Содержание к диссертации
Введение
Глава I Роль электростатических сил в белково-нуклеиновых взаимодействиях
1.1. Количественная оценка электростатических взаимодействий в системе белок - нуклеиновая кислота . . 10
1.2. Химическая модификация - метод идентификации функциональных групп белков 16
1.2.1. Типы реакций и реагенты, используемые для модификации положительно заряженных остатков аминокислот 17
1.2.2. Механизм и специфичность действия одикарбонильных соединений 23
1.3. Положительно заряженные остатки аминокислот в анион-евязыващих центрах белков ........ 27
1.4. Роль электростатических контактов во взаимодействии аминоацил-тРНК-синтетаз с субстратами. . . 34
Глава 2. Экспериментальная часть. Материалы и методы.. . 44
Глава 3. Исследование роли остатков аргинина во взаимодействии фенилаланил-тРНК-синтетазы субстратами 60
3.1. Модификация остатков аргинина с помощью 2,4-пен-тандиона 60
3.2. Влияние модификации остатков аргинина на кинетические параметры взаимодействия фермента с субстратами и комплексообразование его нилаланил-тРИК 64
3.3. Влияние субстратов на глубину модификации и степень инактивации фермента в реакциях обмена АТР-[3 Р]пирофосфат и аминоацилирования тРНК 70
Глава 4. Исследование роли остатков лизина во взаимодействии фенилаланил-тРНК-синтетазы из E.coil MRE -600 с субстратами 73
4.1. Исследование влияния модификации остатков лизина с помощью 2,4-пентандиона на функционирование фермента 73
4.1.1. Модификация остатков лизина с помощью 2,4-пентандиона 75
4.1.2. Влияние низкомолекулярных лигандов на глубину модификации и степень инактивации фермента. Влияние модификации остатков лизина на кинетические параметры взаимодействия фермента с низкомолекулярными субстратами 81
4.1.3. Влияние модификации остатков лизина на взаимодействие фермента с тРНК е 84
4.2. Модификация остатков лизина с помощью пиридоксаль-фосфата и аналогов субстратов - АТР и L -фенилаланиниладенилата, окисленных по рибозе. . . 90
108
Глава 5. Модификация валил-, тирозил-тРНК-синтетаз из E.coil MRE-600 и фенилаланил-тРБК-синтетазы из Bacillus StearothermopfllluS по остаткам лизина с помощью 2,4- пентандиона
Обсуждение результатов 115
- Количественная оценка электростатических взаимодействий в системе белок - нуклеиновая кислота
- Модификация остатков аргинина с помощью 2,4-пен-тандиона
- Исследование влияния модификации остатков лизина с помощью 2,4-пентандиона на функционирование фермента
- Модификация валил-, тирозил-тРНК-синтетаз из E.coil MRE-600 и фенилаланил-тРБК-синтетазы из Bacillus StearothermopfllluS по остаткам лизина с помощью 2,4- пентандиона
Количественная оценка электростатических взаимодействий в системе белок - нуклеиновая кислота
Характерной чертой белково-нуклеиновых взаимодействий является существование зависимости константы ассоциации комплекса белок - нуклеиновая кислота от ионной силы раствора. Риге и соавторы [4, 5] показали, что константа связывания lac -репрессорного белка с lac -оператором уменьшается приблизительно в 100 раз при увеличении концентрации моновалентных катионов в растворе от 0,01 М до 0,18 М. Подобные наблюдения были сделаны при изучении взаимодействия олиголизина с по-лирибонуклеотидами [6], связывания гистонов [ 7] и эстрадиол-рецепторного белка [8] с ДНК, а также при исследовании взаимодействия белка гена 32 бактериофага Т4 с нативной и денатурированной ДНК [ 9].
Интерпретация этих результатов в рамках теории полиэлектролитов [10] и теории комплексообразования [II] впервые дана Рекордом в 1976 году [ I ]. Согласно его подходу взаимодействие заряженного лиганда (L) с нуклеиновой кислотой (Р) в разбавленных растворах, где эффекты гидратации невелики, может быть выражено следующим образом:
L + Р (т центров) LP + ту М+, (I)
где т- количество ионных пар, образующихся при взаимодействии L с Р, у- число моновалентных катионов (М ), связанных с одной фосфатной группой нуклеиновой кислоты. При нейтрализации заряда фосфатной группы нуклеиновой кислоты в процессе образования ионной пары с лигандом освобождается \/ М+ионов.
Без учета таких эффектов, как гидратация и связывание моновалентных анионов положительно заряженным лигандом, зависимость константы ассоциации ( К ) от концентрации моновалент-ных катионов может быть выражена уравнением:
Модификация остатков аргинина с помощью 2,4-пен-тандиона
Для модификации фермента по остаткам аргинина нами был выбран 2,4-пентандион. Ддилберт и 0 Лири [35] показали, что 2,4-пентандион является специфическим реагентом го остаткам лизина при рН 7,0 и аргинина и лизина при рН 8 (см. главу I). Продукты модификации остатков лизина могут быть легко восстановлены при обработке гидроксиламином. Продукт взаимодействия остатка аргинина с 2,4-пентандионом-М-пропил-2-амино-4,6-ди-ме-тилпиримидин - стабилен, не реагирует с гидроксиламином. За глубиной модификации фермента по остаткам аргинина можно наблюдать спектрофотометрически по увеличению 1 300 т,к 0 РазУю"" щееся производное пиримидина имеет максимум поглощения при 300 нм и 300 = 3,4x10 М х см""1 [35], а нативный фермент незначительно поглощает на этой длине волны (рис. I).
Первоначально модификацию фенилаланил-тРНК-синтетазы 2,4-пентандионом проводили в 0,1 М натрий-бикарбонатном буфере, рН 8,3. В этих условиях наблюдалась инактивация фермента в реакции аминоацилирования тРНК, но отсутствовала инактивация в реакции обмена АТР-[ Р]пирофосфат. Это не могло быть связано с низкой реакционной способностью остатков аргинина при данных значениях рН среды [30]. Поскольку в 0,1 М натрий-бикарбонатном буфере фермент функционально неактивен, можно предполо
Исследование влияния модификации остатков лизина с помощью 2,4-пентандиона на функционирование фермента
Первоначально обработку фенилаланил-тШК-синтетазы 2,4-пентандионом проводили в условиях, предложенных в работе [35 ] для модификации лизоцимз: 0.1 М калий-фосфатный буфер, рН 7,0, 25С. Ба рисунке 8а показана зависимость активности фермента в реакции аминоацилирования (кривая I) и обмена АТР-[ Р]пирофос-фат (кривая 2) от времени модификации, на рисунке 86 - зависимость глубины модификации от времени (кривая I). Из рисунка видно, что модификация 25-26 моль лизиновых остатков на моль фермента приводит к инактивации фенилаланил-тРШ-синтетазы в реакции аминоацилирования на 80-90 %, в то время как активность ее в реакции обмена АТР-[32Р]пирофосфат полностью сохраняется. Кинетика инактивации (на начальном участке) подчиняется закону реакции псевдопервого порядка с константой скорости, равной т11x10 мин х. Кривая 3 на рис. 8а соответствует активности фермента, обработанного NH20H , рН 6,0, после модификации при любой степени инактивации. Из рисунка видно, что активность фермента при такой обработке полностью восстанавливается, а поглощение света при длине волны 310 нм, соответствующее продукту модификации остатков лизина, полностью исчезает (кривая 2, рис. 86).
Инактивация фермента в реакции аминоацилирования не является следствием диссоциации фермента на субъединицы, как было показа но с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (см. "Материалы и методы"). Электрофореграмма модифицированного фермента аналогична полученной в случае модификации остатков аргинина белка (см. рис. 3).
Модификация валил-, тирозил-тРНК-синтетаз из E.coil MRE-600 и фенилаланил-тРБК-синтетазы из Bacillus StearothermopfllluS по остаткам лизина с помощью 2,4- пентандиона
Исследование узнавания аминоацил-тРНК-синтетазами субстратов нуклеотидной природы необходимо для понимания механизма белково-нуклеиновых взаимодействий. Несмотря на то, что при физиологических значениях рН АРСазы заряжены отрицательно [131] , положительно заряженные остатки аминокислот (остатки лизина, аргинина,гис-тидина [143]) могут быть компонентами центров связывания субстратов анионной природы - АТР и тРНК.
К настоящему времени рентгеноструктурный анализ с высоким разрешением проведен для тирозил-тРНК-синтетазы из Bacillus stearouermopkUus [144, 145] и комплексов этого фермента с субстратами [146, 147], а также для метионил-тРНК-синтетазы из E.coti [148, 149]. Начато исследование пространственной структуры аспар-тил-тРНК-синтетазы из дрожжей [150].Первичная структура определена для триптофанил- и тирозил-тРНК-синтетаз из В. stearotfier-mopfiifus [I5I-I53J , метионил-, глицил- и алашл-тРНК-синтетаз из E.cott [153-155] , для аспартил-тРНК-синтетазы из дрожжей[156 ].
Результаты, полученные к настоящему времени о первичной и трехмерной структуре аминоацил-тРНК-синтетаз, не позволяют, однако, описать строение активного центра ни одного из этих ферментов. Б связи с этим значительная часть информации о структуре активных центров и функционировании АРСаз извлекается с помощью химических методов.
С использованием химической модификации в настоящей работе исследована роль остатков лизина и аргинина во взаимодействии ряда бактериальных аминоацил-тРЖ-синтетаз с субстратами.
Данные, полученные при модификации 2,4-пентандионом фенил-аланил-тРНК-синтетазы по остаткам аргинина, а именно: незначительное изменение величины Кт для тРНК в реакции аминоацилиро-вания и величины Kd комплекса фермента с аминоацил-тРНК могут свидетельствовать о неучастии остатвов аргинина в прямых контактах с тРНК. Модификация фермента по остаткам аргинина не приводит к изменению числа электростатических контактов, образующихся при взаимодействии с тРНК [104], Однако, в связи с возможностью сохранения положительного заряда в продукте модификации [30, 62], нельзя исключить участие этих аминокислотных остатков в создании электростатического поля в области первичной ассоциации тРНК. Нельзя исключить также их роль в каталитических стадиях реакции аминоатгллирования тРНК, так как при модификации фермента 2,4-пентандионом полная реакция ингибируется более существенно по сравнению с реакцией обмена АТР -[32Р]пирофосфат
