Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 9
1.1. Аргиназа печени млекопитающих
1.1.1. Физико-химические и кинетические свойства 10
1.1.2. Иммунохимические свойства и регуляция 28
1.1.3. Изоферменты 30
1.2. Неуреотелическая аргиназа
1.2.1. Физико-химические и кинетические свойства 32
1.2.2. Изоферменты и регуляция 42
1.3. Роль некоторых функциональных групп в проявлении активности и особенности функционирования аргиназы 45
1.3.1. Химическая модификация 45
1.3.2. Действие ультрафиолетового и ионизирующих излучений 51
1.3.3. Зависимость кинетических параметров каталитической реакции от рН среды 54
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 57
ГЛАВА III. Результаты экспериментов и их обсуждение
3.1. Изучение роли остатков триптофана в аргиназе 66
3.1.1. Влияние ультрафиолетового облучения 66
3.1.2. Сенсибилизированное эозином фотоокисление 76
3.1.3. Химическая модификация N - бромсукцинимидом 80
3.2. Влияние сульфгидрильных реагентов
3.2.1. Химическая модификация аргиназы ПХМБ 93
3.2.2. Влияние меркаптоэтанола и дитиотреитола 95
3.3. Химическая модификация остатков тирозина тетранитрометаном 97
3.4. Изучение роли остатков гистидина в аргиназе . 100
3.4.1. Сенсибилизированная метиленовым синим фотоинактивация 100
3.4.2. Химическая модификация диэтилпирокарбонатом 106
3.5. Изучение зависимости величины к^ от рН 114
3.6. Определение молекулярной массы субъединицы аргиназы 118
Заключение 121
Выводы 127
Список литературы 130
- Иммунохимические свойства и регуляция
- Зависимость кинетических параметров каталитической реакции от рН среды
- Сенсибилизированное эозином фотоокисление
- Химическая модификация остатков тирозина тетранитрометаном
Введение к работе
Аргиназа - аргинин уреогидролаза или амидиногидролаза катализирует реакцию расщепления аргинина на мочевину и орнитин. Эта реакция, впервые обнаруженная в печени млекопитающих в 1904 году (153), является завершающей стадией цикла реакций, связанных с нейтрализацией аммиака в организме - орнитинового цикла мочевины. На основании исследования аргиназной активности в тканях млекопитающих Клементи сформулировал положение, согласно которому аргиназа содержится преимущественно в печени уреотелических организмов (102). Дальнейшие исследования показали, однако, что этот фермент встречается не только в печени, но и в самых различных органах и тканях млекопитающих, включая почки, мозг, молочную железу, легкие, эритроциты и т.д. Аргиназа была обнаружена также в печени и других органах урикотелических и аммонотелических организмов, в микроорганизмах и растениях. Это свидетельствует о том, что кроме участия в орни-тиновом цикле, аргиназа в процессах жизнедеятельности организмов выполняет и другие функции. Согласно положению, выдвинутому Буня-тяном и Давтяном (24), в настоящее время различают две формы аргиназы - уреотелическую, находящуюся в печени уреотелических организмов и функционирующую в орнитиновом цикле мочевины, и неурео-телическую, которая не связана с механизмом нейтрализации аммиака и широко распространена в различных организмах, стоящих на разных ступенях эволюционного развития.
Многочисленные исследования свойств аргиназы из органов и тканей разных организмов показали, что аргиназа может участвовать в процессах биосинтеза пролина и глутамата (147,202,210,256), в процессах регуляции синтеза гистонов в ядре (24,125). Некоторые авторы предполагают участие аргиназы в пролиферации эпителиальных клеток кишечника, где орнитин используется как исходный материал для синтеза полиаминов (115). Аргиназа может участвовать, по-видимому, также в лимитировании содержания в клетках мочевины, аргинина и биологически активных однозамещенных гуанидиновых соединений (19). Таким образом, аргиназа - широко распространенный в живых организмах фермент, играющий важную роль во многих процессах метаболизма, и имеющий общебиологическое значение.
Б последние годы в ряде работ показано, что аргиназа угнетает рост опухолевых тканей. Так аргиназа печени крыс ингибирует рост гепатомы (183), а аргиназа печени быка подавляет рост лимфосарко-мы мыши in vitro (239). Антиопухолевой активностью обладает также аргиназа макрофагов перитонеального эксудата мышей (99), аргиназа печени акулы (220) и т.д. Задержка роста опухолей при введении аргиназы, возможно, объясняется удалением из среды аргинина, который в большом количестве необходим для злокачественного роста ( 220). Сравнительное исследование цитотоксичности аргиназы печени быка и крысы, проведенное на клеточных линиях рака человека (23), показало, что существует определенная специфичность во влиянии на рост и развитие клеточных культур аргиназ из разных объектов.
Из печени быка модификацией полиэтиленгликолем получен препарат аргиназы, который предотвращает рост клеток лимфосаркомы мышей в культуре, не действуя на нормальные клетки (219). Этот препарат по мнению авторов может быть использован в ферментной терапии как антираковое средство, причем большим преимуществом является то, что проблем по устранению иммунных реакций, возникающих при введении инородных белков, в данном случае не наблюдается, так как антигенные участки блокируются при взаимодействии с полимером. Таким образом, выделение выеокоочищенных препаратов аргиназы и исследование ее структурных и функциональных особенностей является одной из важнейших задач не только современной энзимологии, но и ферментотерапии. Возможность получения эффективного препарата для лечения или замедления роста опухолевых тканей ставит этот вопрос в один ряд с важнейшими медико-биологическими проблемами современности.
Хотя важность метаболической роли аргиназы была определена ещё в 1932 году (154), и аргиназа, выделенная из многих органов и тканей различных организмов, широко исследуется, структура активного центра и механизм действия этого фермента остаются неизученными.
Цель работы. Настоящая работа посвящена исследованию роли некоторых аминокислотных остатков / триптофана, тирозина, гистидина, серина, лизина, цистина, цистеина/ в проявлении активности и поддержании нативной конформации аргиназы печени крупного рогатого скота с помощью методов химической модификации, сенсибилизированного красителями фотоокисления и изучения влияния ультрафиолетового излучения на растворы фермента. Изучались также субъединичная структура аргиназы и ионизационные свойства групп активного центра с помощью анализа зависимости величины кт от рН.
Научная новизна и практическая ценность. Впервые была исследована роль ряда аминокислотных остатков в аргиназе печени крупного рогатого скота. С помощью метода химической модификации бромсукцинимидом и тетранитрометаном, сенсибилизированного эозином фотоокисления и изучения влияния ультрафиолетового облучения на растворы аргиназы показано, что остатки триптофана и тирозина не входят в состав активного центра, но участвуют, по-видимому, в поддержании наивной конформации аргиназы. Свободные SH - группы и дисульфидные связи, остатки серина и лизина не существенны для проявления активности фермента.
Впервые изучены некоторые закономерности фотохемилюминесценции, индуцированной ультрафиолетовым облучением, и сенсибилизированной эозином фотохемилюминесценции в растворах аргиназы. Исследовано также влияние рН на флуоресцентные свойства и скорость фотолиза остатков триптофана под действием УФ света.
Применяя методы сенсибилизированного фотоокисления в присутствии метиленового синего и химической модификации удалось установить важную роль остатков гистидина в проявлении активности аргиназы. Показано, что остаток гистидина не участвует в каталитическом акте реакции, но, по-видимому, играет важную роль в процессах связывания субстрата.
Анализ зависимости величины KL ОТ рН показал, что ионизирующиеся в исследуемой области рН группы аргиназы и аргинина не участвуют в связывании фермента с субстратом. При образовании фермент-субстратного комплекса происходит лишь изменение значений рК аминогруппы аргинина и не идентифицированной группы в аргиназе с рК 10,1, находящейся вблизи от активного центра. С помощью метода электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН показано, что аргиназа печени крупного рогатого скота состоит из двух идентичных субъединиц, с М.м. 71000 д, в связывании которых дисульфидные связи участия не принимают.
Полученные данные позволяют определить дальнейшие, направления в изучении строения и свойств активного центра и механизма действия аргиназы, что является необходимым для разработки способов целенаправленного регулирования активности фермента при использовании его в качестве противоопухолевого препарата.
Иммунохимические свойства и регуляция
Заряд молекулы, чувствительность к протеолизу Существенные различия обнаружены в электрических свойствах аргиназ печени млекопитающих /табл.1/. Аргиназы печени быка, кролика, обезьяны, лошади являются анионами, а ферменты печени человека, собаки, мыши и крысы - катионами (138). Катионные формы более устойчивы при хранении и длительном диализе. Это объясняется различием в связывании ионов Мп2+и других двухвалентных катионов : катионные формы связывают его прочнее, поэтому и стабильность у них выше (138). После обработки аргиназы печени человека ЭДТА наблюдается изменение величины pi от 9,2 до 6,6 (96). Таким образом ионы марганца существенно влияют на величину заряда молекулы аргиназы.
Как видно из вышеизложенного, ионы Мп2+ играют очень важную роль в функционировании молекулы аргиназы. Они необходимы для стабилизации и активации фермента, для поддержания его олигомерной структуры и обеспечения заряда молекулы, регулируют оптимум рН и термостабильность.
Присутствие этих ионов влияет и на протеолитическую чувствительность аргиназы. Неактивированный фермент печени быка нечувствителен к действию трипсина. Однако, при добавлении ионов Мп2+ под действием тех же концентраций трипсина наблюдается инактивация (86). По мнению автора в присутствии ионов Мп2+ происходит такое изменение конформации, которое отражается на чувствительности аргиназы к протеолизу. Некоторые ингибиторы /лейцин, валин, изолей-цин/ в сравнительно низких концентрациях предохраняют аргиназу от инактивации трипсином. Лизин, орнитин и серии почти не влияют на этот процесс, а аргинин оказывает слабое защитное влияние при очень высоких концентрациях. Автор предполагает, что участок связывания лейцина, валина и изолейцина в аргиназе печени быка отличен от участка связывания орнитина, лизина и аргинина. По-видимому, присутствие этих соединений в клетке может предотвращать инактивацию аргиназы протеолитическими ферментами, увеличивая тем самым время жизни. Флуктуации аминокислотного пула в зависимости от диеты и метаболических условий могут изменять структуру аргиназы, влияя на стабильность и полупериод жизни фермента в клетке. Действительно, полупериод жизни аргиназы печени крыс изменяется в зависимости от изменения диеты (223).
Частично очищенная аргиназа печени крыс теряет активность при инкубации с разрушенными лизосомами (132). Ионы Мп2+ в этом случае защищают аргиназу от инактивации. Защитное влияние оказывают также орнитин, пролин, глицин, аланин и аргинин. Снижение чувствительности аргиназы к протеолизу в присутствии ионов Мп в этом случае, вероятно, связано со спецификой действия лизосомальных ферментов.
Аргиназа, как и большинство белков имеет характерную полосу поглощения в ультрафиолетовой области спектра с максимумом при 280 нм. Исследование флуоресценции растворов аргиназы печени крупного рогатого скота показало, что этот фермент имеет довольно интенсивную ФЛ с максимумом при 337-338 НІЙ И полушириной спектра ФЛ - 54 при длине волны возбуждения 296,7 нм, где поглощают остатки триптофана в белках (14). Согласно модели о трех возможных состояниях остатков триптофана в белках, предложенной Веденкиной и сотр.(14), основная ФЛ в растворах аргиназы связана с поверхностно расположенными остатками триптофана. Вклад внутренних и поверхностных остатков триптофана во ФЛ аргиназы, оцененный с помощью диаграммы составляет 0,35 и 0,65 соответственно (12,14). Денатурация аргиназы мочевиной приводит к смещению положения максимума в длинноволновую область, как и у многих других белков, а полуширина изменяется до 61 (14).
Представляют интерес работы Конева и сотр. (36,38), в которых была обнаружена способность аргиназы и некоторых других белков скачкообразно перестраивать конформацию при физиологически умеренных температурах /6-35С/. Изучение степени поляризации ФЛ и изменения положения максимума спектров ФЛ показало, что у натив-ной аргиназы печени крупного рогатого скота существует 2 дискретных конформационных состояния, переходящих друг в друга по кинетике кооперативного перехода в интервале температур 6-35С. Исследование влияния более высоких температур /40-70С/ позволило заключить, что денатурационный процесс у аргиназы, как и у других белков, развивается двустадийно, через предденатурационную обра-г тимую конформацию. Факт существования белков в различных температурных формах может иметь определенное значение для их каталити-тических, регулятордах и контактных функций. Возможно, что переходы такого типа способны претерпевать белки не только в растворе, но и в живой клетке (38).
Зависимость кинетических параметров каталитической реакции от рН среды
Исследование зависимости кинетических параметров от рН среды позволяет получить ценную информацию о природе функциональных групп, входящих в состав активного центра фермента, об их ионизационных свойствах и способности связываться с субстратом и ингибиторами (29,61,65,107).
Как показало исследование зависимости величин кт и 7 от рН, проведенное на аргиназе печени цыплят (123), урикотелическая аргиназа связывается преимущественно с непротонированной формой субстрата. Обнаружено различие в кинетических характеристиках при гидролизе этой аргиназой аргинина и аргининовой кислоты, что по мнению авторов связано с ионизацией аминогруппы аргинина. С увеличением рН от 8,5 до 10,3 величина рк для аргинина уменьшается от 1,52 до 1,16, а V - увеличивается в 10 раз. Величина рК в той же области рН для аргининовой кислоты увеличивается от 1,28 до 1,62, а V возрастает только в 1,5 раза. Авторы считают, что изменения этих величин в зависимости от рН в случае аргининовой кислоты связаны с ионизирующимися группами фермента, так как ар-гининовая кислота содержит только карбоксильную и гуанидиновую группы, рК которых не меняется в исследуемой области рН. В случае же аргинина, вероятно, играют роль оба процесса - изменение ионизационного состояния фермента и субстрата (123). Резкое увеличение v для аргинина в отличие от аргининовой кислоты объясняется увеличением непротонированной формы аргинина в растворе, которая легче взаимодействует с ферментом. У изофермента аргиназы печени цыплят, индуцируемого введением гидрокортизона или голоданием, как и у аргиназы почек цыплят (243), в области рН 7,5 - 10,3 не происходит изменений значений кт , хотя V резко увеличивается. Это свидетельствует о том, что и эти ферменты гидролизуют аргинин преимущественно с непротонированной аминогруппой (122). Таким образом, обе формы аргиназы печени цыплят, хотя и отличаются по ионизационным свойствам аминокислотных остатков активного центра, но гораздо эффективнее взаимодействуют с непротонированной формой аргинина (122).
Свободные гуанидиновая и карбоксильная группы аргинина также важны для взаимодействия с аргиназой. Замещение той или иной из них приводит к потере активности. Существенна также дайна углеродной цепочки, так как ни четырехуглеродная - $ - гуанидиномасля-ная, ни шестиуглеродная - & - гуанидинокапроновая кислоты не гидролизуются аргиназой. Однако, атом углерода может быть замещен в углеродной цепочке кислородом с сохранением, в некоторой степени, активности - так канаванин расщепляется аргиназой, хотя и менее эффективно (126).
Исследуя зависимость кинетических параметров аргиназы печени быка и кролика от рН, Гринберг и сотр. (128) предприняли попытку интерпретировать изменение к от рН на основании гипотезы о том, что фермент-субстратный промежуточный комплекс образуется при взаимодействии анионной группы аргиназы и унивалентного катиона аргинина. Согласно этим данным, в области рН 7-9 величина Кт не меняется. Это объясняли тем, что в данной области рН отрицательно заряженная группа в ферменте связывается с положительно заряженной аминогруппой аргинина (107,168). Наклон в щелочной области связан с аминогруппой субстрата /рК= 9/, а в кислой области - с группой фермента с рК около 7 (107,168). Рассмотрение данных, полученных на аргиназе печени лошади показало, что это предположение не вполне корректно, и была предложена новая интерпретация (127). Кривая зависимости Km от рН по данным этих авторов при рН 10 имеет минимум больший, чем при рН 8, как было показано ранее (76). Вероятно, это связано с тем, что фермент освобожден от других, кроме ионов Мп2+ ионов металлов. Характер зависимости от рН показывает, что каталитически атакуемым, наиболее вероятно, является цвиттерион аргинина. Была предложена схема кинетического механизма реакции в формулировке Альберти (71) : где А - разные ионные формы субстрата, Е - фермента, n общее число отрицательных зарядов групп, находящихся вблизи от активного центра.
Из этой схемы были выведены кинетические уравнения и оценено численное значение различных констант при 25 и 35С. Полученные данные позволили заключить, что фермент содержит 3 активно диссоциирующие группы; две из них характеризуются кислой ветвью рН зависимости, а третья - щелочной. Каждая из этих групп имеет свою функцию в ферменте. При увеличении рН от 7 до 10 пропорция активной формы аргинина увеличивается. Возможно, положительный заряд катиона аргинина защищает его от взаимодействия с активным центром из-за сети положительных зарядов , имеющихся там в результате связывания ионов Мп2+ (127).
Сенсибилизированное эозином фотоокисление
Как показано в ряде работ (54,55,69),снижение начальной интенсивности ФХЛ с увеличением времени облучения связано с расходованием триптофанилов в белке при действии УФ света. Оно отражает уменьшение скорости образования свободных радикалов за счет фотолиза остатков триптофана. Совпадение скоростей снижения интенсивности Ш и ФХЛ растворов аргиназы при увеличении времени облучения подтверждает, что обе зависимости отражают процесс разрушения остатков триптофана в аргиназе при УФ облучении. Таким образом, инактивация аргиназы при УФ облучении связана с фотолизом остатков триптофана с образованием свободных радикалов, в результате превращений которых возникает фотохемилюминесценция. Отсутствие влияния конкурентного ингибитора на скорость фотолиза остатков триптофана указывает на то, что разрушающиеся триптофа-нилы находятся вне активного центра фермента. Инактивация, по-видимому, является результатом косвенного влияния, связанного либо с взаимодействием образующихся в ходе облучения активных продуктов фотолиза триптофанилов с чувствительными функциональными группами фермента, ответственными за проявление активности, либо с небольшими нарушениями конформации в области активного центра аргиназы в результате разрушения остатков триптофана. В работе Конева и сотр. (37) наблюдалась частичная защита аргинином растворов аргиназы от инактивации при УФ облучении. Вместе с уменьшением степени инактивации было обнаружено снижение скорости фотолиза триптофановых остатков в присутствии субстрата, а также образование иных, чем при облучении свободного фермента фотопродуктов, что по мнению авторов связано с конформационной перестройкой, происходящей при присоединении субстрата. По нашему мнению, однако, частичную защиту аргинином от инактивации можно объяснить, вероятно, взаимодействием активных частиц, образующихся при УФ облучении в растворе белка с молекулами аргинина. Эта аминокислота, как показано в работах (55,56), чувствительней по сравнению с другими аминокислотами, кроме триптофана, к активным продуктам, образующимся в растворах при различных облучениях /интенсивность хемилюминесценции, возникающей при облучении рентгеновскими лучами растворов аргинина, в 2-3 раза выше, чем в растворах других аминокислот кроме триптофана/. В связи с этим обстоятельством в наших экспериментах не проводилось изучения влияния аргинина на процессы инактивации аргиназы при УФ облучении.
Фотоинактивация растворов ферментов при облучении видимым светом в присутствии красителей является широко распространенным в настоящее время методом идентификации важных для активности функциональных групп ферментов (48,131,206,224). Поглощение света красителем вызывает образование активных продуктов/молекул красителя в триплетном возбужденном состоянии, синглетного кислорода/, которые модифицируют некоторые функциональные группы фермен-тов, что и приводит к инактивации (131,148,149), Потеря активности может происходить как за счет сенсибилизированного фотоокисления функциональных групп непосредственно в активном центре, так и за счет фотохимического разрушения аминокислотных остатков, участвующих в образовании вторичной и третичной структуры (141). Наиболее чувствительными к фотоокислению в присутствии красителей являются остатки триптофана, тирозина, метионина, гистидина, цис-тина и цистеина в белках (160,186,206,207,251). Скорость фотоокисления чувствительных аминокислотных остатков в составе того или иного белка зависит от условий проведения эксперимента /температура, рН, интенсивность облучения и др./ и вида красителя. При определенных условиях можно вызвать избирательную модификацию остатков только одного типа (224). Как считают некоторые авторы, механизм инактивации в присутствии разных красителей различен ( 160). Использование эозина в качестве сенсибилизатора фотоокисления часто приводит к разрушению остатков триптофана в ферментах (131,140,141,149,160). В связи с этим в наших экспериментах в качестве сенсибилизатора фотоокисления "триптофановых остатков в аргиназе был использован эозин.
При облучении растворов аргиназы видимым светом в присутствии эозина происходит сенсибилизированное фотоокисление остатков триптофана. Как показало измерение спектров триптофановой ФЛ в облученных растворах аргиназы, интенсивность ФЛ снижается, а положение максимума не меняется /рис.11/. На рисунке 8 показано изменение относительной интенсивности триптофановой ФЛ облученных растворов аргиназы в максимуме с ростом времени облучения. Спектры поглощения и ФЛ растворов аргиназы в присутствии эозина не меняются, что указывает на отсутствие связывания красителя с аргиназой в области триптофановых остатков.
Химическая модификация остатков тирозина тетранитрометаном
Фотоокисление аргиназы, сенсибилизированное метиленовим синим, было проведено в присутствии субстрата и некоторых аминокислот / табл.10/. Как видно из таблицы, аргинин, лизин и орнитин в одинаковой мере, частично, предохраняют фермент от инактивации. Пролин и цистеин имеют слабый защитный эффект, а аспарагиновая кислота совсем не влияет на степень инактивации аргиназы. По-видимому, аргинин, орнитин и лизин предохраняют те же участки а ргиназы от фотоокисления в данных условиях. Однако, эти соединения не защищают фермент от инактивации полностью. Наличие 30$ инактивации даже в присутствии субстрата или конкурентного ингибитора свидетельствует о том, что в процессе облучения фотоокислению подвергаются функциональные группы, не защищенные субстратом, но имеющие определенное значение для проявления активности аргиназы. По-видимому, их разрушение изменяет конформацию активного центра фермента, что влияет на активность аргиназы. Присутствие в растворе при облучении одновременно аргинина и пролина показало отсутствие адиттив-ности в защитном влиянии этих соединений. По-видимому, обе аминокислоты связываются с одним и тем же участком макромолекулы аргиназы.
Исследовалось влияние рН среды на скорость инактивации аргиназы в данных условиях. Зависимость скорости инактивации от рН при сенсибилизированном фотоокислении существенных для проявления активности остатков гистидина в ферментах имеет характерную форму, сходную с зависимостью фотоокисления свободного гистидина от рН (39,73,98,105,113,244). Максимальное снижение активности в этих случаях происходит в области рН 6-8, что связано с изменением ионизационного состояния имидазольного кольца гистидина (42,52). Фотоокисление гистидина происходит тогда, когда он депротонирован (185,251). Б наших экспериментах /рис.19/ с ростом значений рН происходит увеличение скорости инактивации, причем это увеличение наблюдается и при рН выше 8. Возрастание скорости фотоокисления остатков гистидина в щелочной области рН наблюдалось при фотоокислении растворов транскетолазы в присутствии метиленового синего (39). Авторы объясняют это влиянием боковых групп фермента на реакционную способность имидазольного кольца гистидина, аналогично влиянию аминогруппы в свободном гистидине. Таким образом, увеличение скорости инактивации аргиназы с ростом значений рН можно объяснить изменением ионизационного состояния чувствительных к фотоокислению аминокислотных остатков. Кроме остатков гистидина, к числу функциональных групп, чувствительных к фотоокислению и изменяющих свое ионизационное состояние при этих значениях рН относятся остатки цистеина (42). Однако, как показали наши исследования, эти аминокислотные остатки не играют роли в проявлении активности аргиназы печени крупного рогатого скота и, по-видимому, инактивация аргиназы в данных условиях связана с деструкцией остатков гистидина.
Можно было предположить, что в растворах аргиназы в исследуемой области рН происходит изменение конформации фермента, приводящее к экспонированию ранее недоступных, но важных для проявления активности функциональных групп, подвергающихся фотоокислению в данных условиях. В литературе, однако, нет каких-либо сведений о конформационных изменениях молекулы аргиназы в этой области рН. Наши данные по измерению спектров ФЛ, а также изучению скорости фотолиза триптофановых остатков в растворах с рН 7 и 9,5 не выявили каких-либо нарушений конформации аргиназы. Частичная защита аргиназы субстратом или ингибиторами от инактивации в данных условиях позволяет предположить, что важные для проявления активности, фотоокисляющиеся группы находятся как в составе активного центра фермента, так и вне его.
Образующийся в результате реакции карбэтоксигистидил имеет максимум поглощения при 240-242 нм, что позволяет легко определять число прореагировавших остатков гистидина (189). Взаимодействие аргиназы при рН 6 в течение 30 минут с ДПК приводит к снижению ферментативной активности на 50$. На рисунке 20 показана кинетика инактивации и модификации остатков гистидина аргиназы при взаимодействии с ДПК. Из рисунка видно, что инактивация происходит, в основном, в течение первых 5 минут, а дальнейшая инкубация слабо отражается на активности фермента. Остатки гистидина отличаются по скорости взаимодействия с ДПК. Часть этих остатков быстро реагирует /в первые 1-2 минуты/, затем скорость модификации уменьшается. На рисунке 20 Б представлены полулогарифмические зависимости остаточной активности аргиназы и доли непро-реагировавших к данному моменту времени остатков гистидинаС-2 -) от времени /п - максимальное число модифицирующихся в этих условиях остатков гистидина, принятое равным 6, х - число остатков гистидина, модифицированных в момент времени t /. Вначале скорости этих процессов близки, дальнейшая модификация остатков гистидина почти не отражается на активности аргиназы. Согласно Рею и Кошленду (207) такой характер зависимости логарифма остаточной активности от времени соответствует процессу, при котором молекулы фермента не инактивируются полностью. Происходит только снижение активности молекул аргиназы по сравнению с нативными в результате модификации остатков гистидина.
