Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. РЕПРЕССОРЫ сі и CRO-КОМПОНЕНТЫ РЕШНТОРНОЙ
СИСТЕМЫ БАКТЕРИОФАГА X 8
1.1. Молекулярный триггер в бактериофаге А 8
1.2. Кристаллическая структура сго-репрессора 16
1.3. Структура и-концевого домена cl-penpeccopa. Взаимодействие с ДНК 19
ГЛАВА 2. ГОМОЛОГИИ. В СТРУКТУРАХ. РЖУЛЯТОРШХ. БЕЛКОВ
ТРАНСКРИПЦИИ 24
2.1. АМР-зависимый активатор катаболитных . генов... 24
2.2. Общие черты кристаллических структур 30
2.3. Аминокислотные последовательности и
вторичные структуры 32
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДІ ИССЛЩВАНШ 39
3.1. Материалы и реактивы 39
3.2. Выделение сго-репрессора 39
3.3. Определение характеристик белка 48
3.4. КД- и УФ-спектроскопия 49
3.5. Спектроскопия ЯМР 50
3.5.1. Приготовление образцов 50
3.5.2. Запись спектров. Методики 51
3.6. Анализ кривых титрования 54
3.7. Измерение рН 54
ГЖВА 4. ВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА CRO-РЕПРЕССОРА 55
4.1. Анализ ашшокислотном последовательности.. . 55
4.2. Анализ данных КД 58
ГЖВА 5. ИЗУЧЕНИЕ МИКРООКРУЖЕНИЯ АМИНОКИСЛОТНЫХ
ОСТАТКОВ И ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЗАИМО
ДЕЙСТВИЙ В CRO-РЕПРЕССОРЕ 70
5.1. Исследование состояний остатков тирозина с помощью абсорбционной спектроскопии 70
5.2. Изучение структуры ого-репрессора методом ЯМР 75
5.2.1. Отнесение сигналов в спектрах ЯМР 75
5.2.2. Изучение влияния ионизуемых.групп, Анализ кривых титрования 82
5.2.3. Доступность растворителю , гистидина-35 91
5.2.4. Идентификация внутримолекулярных взаимодействий с помощью.ядерного
эффекта Оверхаузера 93
ГЛАВА 6. СТРУКТУРА CRO-РЕПРЕССОРА В РАСТВОРЕ 107
ВЫВОДЫ 115
ЛИТЕРАТУРА 116
- Молекулярный триггер в бактериофаге А
- АМР-зависимый активатор катаболитных . генов...
- Материалы и реактивы
- Анализ ашшокислотном последовательности..
- Исследование состояний остатков тирозина с помощью абсорбционной спектроскопии
class1 РЕПРЕССОРЫ сі и CRO-КОМПОНЕНТЫ РЕШНТОРНОЙ
СИСТЕМЫ БАКТЕРИОФАГА class1
Молекулярный триггер в бактериофаге А
Бактериофаг А содержит линейную двухцепочечную ДНК длиной почти в 50 тыс. пар оснований, кодирующую около 50 белков /1-3/. После проникновения фаговой ДНК в бактериальную клетку происходит ее циклизация путем сшивания липких концов, и способ дальнейшего ее существования зависит от выбора пути развития: лити-ческого или лизогенного /4,5/.
При литическом цикле вирусная ДНК многократно реплицируется и направляет синтез белков,формирующих оболочки фагов.Примерно через три четверти часа после инфекции происходит лизис бактериальной клетки, и около 100 фаговых частиц выходит наружу /6/.
При лизогенном развитии транскрипция почти всех фаговых ге-яов подавлена, ДНК фага путем сайт-специфической рекомбинации включается в бактериальную хромосому и существует в виде профа-га. Вместе с бактериальной ДНК она реплицируется и передается дочерним клеткам как часть наследственного аппарата /7/. В случае возникновения в ряде генов мутации, препятствующих интеграции репрессированной фаговой ДНК, она переходит в состояние так называемой абортивной лизогении и передается одной из двух дочерних клеток при каждом клеточном делении /8-Ю/.
Профаг можно индуцировать с помощью разных агентов, общая особенность которых заключается в их разрушающем действии,на ДНК клетки-хозяина (например, УФ-облучение). Индукция профага, как и лизогения, может оказаться абортивной, когда после исключения фаговой ДНК из бактериальной хромосомы снова устанавливается репрессия /II/. При этом деление клетки не сопровождается репликацией циклизованной ДНК фага.
В лизогенном состоянии выражается только ген сі, кодирующий сі-репрессор, называемый также А-репрессором. Этот белок подавляет экспрессию всех остальных генов. Наоборот, при литическом развитии транскрипция гена сі подавлена репрессором, кодируемым геном его, который регулирует также.уровень собственного синтеза и транскрипцию ранних генов фага Репрессоры сі и его конкурируют между собой за связывание с тремя специфическими нуклеотидными последовательностями на операторе oR. Конкурентное связывание приводит к одному из двух устойчивых состояний - литическому или лизогенному /3-6, 12-15/.
Оба репрессора специфически связываются также с тремя сайтами на левом операторе oL /16/. Но поскольку эта конкуренция не имеет решающего значения при выборе пути развития фага,мы не будем на ней останавливаться.
class2 ГОМОЛОГИИ. В СТРУКТУРАХ. РЖУЛЯТОРШХ. БЕЛКОВ
ТРАНСКРИПЦИИ class2
АМР-зависимый активатор катаболитных . генов
Активатор катаболитных генов (САР), сАМР-зависимый белок, регулирует в геноме E.coli активность нескольких оперонов на уровне транскрипции, при этом сАМР выступает в роли аллостери-ческого эффектора /64,63/. При наличии достаточного количества внутриклеточного сАМР он образует с САР комплекс, который узнает на ДНК специфические сайты вблизи промоторов нескольких оперонов и изменяет скорость их транскрипции РНК-полимеразой. На оперонах іао, ага.и таї комплекс АМР-САР действует как позитивный регулятор /65,66/. На опероне gal имеется два перекрывающихся промотора РНК-полимеразы: САР необходим для инициации транскрипции с одного из них, но исключает транскрипцию с другого. В этом случае САР выступает и как позитивный и как негативных регулятор /67/, то есть в широком смысле САР тоже является репрес-сором.
В отсутствие САР или при низком уровне внутриклеточного сАМР экспрессия lac-оперона, и в первую очередь, гена б-галактозидазы, зависит от концентрации іас-репрессора, тетрамерного белка, который регулирует транскрипцию, связываясь на опероне с lac-оператором и стерически блокируя связывание РНК-полимеразы с промотором. В присутствии индуктора (лактоза in vivo и, например, IPTG in vitro) в іас репрессоре происходят конформационные изменения, он теряет специфическое сродство к оператору, И С 1а С-промотора открывается транскрипция /65,68,69/.
САР стимулирует активность РНК-полимеразы, как полагают, путем прямого контакта с ней, поскольку сайты их специфического связывания находятся в непосредственной близости друг от друга. Механизм положительной регуляции САР к настоящему времени остается неопределенным.
Активной формой САР является димер, состоящий из идентичных субъединиц с молекулярным весом 22500 и длиной полипептидной цепи в 201 аминокислотный остаток /70,71/. Протеолитическое щепле-ние разделяет САР на два независимых структурных домена /.Биохимические данные свидетельствуют, что в узнавании специфической последовательности на ДНК принимает участие только С-концевой домен белка /73/. Протеолитические н-концевые домены сохраняют способность к димеризации и к связыванию сАМР, в то время как меньшие С-концевые домены сохраняют способность связываться с ДНК /74/. Ряд экспериментов показывает также, что связывание сАМР вызывает значительные конформационные изменения в интактном белке /75-79/.
Материалы и реактивы
В состав питательных сред для выращивания микроорганизмов включали дрожжевой экстракт, триптон и пептон производства фирмы "DIPCO" (США).
Для хроматографии применяли сефадексы различных типов ("Pharmacia Pine Chemicals", Швеция) И ионообменную смолу Chelex 100 ("Bio-Rad", США). Ультрафильтрацию осуществляли в ячейках Amicon с применением мембран DiAPLO ("Amicon Corporation", Великобритания) .
Из других реактивов использовали: ампициллин, GU-HCI, Tris, ЭДТА ("Sigma", США); фенилметилсульфонилфторид, SDS ("Serva", M?r); акриламид, к к,-метилвнбисакриламид, ДТТ ("Reanai", Венгрия); 2-меркаптоэтанол ("Loba-Chemia", Австрия); стандарты для ЯМР-спект РОСКОПИИ - DSS И TSP - производства "Stohler Isotope Chemicals" (Швейцария) и "Merck" (ФРГ).
В качестве растворителя для ЯМР-спектроскопии применяли перегнанную тяжелую воду (содержание D2O не менее 99,8$) отечественного производства.
Остальные применявшиеся реактивы были отечественного производства с индексами "ХЧ" и "ОСЧ".
Анализ ашшокислотном последовательности
Анализ аминокислотной последовательности cro-репрессора позволил сделать некоторые предположения относительно его вторичной структуры на основании известных эмпирических правил /104,126-135/.
Один из способов проанализировать аминокислотную последовательность белка на предмет выявления возможных участков образования ос-спирали заключается в построении аксиальных проекций а-спиралей, содержащих последовательно.размещенные аминокислотные . остатки анализируемого участка /126/. Периметр этих проекций,имеющих вид колес со спицами, - окружность - представляет полипептидный остов, а спицы - боковые цепи аминокислотных остатков. В а -спирали на один виток приходится 3,6 остатка, а в проекции соседние остатки разделены углом, равным 100. Проекции совпадают, через каждые 5 витков, то есть через 18 остатков. Такие проекции нескольких сегментов полипептидной цепи сго-репрессора изображены на рис. .
При выделении предполагаемых сегментов в правоспиральной конформации мы руководствовались тем, что почти все гидрофобные остатки стабилизируют а-структуру, а почти все короткие гидрофильные и заряженные, а также глицин и пролин дестабилизируют ее. Глицин более, чем какой-либо другой остаток, способен образовывать левоспиральные участки. Остатки с отрицательно заряженными боковыми цепями имеют тенденцию располагаться вблизи N-КОНЦОВ спиралей, а с положительно заряженными - вблизи С-КОНЦОВ. Локализация остатков с гидрофобными боковыми цепями на одной стороне ос-спирали может способствовать ограничению их подвижности и стабилизации спирали. При такой локализации образуется сплошная гидрофобная поверхность, которая в принципе может .
Аминокислотные последовательности сго-репрессора и аксиальные проекции наиболее вероятных-«-спиральных участков лолйпептидной цепи. Пунктирными сегментами отмечены гидрофобные аминокислотные остатки, расположенные на одной стороне ot-спиралей и стабилизирующие структуру и третичную структуру белка за счет контакта с гидрофобной глобулой.
Сегменты iie-5 - Phe-14 и Gin-16 - Leu-23, способные образовывать яг-спирали, разделены остатком глицина, нарушающего эту структуру. Arg-4, по-видимому, не включен в первую спираль из-за электростатического отталкивания со стороны Lys-8. Giy-24, так же как и Giy-15, определяет границу второго tf-спирального участка. Наиболее вероятно образование «-спирали на сегменте vai-25 -Aia-36, ограниченном с.С-конца остатком глицина. Здесь His-35 находится вблизи С-конца, а аминокислотные остатки с гидрофобными боковыми.цепями оказываются, как и в предыдущих двух случаях,на. одной стороне спирали, что дополнительно стабилизирует структуру.
Возможно образование, а-спирали на сегменте Arg-38 - Asp-47, хотя это и маловероятно вследствие дестабилизирующего влияния Asnr 45 и почти равномерного распределения по поверхности гипотетического а-спирального домена остатков с полярными и гидрофобными боковыми цепями..По аналогичным причинам маловероятно образование а-спирали на С-концевом сегменте с такими дестабилизирующими
class5 ИЗУЧЕНИЕ МИКРООКРУЖЕНИЯ АМИНОКИСЛОТНЫХ
ОСТАТКОВ И ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЗАИМО
ДЕЙСТВИЙ В CRO-РЕПРЕССОРЕ class5
Исследование состояний остатков тирозина с помощью абсорбционной спектроскопии
Молекула cro-репрессора содержит три остатка тирозина в положениях 10, 26 и 51. Степень доступности этих остатков растворителю может быть определена спектрофотометрическим способом.
Поскольку молекула не содержит триптофана, абсорбция на 270-280 нм определяется в основном остатками тирозина. Незначительным вкладом таких хромофоров, как феннлаланин и гистидин, можно пренебречь /142/.
Известно, что молярная экстинкция свободного остатка тирозина при А = 275 нм, ?7R = 1400 М ом""1 /143/. В нейгг max (о ральных рН молярная экстинкция cro-репрессора, &276 = 4330; это значение выше, чем если бы экстинкция определялась просто аддитивным вкладом трех свободных остатков тирозина. Следовательно, по крайней мере один из тирозинов не полностью доступен растворителю. Это подтверждается спектрофотометрическим титрованием раствора cro-репрессора в щелочной области значений рН.
Депротонирование гидроксильной группы фенольного цикла тирозина сопровождается возрастанием абсорбции на 242 и 295 нм . /144/. Мы измеряли изменение абсорбции в спектрах на одной длине волны АА295 в соответствии с методом, впервые описанным Граммером /145/.
Спектры поглощения сг.о-репреосора не претерпевали никаких изменений в диапазоне рН 5-7 при ионной силе раствора, меньшей 0,02 М, и в диапазоне рН 5-8 при концентрации NaCi 0,2 и 1,0 М, однако при дальнейшем увеличении рН в них наблюдалось возрастаниє А295» Постепенно это переходило в красное смещение Л в спектре поглощения репрессора. Коэффициент молярной экстинкции.
В ходе измерений ионизация гидроксилов фенольних циклов не зависела от времени при всех исследованных значениях рН. Это говорило о том, что за время, проходившее от момента добавления щелочи до снятия спектра (около 5 минут) равновесие полностью устанавливалось.
На рис. 22 представлены кривые спектрофотометрического титрования сго-репрессора при трех значениях ионной силы раствора. Из графиков видно, что при повышении ионной силы ионизация фенольних циклов происходит при более высоких значениях рН. В то .. же время причины, обусловливающие повышение соответствующих значений рК в областях рН 8-Ю и 10-12 различны; к этому обстоятельству мы еще вернемся.
