Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 3
РЕКОМБИНАЦИЯ БРИ ИНТЕГРАЦИИ И ЭКСЦИЗИИ БАКТЕРИОФАГА ЛЯМБДА (литературный обзор) . 5
Участки прикрепления ( att -сайты) 10
Белки рекомбинации и их взаимодействие с нуклеотид-ными последовательностями att -участков 22
Механизм включения бактериофага л в хромосому E.coii (интегративная рекомбинация) 26
Исключение фага л из хромосомы Е.СОІІ (эксцизионная рекомбинация) 31
СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ОБРАЗОВАНИЯ ТРАНСДУЩРУіОЩЕГО
БАКТЕРИОФАГА Ар1ас5 (обсуждение полученных результатов) . 41
Участок аномальной эксцизии профага 42
Участок образования протяженной делении 67
Структура бактериофага хріас5 74
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 87
Список сокращений 87
Материалы 88
Бактериальные штаммы и культуры фагов 90
Выращивание бактерий 91
Выделение плазмидных ДНК 92
Выделение фагов и фаговых ДНК 96
Выделение ферментов 100
Конструирование рекомбинантных ДНК 112
Электрофорез и секвенирование ДНК 116
ВЫВОДЫ 122
ЛИТЕРАТУРА 123
Введение к работе
Генетическая рекомбинация относится к числу молекулярных процессов, имеющих фундаментальное значение для живых организмов. Наряду с классическим явлением обмена между гомологичными хромосомами (общей рекомбинацией) (1-3) известно множество примеров обмена гетерологичными участкаїли, приводящего к разнообразным геномным перестройкам и получившего название незаконной рекомбинации (4,5). Для многих рекомбинаций этого типа была обнаружена явная склонность к определенным участкам генома, что позволило классифицировать их как сайт-специфические рекомбинации (6,7). Интенсивное развитие генетической инженерии и методов установления первичной структуры ДНК позволило перевести эти исследования на молекулярный уровень. Структурные исследования показали, что такие процессы, подобно общей рекомбинации, протекают с участием гомологичных последовательностей, однако в данном случае эти последовательности намного короче. Что касается собственно незаконных рекомбинаций, то к их числу, как явствует из недавно полученных структурных данных (8,9), следует, по-видимому, относить те рекомбинации, которые происходят практически без участия гомологичных последовательностей.
Сайт-специфические рекомбинации протекают по репликативному или консервативному механизму. Первый из них лежит в основе подвижности IS-элементов, транспозонов, некоторых бактериофагов (10, II). В то же время встраивание и исключение умеренных бактериофагов представляет собой характерное проявление консервативной сайт-специфической рекомбинации, в которой центральную роль играют стадии разрыва и последующего воссоединения цепей ДНК, наиболее хорошо изученные на примере взаимодействия ДНК фага Л с хромосомой
E.coli (см.литературный обзор). На уровне нуклеотидных последовательностей было показано, что процессы встраивания и исключения этого фага структурно обратимы, так что в каждом случае обмен цепями ДЖ происходит реципрокно (12).
Большой интерес представляют значительно более редкие ре-комбинационные события, которые в результате неправильного исключения профага приводят к образованию трансдуцирующих бактериофагов (ТБФ); в их ДНК часть фагового генома заменена на бактериальный (13,14). Сведения о механизме образования таких фагов отсутствовали; по существу ничего не было известно даже о степени структурной специфичности этого процесса. Вместе с тем, к началу настоящей работы проблема молекулярных механизмов образования ТБФ созрела для решения, прежде всего благодаря многочисленности и разнообразию полученных in vivo линий ТБФ и детальной структурно-функциональной охарактеризованности целого ряда их представителей.
В качестве объекта исследования молекулярного механизма этого процесса глы избрали один из наиболее известных трансдуцирующих бактериофагов лямбда - Лр1ас5 » содержащий в составе генома фрагмент лактозного оперона E.coli (15-17). Этот фаг неоднократно использовался для конструирования новых линий ТБФ (18), выделения и изучения регуляторних и структурных элементов лактозного оперона (16,19,20), создания разнообразных фаговых векторов для генной инженерии (21-25) и решения других молекулярно-биологи-ческих задач.
Похожие диссертации на Структура и механизм образования трансдуцирующего бактериофага лямбда plac5
