инфекция, выявленная в мочеполовом тракте 77
3.4. Частота выявления синдрома «сухого глаза» у больных с хроническим конъюнктивитом 79
3.5. Результаты изучения морфофункционального состояния слизистой конъюнктивы у пациентов с синдромом «сухого глаза», ассоциированного с хламидийной инфекцией 84
3.6. Результаты гистологического исследования конъюнктивы у больных с наличием хламидийной инфекции в конъюнктиве 87
3.7. Результаты выявления хламидемии у больных с распространенной формой хламидийной инфекции, протекающей с поражением органа зрения 93
Глава 4. Обсуждение результатов исследования.
Заключение 101
Выводы 114
Практические рекомендации 115
Список литературы 116
- Слезная жидкость и ее функции
- Характеристика микоплазменной инфекции
- Гистологическое исследование конъюнктивы
- Структура инфекционных агентов, выявленных в конъюнктиве
Введение к работе
Актуальность исследования
В последние годы повышенный интерес офтальмологов вызывает синдром «сухого глаза» (ССГ), который можно определить как комплекс признаков выраженного или скрыто протекающего роговичного или роговично-конъюнктивального ксероза, патогенетически обусловленного длительным нарушением стабильности прероговичной слезной пленки (Бржеский В.В., Сомов Е.Е., 2003).
По этиологии ксеротического процесса ССГ относят к одной из трех клинических групп: синдромальной (на почве какого-либо системного заболевания), симптоматической (из-за анатомических нарушений локального характера или авитаминоза А) и артифициальной (вследствие повреждения слезной пленки факторами внешней среды) (Бржеский В.В., Сомов Е.Е. 2003; Mac Cord Medina F., Silvestre de Castro R., Leite S. et al. 2007; Tseng S.C.G. 2002).
При синдромальных и симптоматических формах ССГ патогенетический механизм представляется достаточно понятным, но при артифициальной форме он не столь очевиден. Особенно неясна роль инфекционного фактора в развитии как хронических конъюнктивитов, так и его последствий в виде изменения слезопродукции и слезной пленки. Как правило, субъективные проявления характерны и примерно одинаковы как для хронических конъюнктивитов, так и для ССГ. С другой стороны, для ССГ всегда характерно наличие признаков преимущественно хронического воспаления конъюнктивы («вялая» гиперемия, легкий отек слизистой, наличие скудного отделяемого и др.), хотя и слабо выраженных (Bobo L., Novak N., Mkoch Н.
1996; Cordero - Coma M., Anzaar F., Sobrin L., Foster С 2007; De Pavia C. S., Villarreal A. L., Corrales R. M. et al. 2007; Hyon J. Y., Lee Y. J. et al. 2007).
Показано, что ССГ возникает у лиц с воспалительными заболеваниями вспомогательного аппарата глаза, в частности, встречается у 73,7% - 79,4% больных с хроническими конъюнктивитами различной этиологии, у 60,7% больных с хроническими дакриоциститами, а также диагностируется при мейбомиевом блефарите (Бржеский В.В., Сомов Е.Е. 2003). Однако отсутствует анализ инфекционного фактора в развитии этих заболеваний, а, следовательно, и в развитии ССГ.
Известно, что при хронических конъюнктивитах зачастую выявляется хламидийная инфекция (Майчук Ю.Ф., 2001), которая сложно диагностируется и с трудом поддается терапии, результаты которой не всегда удовлетворительны (Азнабаев М.Т. и соавт., 2003; Астахов Ю.С. и соавт., 2007; Балашевич Л. И. и соавт., 1998; Квасова М.Д., 2003; Майчук Ю.Ф., 2001). Авторы указывают на необходимость направления таких пациентов к урологу или гинекологу для поиска первичных очагов хламидийной инфекции. В то же время в последние годы появились данные о том, что хламидийная инфекция нередко может проявляться в виде распространенной формы с поражением различных органов и систем организма (Воробьёва М.С., 2001; Гранитов В.М., 2000; Делекторский В.В., 1996; Зайцева Н.С., 1976; Лобзин Ю.В. и соавт., 2003; Ильин И.И., 1993; Ченцова О.Б. 2004; Boiko Е., Poznyak A. et al, 1999; Zhang-W., 2001). Кроме того, известно, что хламидийная инфекция протекает в ассоциации с другими микроорганизмами: микоплазмами, уреаплазмами, бактероидами (Кисина В.И., 2001; Лобзин Ю.В. и соавт., 2003; Мавров И.И., 2000; Мальханов В. Б., 2003; Нуралова И.В.Д997; Хлопунова О.В., 2008; Everett K.D.E., 2000; Sandra P., 2003; Fish L.A., 1988; Jones D.B., 1980; Weinstein O., 2006), но данный
патологический биоценоз недостаточно изучен при хронических конъюнктивитах и ССГ.
Таким образом, всё это дает повод предположить, что в качестве одной из причин, лежащих в основе хронических конъюнктивитов и ССГ, может оказаться хламидийная или другая инфекция, а протекать они могут на фоне распространённого инфекционного заболевания и являться одним из его признаков.
Цель исследования
Изучить этиопатогенетическую роль хламидийной, микоплазменной, уреаплазменной и бактероидной, возможно, имеющих распространённый характер, инфекций в развитии первично протекающего хронического конъюнктивита и синдрома «сухого глаза».
Задачи исследования
Определить частоту выявления хламидийной, микоплазменной, уреаплазменной и бактероидной инфекций при первичных хронических конъюнктивитах, а также их связь с развитием синдрома «сухого глаза».
Установить факторы, способствующие развитию синдрома «сухого глаза» у больных с первично протекающими хроническими конъюнктивитами.
Изучить морфологические изменения конъюнктивы при первично протекающих хронических хламидийных конъюнктивитах, способствующие развитию синдрома «сухого глаза».
Определить взаимосвязь хронического поражения конъюнктивы с первичными очагами инфекции в мочеполовом тракте.
Научная новизна исследования
При комплексном клинико-лабораторном обследовании больных хроническими конъюнктивитами изучена частота и соотношение выявления хламидий, микоплазм, уреаплазм и бактероидов, а также и их ассоциаций. Впервые установлено, что длительное инфицирование хламидиями конъюнктивальной полости приводит к морфофункциональным изменениям слизистой конъюнктивы, приводящим к развитию синдрома «сухого глаза».
Практическая значимость работы
Предложено включить в алгоритм клинико-лабораторного обследования больных хроническим конъюнктивитом, осложненным ССГ, тесты, позволяющие выявлять хламидий, микоплазмы, уреаплазмы и бактероиды. С учетом предложенных тестов разработана схема лабораторного обследования больных хроническим конъюнктивитом, осложненным ССГ. Обоснована методика клинико-лабораторного обследования больных хроническим конъюнктивитом, осложненным ССГ, включающая, помимо тестов Ширмера и Норна, методы иммуногистохимического выявления хламидий, микоплазм и бактероидов, позволяющие уточнить этиологическую природу заболевания и, как следствие этого, повысить эффективность терапевтических мероприятий.
Личное участие автора в получении результатов
Автором лично выполнено исследование бактериологического статуса конъюнктивы пациентов с хроническими конъюнктивитами, материалов урологического тракта и крови у пациентов с распространенной формой хламидийной инфекции. Диссертант принимал непосредственное участие в клиническом обследовании больных. Автором лично сформирована база
данных и проведена статистическая обработка полученных результатов с их обобщением.
Основные положения, выносимые на защиту
Развитие синдрома «сухого глаза» у пациентов с первичными хроническими конъюнктивитами, в основном, связано с длительным течением именно хламидийной инфекции.
В конъюнктиве, длительно инфицированной хламидиями, развивается дистрофический процесс с характерными морфофункциональными и гистологическими изменениями.
Хроническое хламидийное поражение конъюнктивы может рассматриваться не как изолированный, а как один из множественных очагов у больных с распространенной формой хламидийной инфекции.
Реализация и внедрение полученных результатов работы
Полученные результаты и практические рекомендации внедрены и используются в научной и лечебной работе кафедры офтальмологии и инфекционных болезней ФГОУ ВПО «ВМедА им. СМ. Кирова» МО РФ.
Апробация и публикация материалов исследования
Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на конференции «Человек и лекарство» (Москва, 2008 г.), юбилейной научно-практической конференции с международным участием «Поражения органа зрения» (Санкт-Петербург, 2008 г.).
По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 статьи в журнале, рекомендованном ВАК Минобразования и науки Российской Федерации.
Объём и структура работы
Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Текст диссертации изложен на 134 страницах, содержит 13 таблиц, 12 рисунков. Библиографический указатель включает 170 источников, из которых 94 работы отечественных и 76 работ зарубежных авторов.
Слезная жидкость и ее функции
В конъюнктивальной полости здорового человека постоянно содержится около 7 мкл слезной жидкости. Суточное количество слезной жидкости, необходимое для нормального увлажнения глазной поверхности, составляет около 1,5-2 мл. Данное количество слезы обеспечивается за счет основной (секреция слезной жидкости в обычных условиях) и рефлекторной (возникающей в ответ на раздражающий фактор) слезопродукции (Messemer Е., Behrens-Baumann W., Brewitt Н. 2001).
Ранее считалось, что основная продукция слезной жидкости обеспечивается добавочными слезными железами, а рефлекторная только за счет функции слезной железы, однако, в настоящее время имеются данные, что эта система является единой (Кански Д.Д., 2006). При сомкнутых веках слезная жидкость полностью заполняет капиллярную щель между стенками конъюнктивального мешка, а при раскрытии распределяется в виде тонкой прероговичнои пленки по переднему сегменту глазного яблока.
Состояние эпителия глазной поверхности зависит от равномерности распределения слезной жидкости по поверхности роговицы и конъюнктивы, что обусловлено состоянием прероговичнои слезной пленки.
Прероговичная часть слезной пленки на всем протяжении прилегания к ней краев век образует слезные мениски общим объемом до 5,0 мкл.
Толщина слезной пленки колеблется в зависимости от ширины глазной щели от 6 до 12 мкм и составляет в среднем 10 мкм. В структурном отношении слезная жидкость неоднородна и содержит три слоя: муциновый (покрывает роговичный и конъюнктивальный эпителий), водянистый и липидный.
Муциновый слой слезной пленки составляет от 0, 02 до 0, 05 мкм. Он обеспечивает доставку питательных веществ от водянистого слоя прероговичнои слезной пленки (ПСП) к роговичному эпителию и удаление метаболитов, также способствует регенерации эпителия роговицы и гидратации эпителиальных клеток. Кроме того, он выполняет светопреломляющую функцию путем сглаживания неровностей роговичного эпителия.
Водянистый слой слезной пленки выполняет главную функцию увлажнения, имеет толщину около 7 мкм и состоит из растворимых в воде электролитов. Данный слой обеспечивает механическое удаление инородных тел с поверхности роговичного эпителия, оказывает антибактериальное и противовирусное действие, восстанавливает рН слезной жидкости при попадании в конъюнктивальную полость слабых кислот или оснований. Он также осуществляет транспорт кислорода и питательных веществ и совместно с муциновым слоем обеспечивает гидратацию эпителиальных клеток конъюнктивы и роговицы (Сомов Е.Е., Бржеский В.В., 2001).
Липидный слой слезной пленки препятствует (за счет своей гидрофобности) проникновению в роговичный эпителий различных аэрозолей, термоизолирует эпителий роговицы и конъюнктивы и выравнивает наружную поверхность слезной пленки (Lemp М.А. 1994).
Следовательно, прероговичная слезная пленка выполняет ряд важных физиологических функций, которые реализуются лишь при условии сохраненной взаимосвязи между всеми слоями (Сомов Е.Е., Бржеский В.В. 2002).
Также важным звеном, обеспечивающим нормальное функциональное состояние прероговичной слезной пленки, служит система слезоотведения. Она препятствует избыточному накоплению слезной жидкости в конъюнктивальной полости, обеспечивая нормальную толщину и стабильность слезной пленки (Murube J., Murube Е. 1996).
Нарушение количества и состава слезы, а также недостаточность смыкания век негативно влияет на состояние прероговичной слезной пленки, что в свою очередь приводит к нарушению увлажнения глазной поверхности (явлению ксероза) с развитием синдрома «сухого глаза» (ССГ). Существует ряд причин, приводящих к нарушению механизма функционирования прероговичной слезной пленки: собственно нарушение слезопродукции, нарушение распределения слезной жидкости на поверхности глазного яблока, структуры каждого из слоев прероговичной слезной плешей.
Исходя из многообразия причин, приводящих к нарушению формирования прероговичной слезной пленки, синдром «сухого глаза» (ССГ) можно определить как комплекс признаков выраженного или скрыто протекающего роговичного или роговично-конъюнктивального ксероза, патогенетически обусловленного длительным нарушением стабильности прероговичной слезной пленки (Бржеский В. В., Сомов Е. Е., 2002).
В патогенезе ССГ выделяют несколько причин, таких как сокращение объема основной слезопродукции, дестабилизация слезной пленки вследствие повреждающих экзогенных факторов, и комбинированный вариант, включающий в себя вышеперечисленные факторы.
По этиологии ксеротический процесс разделяют на синдромальный, обусловленный снижением секреторной функции слезных желез на почве системного заболевания (синдром Съегрена, Стивене - Джонсона, Райли-Дэя), симптоматический ССГ развивается вследствие причин локального характера (нейропаралитический кератит, деформация конъюнктивальной полости, кераторефракционные операции, конъюнктивиты) и выраженного авитаминоза А. Артифициальный ССГ обусловлен повреждением прероговичной слезной пленки различными факторами внешней среды (кондиционированный воздух, «мониторный синдром», ношение мягких контактных линз) (Бржеский В.В., Сомов Е.Е. 2003; Mac Cord Medina F., Silvestre de Castro R., Leite S. et al. 2007).
Характеристика микоплазменной инфекции
Наиболее значимыми для патологии органов мочеполовой системы человека являются два представителя генитальных микоплазм: М. hominis, U. urealyticum (Uuskula А ., Kohl Р. К., 2002; Taylor-Robinson D., Furr P. M., 1997). При этом единственным отличием микоплазмы (М. hominis) от уреаплазмы (U. urealyticum) является наличие системы уреаз, ферментов расщепляющих мочевину (Shepard М. С, 1966).
Микоплазмы играют важную роль в патогенезе острых и хронических заболеваний человека и связаны с различными осложнениями, которые могут развиваться спустя длительное время после инфекционно-воспалительного процесса и включать, в частности, ревматоидные поражения кожи, центральной и периферической нервной системы, органов дыхательной и сердечной системы, включая астму и перикардит, панкреатит (Baseman J. В., Tully J. G. 1997; Baseman J. В., Reddy P. S., Dallo S. F. 1996).
В соответствии со структурной организацией микоплазм они занимают промежуточное положение между бактериями и вирусами: от бактерий их отличает наличие трехслойной плазматической мембраны, заменяющей клеточную стенку; от вирусов - способность расти на бесклеточных питательных средах, метаболизировать ряд субстратов, наличие одновременно ДНК и РНК, чувствительность к ряду антибаїсгериальньїх препаратов (Clyde.W. A., Taylor-Robinson D. 1978).
Микоплазмы характеризуются такими биологическими свойствами как: полиморфизм, пластичность, осмотическая чувствительность и многообразие форм клеток, наличие в перипласте (цитоплазме) лишь нуклеоида и рибосом, выраженный плеоморфизм, мельчайшие размеры репродуцирующихся частиц (120-150 нм), способность проникать через поры диаметром 0,22 мкм, многообразие способов репродукции (бинарное деление, почкование, фрагментация нитей, цепочечных форм и шаровидных образований). Форма и размеры микоплазм различаются в зависимости от возраста культуры и . условий культивирования (Taylor-Robinson D., Csonka G. W., Prentice M. J., 1977).
Клетки M. hominis имеют округлую или овальную форму величиной от 100-120 до 600-1200 нм, ограничены трехслойной асимметричной мембраной размером до 10 нм. Центральная зона М. hominis представляет собой сеть тонких осмеофильных нитей ("ядерная область") и мембранных структур, представленных трехслойными мембранами с многочисленными нитями нуклеоида (Moller В. R., Black F. Т., Freundt Е. А. 1981; Moller В. R., Freundt Е.А. 1983). Ряд свойств микоплазм: морфология, химический состав, антибиотикочувствительность, вирулентность и патогенность - могут изменяться в зависимости от различных факторов (Marantidi A. N., Dzhikidze Е. К., 1998).
Антигенная структура генитальных микоплазм имеет видовые различия, а основные антигены представлены фосфо- и гликолипидами, полисахаридами и белками. Наибольшей иммуногенностыо обладают поверхностные антигены, включающие углеводы в составе сложных гликолипидных, липогликановых и гликопротеиновых комплексов. Характерен выраженный антигенный полиморфизм с частыми мутациями, при этом антигенная структура может изменяться после многократных пассажей на бесклеточных питательных средах (Talkington D. F., Wailes К. В., Schwartz S. В., Besser R.E., 2001). Микоплазмы обладают способностью к адгезии и паразитированию на мембране клеток. К основным факторам патогенности микоплазм относятся адгезины, токсины, ферменты агрессии и продукты метаболизма. Адгезины входят в состав поверхностных антигенов и способствуют адгезии микоплазм на клетках хозяина, что имеет ведущее значение в инициировании инфекционного процесса. Эндотоксины обнаружены у многих генитальных микоплазм, а их введение лабораторным животным сопровождается пирогенным эффектом, лейкопенией, геморрагическими высыпаниями, коллапсом. Структура и некоторые свойства эндотоксинов отличаются от липополисахаридов грам отрицательных бактерий (Мавров И. И., 2002). К ферментам агрессии микоплазм относятся фосфолипаза А и аминопептидазы, гидролизирующие фосфолипиды мембраны клеток. Ряд микоплазм синтезирует нейроаминидазу, взаимодействие которой с поверхностными структурами клетки нарушает архитектонику клеточных мембран. Среди других ферментов имеют значение протеазы, вызывающие дегрануляцию клеток, в частности тучных, расщепление молекул антител и незаменимых аминокислот, а также РНКазы, ДНКазы и тимидинкиназы, обладающие способностью нарушать метаболизм нуклеиновых кислот в клетках макроорганизма. До 20% общей ДНКазной активности сосредоточено в мембранах микоплазм, что обеспечивает способность фермента нарушать метаболизм клетки (Called L. F., Taccani С, Porcelli А., 2000). По данным литературы, генитальные микоплазмы выявляются у 50-70% мужчин с негонококковым уретритом (НГУ), у 15-80% сексуально активных здоровых женщин (существенно возрастая с увеличением числа их половых партнеров) и у 8-9% в уретре праісгически здоровых мужчин. У здоровых лиц из глотки U. urealyticum выделяются в 5-10%, М. hominis - в 1,5-3% наблюдений (Мавров И. И. 2002).
Широкое распространение генитальных микоплазм среди клинически здоровых женщин разного возраста позволило большинству исследователей рассматривать их комменсалами в составе нормального вагинального микроценоза, способными при определенных условиях к реализации патогенных свойств (Борисенко К. К., Тоскин И. А., Кисина В. И. 1999; Хадсон М. Т., Талбот М. Д. 1998). Подтверждением этого мнения являются работы, свидетельствующие о том, что патогенность М. hominis, U. urealyticum и анаэробных бактерий связана с массивностью диссеминации микробных агентов в очаге инфекции (Naessens А. 1993; Robertson В. D., Meyer Т. F. 1992).
У мужчин микоплазмы являются причиной уретрита и его осложнений: простатита, везикулита, эпидидимита, баланопостита; у женщин - уретрита, вагинита, цервицита, фоновых заболеваний шейки матки, эндометрита, сальпингоофорита, преждевременных родов, самопроизвольных выкидышей, мертворождений. Осложнениями воспалительных процессов, обусловленных генитальными микоплазмами в органах урогенитальной системы, является бесплодие у мужчин и женщин (Fodor V., 1980; Clerc М., Texiet J., Bebear С, 1984; Келер В., Гамова Н. А., Вульфович Ю. В., 1985; Taylor - Robinson D., Barile M. F., Furr P. M., Graham С E., 1987; Кира E. Ф., 1996; Уисе A., Yucesoy M., Yucesoy K., 1996).
Гистологическое исследование конъюнктивы
Забор материала для исследования забирали от оперирующихся пациентов с подтвержденным наличием хламидийной инфекции в конъюнктиве методами ПИФ и ГЩР и диагностированным ССГ.
Биопсийный материал фиксировали в жидкости Карнуа, состоящей из 60 мл абсолютного спирта, 30 мл хлороформа и 10 мл ледяной уксусной кислоты. В данной жидкости материал находился в течение 4 часов.
Кусочки фиксированного материала подсушивали на фильтровальной бумаге и помещали сначала в 96 спирт на 24 часа, затем переносили в абсолютный спирт ещё на 24 часа. В последнем спирте объекты находились не более 4-х дней. Все образцы ткани для облегчения проводки были помещены в небольшие марлевые мешочки.
Фиксированные кусочки после обезвоживания в спиртах (96 и абсолютном) переносили вначале в смесь спирта пополам с хлороформом на 6 часов и затем в чистый хлороформ на то же время. Объекты, обработанные хлороформом, в дальнейшем легко пропитываются парафином. Для постепенного и лучшего пропитывания парафином кусочки из хлороформа переносили в расплавленную смесь хлороформа с парафином и оставляли в ней при температуре 35С (в термостате) на 2-3 часа. Смесь хлороформа с парафином готовили из равных объёмных частей одного и другого, для чего парафин предварительно расплавляли. Из смеси хлороформа с парафином кусочки перекладывали в расплавленный парафин (55С). Пропитывание в парафине вели в двух порциях (чашечках). Кусочки вначале помещали в первую чашечку на 2 часа, затем перекладывали теплым пинцетом во вторую на 1,5 часа. В общей сложности, в обеих порциях парафина кусочки ткани выдерживали 3,5 - 4 часа. Работа в двух порциях парафина вызвана необходимостью как можно полнее освободить объект от хлороформа, примесь которого изменяет пластичность парафина, делая его крошковатым. Следующим этапом кусочки перекладывали в заранее приготовленные формочки и заливали горячим парафином (специально подогретым в термостате). Формочку с расплавленным парафином и кусочками ткани подвергали охлаждению в большой чашке с холодной водой. После затвердевания парафина извлекали его из форм и подрезали по краям. Далее вырезали скальпелем блоки соответственно кусочкам гистологического материала. Парафиновый блок (на колодке) укрепляли в объектодержателе микротома (микротом большой санный типа Rrichert) и выполняли серийные срезы (по 6 срезов с каждого образца, 2 из которых окрашивали гематоксилин - эозином, на 2-х применяли сыворотку (хламидийную), 2 оставляли нетронутыми). Толщина парафиновых срезов составляла 3 мкм. Полученные срезы при помощи мягкой кисточки и препаровальной иглы снимали с бритвы и переносили в чашку с дистиллированной водой (не горячей). Далее помещали полученный срез на предметное стекло и проглаживали двумя-тремя слоями сухой, гладкой фильтровальной бумаги. Полученные образцы просушивали в термостате при температуре 40С в течение 2-х часов. Готовые срезы для лучшей фиксации оставляли при комнатной температуре на 1 сутки. Непосредственно перед окраской выполняли просветление срезов путем поочередного помещения предметных стекол в ксилол (3 ёмкости) и в 96спирт (3 ёмкости). В каждой емкости препарат находился 5 минут, таким образом, проводка одного стекла занимала 30 минут. Окраску выполняли гематоксилин - эозином. На предметное стекло с нанесёнными на него срезами наливали несколько капель профильтрованного квасцового гематоксилина, окрашивали 3 минуты. Далее сливали краску обратно в рабочую склянку, а препарат со стекла спускали в большую чашку с водой. Препараты промывали в воде 5 минут до посинения среза. Посиневший срез извлекали из воды, помещали на предметное стекло и наливали на него несколько капель раствора эозина; окрашивали 3 минуты, промывали срезы водопроводной водой в течение 1 минуты. Далее помещали срез на предметное стекло, удаляли воду, наливали 96 спирт, выдерживали 5 минут. Сливали спирт, удалив его остатки. Быстро, в течение 1 минуты, промывали ксилолом. Удаляли остатки ксилола вокруг среза, наносили каплю бальзама и накрывали покровным стеклом. На другую серию просветлённых неокрашенных срезов наносили сыворотки фирмы «Петромед-Диагностика» (г. Санкт-Петербург). Для выявления хламидийной инфекции использовали наборы ХлаМоноСкрин, ХламиСкан. Препарат наносили на предметное стекло и помещали в термостат на 15 минут при температуре 37С. Далее промывали стекло в фосфатном буфере и воде в течение 5 минут. Визуализацию проводили на люминесцентном микроскопе типа ЛЮМАМ при увеличении 600-1000, длине волны 490 нм и системе фильтров ФС 1-2, БС 8-2, СЗС 8-2. Фоторегистрацию осуществляли с помощью цифровой камеры Olympus FE-310. Оценка стабильности слезной пленки (проба Норна) Обследуемого просят смотреть вниз и, оттянув верхнее веко его исследуемого глаза, окрашивают область лимба в меридиане 12 часов одной каплей 0,2% раствора флюоресцеина - натрия. После включения щелевой лампы пациента просят спокойно моргнуть и широко раскрыть глаза и начинают отсчет времени. Щелевая лампа должна быть оснащена кобальтовым фильтром, отклонение пучка света составляет 30. Через окуляр щелевой лампы внимательно наблюдают за окрашенной поверхностью слезной пленки, медленно передвигая осветитель из стороны в сторону, сканируют роговицу. Таким образом, определяют место, где в слезной пленке возникает разрыв. Обычно он имеет вид черной дыры или сухого пятна. Упомянутый разрыв может возникнуть в любом месте, но чаще он образуется в нижнее - наружном квадранте роговицы, около слезного мениска, где слезная пленка наиболее тонкая. В норме время до разрыва слезной пленки должно составлять более 10 секунд.
Структура инфекционных агентов, выявленных в конъюнктиве
Так, с помощью ПИФ в мазках периферической крови хламидий диагностировали у 67,7 % обследованных лиц, в лейкоконцентратах крови -у 88,2 % , а в различных популяциях лейкоцитов - у 80,6 % пациентов. С помощью ПЦР удалось выявить фрагменты РНК хламидий в крови у 72,1 % пациентов, а с помощью культурального метода возбудитель высевался лишь у 22,6 % обследованных больных. В то же время в лейкоконцентрате хламидии с помощью ГЩР диагностировались в 84,9% случаев, с помощью культурального метода - в 30,1% случаев. Так же, как и в группе с моноинфекцией, у данной категории лиц хламидии в крови внутриклеточно преимущественно выявляли в макрофагах (52,7 %) и в меньшей степени - в нейтрофилах (19,4 %) и на лимфоцитах (8,6 %). Низкий процент высеваемости хламидии на культуре клеток (30,1 %) по сравнению с результатами обследования у больных с аналогичной формой инфекции, но протекающей по варианту моноинфекции (47,1 %), вероятно, можно объяснить антагонистическим влиянием микроорганизмов - ассоциантов (микроплазмы, уреаплазмы, бектероиды) на хламидии, в результате чего они снижали способность расти in vitro на культуре клеток. Возможно, это также было связано с их преимущественно внутриклеточной локализацией в макрофагах, что могло также в значительной степени снизить их жизнеспособность в результате внутриклеточной деструкции антимикробными факторами данных клеток.
Таким образом, в зависимости от выраженности и распространенности инфекционного процесса (локализованный и распространенный), а также характера течения ХИ (моно - инфекция, микст - инфекция) у больных с данной патологией часто диагностируется хламидемия. На ранних этапах развития хламидийной инфекции, когда наблюдается размножение и накопление возбудителя в первичных очагах воспаления (клеточно-тканевой уровень), в результате реализации местных и общих механизмов клеточного и гуморального иммунитета распространение хламидии в организме пациента значительным образом сдерживается. Рядом авторов установлено, что на ранних этапах мочеполовой хламидийной инфекции развивается поликлональная активация лимфоцитов (Агабабова Э.Р., 1989; Акулович А. И., Будревич А.Е.; Атаманов А.А., 2000). В гистологических исследованиях показана значительная инфильтрация лимфоидными клетками и образование лимфоидных фолликулов при трахоме, паратрахоме, уретрите и других формах течения хламидиозов (Анри-Сюше Ж., 1990; Афонин А. В., 1991). Происходящая поликлональная активация лимфоидных клеток может приводить к образованию широкого спектра антител, что в значительной степени удерживает распространение инфекции. Однако неспецифическая поликлональная активация, вызванная хламидиями, может приводить и к иммуносупрессии. При различных формах хламидийной инфекции иммунный ответ макроорганизма неодинаков. При локализованных формах мочеполовой инфекции с ограниченным распространением воспалительного процесса практически невозможна интенсивная антигенная стимуляция хламидиями иммунной системы из-за того, что они сами обладают слабой иммуногенной активностью и находятся преимущественно внутриклеточно. Активная выработка в этом периоде специфических к возбудителю хламидиоза антител классов М и А в значительной степени способствует развитию только локализованного варианта течения инфекции. На поздних стадиях развития инфекции в условиях сниженного местного и общего иммунитета хламидийная инфекция уже не ограничивается первичными очагами. Основными путями и механизмами захвата новых территорий и распространенности процесса являются: последовательное поражение эпителиального слоя слизистой оболочки мочеполового тракта благодаря трансканаликулярному восходящему распространению инфекции; местная диссеминация хламидий сперматозоидами благодаря их подвижности; «транспортировка хламидий», резервированных внутриклеточно трихомонадами; местная и общая диссеминация возбудителя лимфогенным и гематогенным путями. Валсное значение в распространенности хламидийной инфекции принадлежит нейтрофилам и макрофагам. Так, доказано, что у больных болезнью Рейтера макрофаги и нейтрофилы являются наиболее вероятными переносчиками микроорганизмов в сустав, так как они способны захватывать хламидий в местах первичных очагов (мочеполовой тракт), поступать в кровоток и быть «рекрутированы» синовиальной оболочкой. В качестве подтверждения этой концепции явился факт обнаружения хламидий в лейкоцитах периферической крови у пациентов с реактивным артритом (Адаскевич В.П., 1997; Атаманов А.А., 2000).
Полученные данные подтверждают важную патогенетическую способность хламидий к диссеминации преимущественно за счет внутриклеточного «резервирования» и распространения в организме в нейтрофилах и макрофагах периферической крови. Хламидемия может, таким образом, служить важным лабораторным критерием (тестом) диагностики распространенных форм хламидиозов, протекающих, в том числе с преимущественным поражением органа зрения.
