Содержание к диссертации
Введение
Введение 4
Обзор литературы. Структура и механизм действия пиридиксальфосфат зависимых лиаз 5
Классификация и реакционная специфичность пиридоксаль-фосфат зависимых лиаз 6
Пространственное строение пиридоксаль-5'-фосфат-зависимых лиаз 10
Каталитический механизм пиридоксаль-5'-фосфат-зависимых лиаз 25
Роль отдельных аминокислотных остатков в механизме пиридоксаль-фосфат-зависимых лиаз 28
Результаты и их обсуждение
Введение 51
Очистка триптофаназы и спектральные свойства фермента 55
Факторы, определяющие субстратную специфичность триптофаназы 63
Роль остатка аргинина 226 в механизме действия триптофаназы 66
Роль остатка тирозина 72 в механизме действия триптофаназы 72
Роль остатков аспарагиновой кислоты 133 и гистидина 458 в механизме действия триптофаназы 78
Выводы 96
Методы исследования
Выращивание бактериальных масс, выделение и очистка ферментов 97
Определение концентрации белка 98
Определение активности ферментов 99
Определение чистоты выделенных ферментов 99
Кинетические исследования 99
Спектральные исследования ферментов 102
Получение апофермента 103
Определение константы диссоциации пиридоксаль-фосфата 103
Идентификация продуктов побочной реакции трансаминирования 104
Список цитированной литературы
- Классификация и реакционная специфичность пиридоксаль-фосфат зависимых лиаз
- Очистка триптофаназы и спектральные свойства фермента
- Роль остатка тирозина 72 в механизме действия триптофаназы
- Определение активности ферментов
Классификация и реакционная специфичность пиридоксаль-фосфат зависимых лиаз
Согласно международной классификации ферментов (1), пиридоксаль-5 -фосфат- зависимые ферменты, катализирующие множество разнообразных реакций метаболизма аминокислот, являются представителями пяти различных классов. Более пятидесяти пиридоксаль-5 -фосфат-зависимых ферментов принадлежат к классу лиаз (ЕС 4). Ферменты этого класса расщепляют С-С, С-О, C-N и другие связи в реакциях, не являющихся гидролитическими или окислительными (2). Лиазы подразделяются на семь подклассов, из которых пять содержат пиридоксаль-5 -зависимые ферменты (табл. 1). Подкласс углерод-углерод-лиаз содержит декарбоксилазы, альдолазы и другие лиазы. Ферменты этого подкласса катализируют расщепление С-С связей субстратов. Ферменты, принадлежащие к углерод-кислород-подклассу, расщепляют С-О связи за счет элиминирования воды или фосфата. При взаимодействии с субстратами ферментов, принадлежащих к углерод-азот-лиазам, высвобождается аммоний с образованием двойных связей в продуктах. Но некоторые ферменты этого подкласса катализируют отщепление другого компонента, например воды, за которым следует изомеризация и гидролиз, ведущий к разрыву C-N связи субстрата. Пиридоксалевые ферменты подклассов 4.4 и 4.5 расщепляют, соответственно, связи C-S или С-С1 субстратов (табл. 1). В последние годы были предприняты попытки классифицировать пиридоксаль-5 -фосфат-зависимые ферменты в эволюционные группы. Кристеном и соавторами (3) была предложена классификация на основе гомологии первичных структур: профильный анализ первичных последовательностей пиридоксаль-5 -фосфат-зависимых ферментов показал, что большинство этих ферментов можно отнести к одному из трех гомологичных семейств - а, Р или у. Авторами было обнаружено, что принадлежность ферментов к 9 одному из этих семейств в большинстве случаев коррелирует с местоположением субстратного атома углерода, вовлеченного в ковалентные изменения. Являющееся наиболее многочисленным сс-семейство включает в себя ферменты, которые катализируют, за несколькими исключениями, превращения аминокислот, в которых ковалентные изменения происходят у С-а-атома субстрата. Ферменты (3- и у-семейств катализируют ковалентные превращения при Р- или у-углеродном атоме (р-замещение, 3-элиминирование или у-замещение, у-элиминирование). Для некоторых ферментов отсутствует корреляция между принадлежностью к тому или иному семейству и реакционной специфичностью, как, например, для тирозин - фенол-лиазы и триптофаназы, которые являются членами а-семейства, но катализируют реакции Р-элиминирования.
Принадлежащая к а-семейству 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат-синтаза катализирует а,у-элиминирование; треонинсинтаза (Р-семейство) катализирует реакцию у,р-замещения; цистатионин-Р-лиаза (у-семейство) - реакцию Р-элиминирования. Кроме того, многие пиридоксаль-5 -фосфат-зависимые ферменты катализируют побочные реакции, которые соответствуют основным катализируемым реакциям других пиридоксаль-5 -фосфат-зависимых ферментов. Структурное различие между а- и Р-семействами заключается в том, что остаток лизина, связывающий кофермент в активном центре, в ферментах а-семейства располагается в области аминокислотных остатков 209-256, в то время как в ферментах Р-семейства этот остаток лизина находится в N-концевом фрагменте полипептидной цепи в пределах остатков 41-118. В ферментах у-семейства пиридоксаль-5 -фосфат связан в том же сегменте, что и у представителей а-семейства. Таким образом, на основании гомологии первичных структур ферментов было высказано предположение об эволюционной связи а-и у-семейств (3). Более поздние исследования позволили на основании профильного анализа первичных последовательностей ферментов различных семейств (4) и сравнения их пространственных структур (5) сделать вывод о том, что витамин Вб-зависимые ферменты принадлежат к четырем эволюционно независимым гомологичным семействам (6). Это а- и Р-семейства, семейства аминотрансферазы D-аминокислот и аланин-рацемазы. а-Семейство является наиболее многочисленным и функционально роазнообразным, оно включает ферменты, катализирующие реакции с участием не только а-углеродного атома субстрата, но и у-углеродного атома, выделенные ранее в отдельное у-семейство (3). Три других семейства содержат значительно меньшее количество ферментов, являясь при этом структурно и функционально более гомогенными. Предполагается, что в процессе своего эволюционного развития витамин Вб-зависимые ферменты вначале различались по реакционной специфичности, а затем произошло их разделение по субстратной специфичности (6, 7). Функциональная специализация большинства пиридоксалевых ферментов завершилась уже в общей древней клетке, являвшейся предшественником эукариот, эубактерий и архебактерий перед их разделением на три биологических царства около 1-1,5 млрд. лет назад (8). Столь раннее возникновение в процессе биологической эволюции характерно, вероятно, для большинства пиридоксаль-5 -фосфат-зависимых ферментов, так как они катализируюут реакции, связывающие различные метаболические пути, большинство же этих метаболических путей установилось уже в древней клетке, являвшейся предшественником современных клеток (9). 2. Пространственное строение пиридоксаль-5 -фосфат-зависимых лиаз.
Для полного описания молекулярного механизма действия того или иного фермента требуется точное знание химической топографии активного центра в свободном ферменте и в образуемых им промежуточных комплексах с субстратами и ингибиторами. Наиболее полную и точную информацию о структуре активных центров дает рентгеноструктурное исследование кристаллов ферментов, а также их комплексов с аналогами субстратов. Известно около двадцати пиридоксаль-5 -фосфат-зависимых лиаз, для которых при помощи этого метода удалось при высоких разрешениях построить полные молекулярные модели пространственной структуры (таблица 2). Одной из первых была определена структура триптофансинтазы, принадлежащей к р-семейству (10). Большое количество ферментов с известной структурой принадлежит к сс-семейству. После определения трехмерной структуры члена у-семейства, цистатионин-Р-лиазы (11), подтвердилось предположение об эволюционной связи а- и у-семейств, то есть наличии единого эволюционного предшественника. Основываясь на сравнении первичных последовательностей, элементов вторичной структуры и известных пространственных структур, Голдсмит и соавторы (12) предложили разделить витамин Вб-зависимые ферменты на пять структурных типов укладки. Позже Янсониус разделил эти ферменты на четыре структурных класса, исключив из рассмотрения фосфорилазы (5). Первый тип пространственной укладки является наиболее хорошо структурно охарактеризованным. Ферменты этого типа каталитически активны как гомодимеры, но в некоторых случаях объединены в комплексы большего размера (13). Каждая субъединица состоит из двух доменов: большого домена, включающего в себя семислойную Р-структуру, и малого, содержащего С-концевую часть полипептидной цепи, которая уложена в трех- или четырехслойную р-структуру, покрытую с одной стороны а-спиралями (рис. 1). N-концевая часть полипептидной цепи чаще всего входит в состав малого домена. Активный центр ферментов расположен в щели между двумя доменами в области контактов двух субъединиц димера. Пиридоксаль-5 -фосфат образует в большом домене ковалентную связь с є-аминогруппой остатка лизина, при этом в стабилизации кофактора участвуют аминокислотные остатки обоих доменов и субъединиц.
Очистка триптофаназы и спектральные свойства фермента
В отличие от триптофаназы из Е. coli, для которой при рН 7,8 преобладающим таутомером внутреннего альдимина является енолимин (119), в спектре холофермента из Proteus vulgaris преобладающим таутомером является кетоенамин, имеющий максимум поглощения при 422 нм (рис. 9). Для тирозин - фенол-лиазы из Citrobacter freundii, имеющей высокую степень гомологии с триптофаназой из Proteus vulgaris (120), преобладающей таутомерной формой холофермента также является кетоенамин. Полученные спектральные данные позволяют сделать предположение, что в триптофаназе из Proteus vulgaris, также как и в тирозин - фенол-лиазе, микроокружение активного центра менее гидрофобно, чем в триптофаназе из Е. coli. Исследование взаимодействия триптофаназы с рядом аминокислот, конкурентно ингибирующих а,Р-элиминирование L-триптофана, показало, что фермент катализирует отрыв С-а-протонов аминокислот с образованием хиноидных комплексов. В спектрах поглощения и кругового дихроизма комплексов триптофаназы с 3-(2-оксоиндолил)-Ь-аланином и L-аланином имеются характерные полосы хиноидов с максимумом в области 500 нм и плечом при 475-480 нм (рис. 10 а, б). Факторы анизотропии полос поглощения хиноидных интермедиатов, образующихся с р-(2-оксоиндолил)-Ь-аланином и L-аланином, оказались примерно в два раза больше, чем соотвествующие величины, полученные для триптофаназы из Е. coli (табл. 4). В спектре поглощения комплекса триптофаназы с L-метионином преобладающей является хиноидная структура (рис. 11 а). Спектр кругового дихроизма данного комплекса содержит более выраженные три полосы с максимумами при 340, 430 и 505 нм (рис. 11 б). Наличие полосы хиноидного интермедиата позволяет отнести полосы с максимумами при 340 и 430 нм к гем-диамину и внешнему альдимину. Таким образом, взаимодействие триптофаназы с L-метионином приводит к равновесной смеси трех последовательных интермедиатов ферментативной реакции. интенсивности этой полосы (рис. 11 а), при этом положительный круговой дихроизм полосы с тах= 430 нм почти полностью исчезает (рис. 116), что указывает, вероятнее всего, на образование внешнего альдимина (123). Торможение реакции на стадии образования внешнего альдимина происходит также при взаимодействии триптофаназы с Р-фенил-ОЬ-серином. Комплекс триптофаназы с этим ингибитором характеризуется увеличением интенсивности поглощения при 422 нм и смещением максимума к 430 нм (рис. 9 а), а также обращением знака кругового дихроизма в данной полосе (рис. 9 б). Факторы анизотропии полос поглощения кетоенамина триптофаназы с максимумом при 422 нм, а также внешних альдиминов и хиноидных интермедиатов, образующихся с исследованными аминокислотами, отличаются от соотвествующих величин, полученных для триптофаназы из К coli (табл. 4).
Таким образом, микроокружение кофермента в активных центрах триптофаназ из двух различных источников различается не только в холоферменте, но и в фермент-субстратных комплексах. Побочная реакция трансаминирования. Многие пиридоксаль-5 -фосфат-зависимые ферменты, не являющиеся аминотрансферазами, катализируют побочную реакцию трансаминирования (124). В процессе этой реакции после отрыва С-а-протона субстрата из внешнего альдимина вместо нормального каталитического акта происходит протонирование С4 -атома кофермента. В хиноидной структуре как С-а-атом, так и С4 -атом обладают отрицательным зарядом и скорость реакции трансаминирования зависит от распределения отрицательного заряда в промежуточном интермедиате, то есть во многом определяется микроокружением кофермента на стадии образования хиноидного интермедиата (125). Характерными признаками побочного трансаминирования являются инактивация фермента при инкубировании с субстратами или ингибиторами, уменьшение во времени интенсивности полосы поглощения хиноидного интермедиата и появление в спектре комплекса полосы поглощения в области 325-330 нм за счет образования поглощающих в этой области продуктов реакции - пиридоксаминфосфата и кетокислоты. Добавление пиридоксаль-5 фосфата к реакционной смеси приводит к восстановлению активности фермента до начального уровня. В комплексе триптофаназы с L-аланином пик хиноидного интермедиата с максимумом поглощения при 501 нм постепенно снижался в течение нескольких часов, и одновременно появлялся пик поглощения при 325 нм (рис. 12). Эти спектральные изменения сопровождались постепенной инактивацией фермента, составляющей 92 % от исходной величины через 24 часа. При инкубировании триптофаназы с Б-зтил-Ь-цистеином и L-фенилаланином наблюдалась более медленная инактивация фермента - на 20 - 30 % за 24 часа. После инкубирования фермента с L-аланином в течение 24 часов в реакционной смеси были идентифицированы продукты реакции - пиридоксаминфосфат и пируват. Добавление к реакционной смеси избытка пиридоксаль-5 -фосфата приводило к полному восстановлению активности фермента. Скорость побочной реакции трансаминирования L-аланина составила 7,0x10 V1. Для триптофаназы из Е. coli эта величина почти в 2 раза меньше (3,8x10 V1) (126), что подтверждает высказанное выше предположение о наличии различного микроокружения хиноидных интермедиатов триптофаназ из двух различных источников. Для тирозин - фенол-лиазы из Citrobacter intermedins при сравнимых величинах скоростей основных реакций скорость побочной реакции трансаминирования L-аланина выше более чем на порядок (1,53x10"3с"1) (127). Можно предположить, что, несмотря на высокую консервативность пространственной структуры и остатков активных центров триптофаназы из Proteus vulgaris и тирозин - фенол-лиазы из Citrobacter intermedins, микроокружение хиноидных интермедиатов в комплексах этих ферментов с L-аланином должно отличаться. 3. Факторы, определяющие эффективность связывания аминокислот в активном центре триптофаназы. Взаимосвязь между строением аминокислот и эффективностью их связывания с триптофаназой была исследована при изучении ингибирования фермента в реакции с S-o нитрофенил-Ь-цистеином (табл. 5). Анализ зависимости величины -RTlnKi, которая характеризует эффективность связывания аминокислот с ферментом, от параметра гидрофобности боковой цепи аминокислоты я (рис. 13) показал, что общая корреляция между этими величинами отсутствует. Для аминокислот, максимально приближенных по строению к природному субстрату и для соединений, имеющих минимальные стерические параметры бокового радикала (L-аланин, L-серин, L-цистеин, L-аспарагин, L-гистидин, L-триптофан), эффективность связывания хорошо коррелирует с гидрофобностью боковых групп (г = 0,98), а наклон полученной прямой близок к единице (рис. 13). Для аминокислот с разветвленной боковой цепью наблюдается отрицательное отклонение от прямой, что является следствием стерических препятствий в активном центре фермента.
Роль остатка тирозина 72 в механизме действия триптофаназы
В пространственной структуре триптофаназы остаток Туг72 образует водородную связь с молекулой воды, которая связана с одним из атомов кислорода фосфатной группы кофермента. Данный остаток тирозина является консервативным во многих пиридоксаль- 5 -фосфат-зависимых ферментах. При изучении Tyr71Phe мутантной формы тирозин - фенол-лиазы из Citrobacter freundii (53) и Tyr74Phe мутантной формы триптофаназы из Е. coli (54) было установлено, что гомологичные остатки Туг71 и Туг74 необходимы для эффективного связывания пиридоксаль-5 -фосфата в холоферменте и, кроме того, обеспечивают эффективное протекание стадии элиминирования бокового радикала субстрата. Для выяснения роли Туг72 в механизме триптофаназы из Proteus vulgaris нами была исследована Tyr72Phe мутантная форма фермента. Взаимодействие Tyr72Phe мутантной формы фермента с субстратами и ингибиторами. Каталитическая активность мутантной формы фермента в реакции с природным субстратом L-триптофаном уменьшилась более чем на 5 порядков по сравнению с ферментом дикого типа. Замена привела также к значительному снижению скоростей реакций с другими субстратами (табл. 9). Для Tyr72Phe мутантного фермента значения ккат в реакциях с субстратами, содержащими "хорошую" уходящую группу (Б-о-нитрофенил-Ь- цистеин, р-хлор-Ь-аланин) уменьшилась почти на два порядка по сравнению с ферментом дикого типа, значения Км данных аминокислот практически не изменились (табл. 9). Скорости реакций с S-алкил-Ь-цистеинами и Б-бензил-Ь-цистеином уменьшились на 2 - 4 порядка, в то время как величины Км этих аминокислот уменьшились в несколько раз по Спектры поглощения и кругового дихроизма Tyr72Phe мутантной формы фермента приведены на рис. 15 а,б. В спектре поглощения Tyr72Phe мутантной формы положение и форма полосы кетоенамина сходны с таковыми в триптофаназе дикого типа, но полоса поглощения при 340 нм сместилась в коротковолновую область на 20 нм. Такое изменение свойств холофермента мутантной формы может свидетельствовать о том, что в мутантном ферменте произошло изменение конформации таутомера енолимина за счет разрыва водородной связи между атомом азота внутреннего альдимина и 3 -атомом кислорода кофермента.
Вращательным конформерам енолимина соотвествуют полосы поглощения в области 320 нм (130). Фактор анизотропии полосы кетоенамина мутантного фермента (АА/А= 9,0 х 10"4) существенно изменился по сравнению с соответствующей величиной (ДА/А= 25,6 х 10"4) в холоферменте дикого типа. Таким образом, отсутствие цепочки водородных связей между гидроксигруппой остатка Туг72 и одним из атомов кислорода фосфатной группы кофермента приводит к изменению конформации (микроокружения) внутреннего альдимина в мутантной форме. Отсутствие водородной связи между гидроксигруппой остатка Туг72 и фосфатной группой пиридоксаль-5 -фосфата в мутантном ферменте привело к ухудшению сродства к коферменту: константа диссоциации пиридоксаль-5 -фосфата уменьшилась более чем на два порядка по сравнению с ферментом дикого типа и составила 2,6 х 10"4 М. Связанный пиридоксаль-5 -фосфат легко удалялся при диализе препаратов мутантного белка, что подтверждает ухудшение связывания кофактора. Мутантная форма фермента образовывала устойчивые хиноидные интермедиаты с L-аланином, 8-алкил-Ь-цистеинами (рис. 15 а, б), (3-(2-оксоиндолил)-Ь-аланином и L-триптофаном. Величина фактора анизотропии в полосе поглощения хиноида, образуемого мутантным ферментом с L-аланином, оказалась почти в 2 раза больше, чем соответствующая величина в триптофаназе дикого типа (ДА/А= 1,3 х 10"3 для мутантного фермента, А А/А =7,1 х 10"4 для дикого типа). Спектральные данные позволили сделать предположение о различном микроокружении кофермента на стадии образования хиноидного интермедиата в мутантном белке и триптофаназе дикого типа. Для проверки этого предположения мы исследовали скорость побочной реакции трансаминирования L-аланина для мутантного фермента. Tyr72Phe мутантный фермент катализировал побочную реакцию трансаминирования L-аланина со скоростью, более чем на порядок меньшей, чем фермент дикого типа (ккат = 4,5 х 10"6 с 1). Полученные данные также дают возможность предположить, что конформация (микроокружение) хиноидного интермедиата в мутантном ферменте может отличаться от таковой в ферменте дикого типа. При взаимодействии триптофаназы дикого типа с Б-этил -цистеином в спектре поглощения отсутствует максимум, характерный для хиноида, так как образование и распад хиноидного интермедиата происходят очень быстро. Стабильность хиноидных интермедиатов, образуемых мутантной формой фермента с Б-алкил -цистеинами, объясняется, вероятно, низкими значениями скоростей реакций с данными субстратами на стадиях, следующих за образованием хиноидного интермедиата. Таким образом, замена остатка Туг72 на фенилаланин не оказала существенного влияния на стадию отрыва С-а-протона реакции а,(3-элиминирования. Для аминокислот, имеющих "хорошую" уходящую группу, скорости реакции снизились не так значительно, как для других субстратов, наибольшее влияние замена оказала на скорость реакции с L-триптофаном. Полученные результаты позволили сделать предположение, что в мутантном ферменте торможение реакции а,Р-элиминирования происходит на одной из стадий, следующих за отрывом С-а-протона, что связано с возможным участием остатка Туг72 в протонировании уходящей группы субстрата.
В тирозин - фенол-лиазе гомологичный остаток Туг71 является кислотной группой, осуществляющей протонирование С1-атома фенольного фрагмента субстрата на стадии отрыва бокового радикала (53). На основании полученных нами данных было сделано прежположение, что остаток Туг72 в триптофаназе также может выполнять роль кислотного катализатора на стадии элиминирования индола, протонируя СЗ-атом L- триптофана. Это предположение согласуется с рентгеноструктурными данными для комплекса триптофаназы из Proteus vulgaris с Р-(2-оксоиндолил)-Ь-аланином, в котором гидроксигруппа остатка Туг72 расположена на расстоянии водородной связи от СЗ-атома аналога L-триптофана (М. Исупов, неопубликованные данные). Ввиду того, что мутантная форма фермента имеет очень низкие скорости реакций не только с природным субстратом, но и с S-замещенными L-цистеинами, можно предположить, что гидроксигруппа остатка Туг72 отдает протон и уходящей тиоловой группе в реакциях с этими субстратами. 6. Роль остатков аспарагиновой кислоты 133 и гистидина 458 в механизме действия триптофаназы. Остатки Aspl33 и His458 являются консервативными в аминокислотных последовательностях триптофаназ из различных источников. Остаток Asp 133 структурно соответствует остатку Thrl24 тирозин - фенол-лиазы, остаток His458 остаткам Phe448 в тирозин - фенол-лиазе и His463 в триптофаназе из Е. coli. Ранее было установлено, что остатки Thrl24 и Phe448 тирозин - фенол-лиазы и остаток His463 триптофаназы из Е. coli являются существенными для субстратной специфичности каждого из ферментов (54, 58). Для выяснения роли остатков Asp 133 и His458 в связывании субстратов и катализе нами были получены в гомогенном состоянии и исследованы мутантные формы триптофаназы с заменами Aspl33 и His458 на аланин. Каталитические свойства His458Ala и Aspl33Ala мутантных форм фермента. Кинетические исследования His458Ala мутантной формы триптофаназы показали, что замена остатка His458 оказала наиболее значительное влияние на каталитические параметры реакции а,3-элиминирования L-триптофана. Скорость реакции с L-триптофаном для мутантной формы фермента уменьшилась в 57 раз, величина Км увеличилась в 4 раза, значение параметра ккаі/Км снизилось более чем на 2 порядка по сравнению с ферментом дикого типа (табл. 9). Скорость разложения S-o-нитрофенил-Ь -цистеина и величина Км для этой аминокислоты практически не изменились. Для L-серина величина ккаТуменьшилась в 1,4 раза, Км - в 6,5 раз.
Определение активности ферментов
Удельную активность ферментов определяли с использованием синтетического субстрата 8-(о-нитрофенил)-Ь-цистеина. 8-(о-нитрофенил)-Ь-цистеин синтезировали по описанной ранее методике (137). За скоростью реакции следили по снижению оптической плотности при 370 нм, используя коэффициент молярного поглощения Б-(о-нитрофенил)-Ь-цистеина є = 1860 М см"1 (138). Измерения проводили при 30 С в 0,1 М калий-фосфатном буфере, рН 7,8, содержавшем 0,1 мМ пиридоксаль-5 -фосфата. За единицу активности триптофаназы принимали количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль 8-(о-нитрофенил)-Ь-цистеина в минуту. 4. Определение чистоты выделенных ферментов. Чистоту полученных препаратов проверяли при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия по методу Лэммли (139). В качестве стандарта использовали смесь белков с изветным молекулярным весом фирмы "Sigma". 5. Кинетические исследования. Определение кинетических параметров реакции а,р-элиминирования S-(o-нитрофенил)-Ь-цистеина проводили при 30 С, следя за уменьшением оптической плотности при 370 нм ( є = 1860 М см"1) (138) в 0,1 М калий-фосфатном буфере, рН 7,8, содержавшем 0,1 мМ пиридоксаль-5 -фосфата и различные концентрации S-(o-нитрофенил)-Ь-цистеина. Реакция инициировалась добавлением триптофаназы. Определение кинетических параметров реакции а,Р-элиминирования других субстратов проводили при помощи метода, основанного на скорости превращения пирувата, образующегося в результате исследуемой реакции, в лактат в результате взаимодействия с NADH под действием лактатдегидрогеназы. Измерения проводили при 30 С, следя за снижением оптической плотности NADH при 340 нм (є = 6220 NT CM"1) (140). Реакционные смеси содержали 0,1 М калий-фосфатный буфер, рН 7,8, 0,1 мМ пиридоксаль-5 -фосфата, 0,2 мМ NADH, 8 единиц лактатдегидрогеназы и варьируемые количества субстратов. Скорость реакции а,(3-элиминирования L-триптофана определяли также по количеству образовавшегося в реакции индола (141). Исследование рН-зависимости кинетических параметров реакций сс,Р-элиминирования L-триптофана и 8-этил -цистеина проводили с использованием следующих буферов: 2-(М-морфолино)этансульфоновая кислота (рН 5,5 - 6,5); КН2РО4 + К2НРО4 (рН 6,5 - 7,5); К-2-гидроксиэтилпиперазин-№-2-этансульфоновая кислота (рН 7,0 -8,0); 1,3-бис[трис(гидроксиметил)-метиламино]пропан (рН 8,0 - 9,0); 2-(циклогексиламино)этансульфоновая кислота (9,0 - 10,0). Все буферные системы содержали 0,1 М КС1. Исследование ингибирования трипофаназы различными аминокислотами проводили с использованием в качестве субстратов L-триптофана и 8-(о-нитрофенил) -цистеина при вышеописанных условиях, варьируя концентрации субстратов и ингибиторов.
Кинетику изотопного обмена С-а-протона аминокислот триптофаназой дикого типа и мутантными ферментами исследовали в 0,1 М калий-фосфатном буфере в D2O в присутствии 0,1 мМ пиридоксаль-5 -фосфата. Буферный раствор имел рН=7,4, что соответствовало pD=7,8 (142). К 5 мл буферного раствора, содержащего аминокислоту в концентрации, равной 5 х Kj, добавляли триптофаназу, смесь инкубировали при 30 С. В зависимости от скорости изотопного обмена количество добавляемой в систему триптофаназы составляло 1 - 5 мг. Из реакционной смеси отбирали пробы через определенные промежутки времени и анализировали их методом ПМР, предварительно инактивировав фермент путем нагревания до 90 С в течение 5 минут. Спектры ПМР снимали на приборе Brucker АМХШ-400 (400 МГц). Соотношение дейтерированного и недейтерированного продукта определяли, исходя из соотношения интегральных інтенсивностей сигналов С-сс-протона и протонов СНг-гругшы, не подвергающихся обмену и принятых за внутренний стандарт. Принимая значение Км равным К; для конкурентного ингибирования аминокислотой реакции с L-триптофаном или с 8-(о-нитрофенил)-Ь-цистеином и определив соотношение [S]o/([S]o-[P]) из спектра ПМР, скорость дейтерообмена рассчитывали из интегральной зависимости степени превращения субстрата от времени с учетом ингибирования продуктом (143) с использованием уравнения: .. KM + [S]0 [S]Q Vmax" t [S]0-[P] где [S]o - концентрация ингибитора, [P] - концентрация продукта, t - время инкубации. Параметры стационарной кинетики - константу Михаэлиса (КМ) и константу скорости (ккат) - определяли, применяя программу нелинейных квадратов Enzfitter (Elsevier Biosoft) (144), с использованием уравнения Михаэлиса-Ментен: kKar[E]0[S] Км + [S] где [S]- концентрация субстрата, [Е]о -концентрация фермента. Значения констант ингибирования (Kj) определяли, применяя программу Enzfitter (Elsevier Biosoft) (144), с использованием уравнения: Vmax[S] v = КІ KJW- YMS] где [I]- концентрация ингибитора. Расчет кинетических изотопных эффектов проводили с использованием программы Enzfitter (Elsevier Biosoft) (144) по уравнению: v = Vmax[S]/{KM(l+ DVKI)+[S](1+VI)}, где УК1=\7К(изотопный эффект)-1, УГ=У(изотопный эффект)-1, D - содержание дейтерия. Зависимость каталитических параметров реакции а,Р-элиминирования L-триптофана и Б-этил-Ь-цистеина от рН анализировали с использованием программ, разработанных Клеландом (144), по уравнениям: log V = logC/(l+[H+]/K1) log V = log C/(l н-рҐІ/Кі+ЕІҐі /КіКа), где Ki и Кг - константы диссоциации групп фермента, Y-величина параметра (Vmax и Kj), наблюдавшегося при вариации рН, С - рН-независимая величина параметра. Скорость реакции побочного трансаминирования L-аланина определяли по уменьшению интенсивности пика хиноидного интеремедиата (XmaX = 501 нм) во времени, обрабатывая данные при помощи уравнения Михаэлиса-Ментен. 6. Спектральные исследования ферментов. Спектры поглощения холоферментов и комплексов холоферментов с ингибиторами снимали на спектрофотометре Сагу-50 фирмы "Varian". Спектры кругового дихроизма снимали на дихрографе Mark Ш фирмы "Yobin-Yvon". Измерения проводили в 0,1 М калий-фосфатном буфере, рН 7,8. Концентрации ферментов составляли 1-2 мг/мл. Концентрации ингибиторов в пробах имели значения, на один порядок превышающие величины КІ для исследуемых аминокислот.
Перед снятием спектров белковые препараты инкубировали с 50-кратным молярным избытком пиридоксаль-5 -фосфата при 30 С в течение 30 минут. Избыток пиридоксаль-5 -фосфата удаляли при помощи диализа. Определение концентрации пиридоксаль-5 -фосфата в препаратах ферментов определяли в 0,1 М NaOH по методу Петерсона и Собера (145), используя значение молярного коэффициента поглощения пиридоксаль-5 -фосфата є = 6600 М см"1 при 390 нм. 7. Получение апофермента. Для получения апофермента к раствору белка в 0,1 М калий-фосфатном буфере, рН 7,0 добавляли 100-кратный молярный избыток DL-пеницилламина, который связывается с пиридоксаль-5 -фосфатом, замещая є-аминогруппу кофермента и образуя альдимин (146) Раствор инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа, затем диализовали при +4 С против буфера того же состава. Активность апофермента в отсутствие пиридоксаль-5 -фосфата составляла не более 2 % от активности фермента в присутствии пиридоксаль-5 -фосфата.
8. Определение константы диссоциации пиридоксаль-5-фосфата. Определение константы диссоциации пиридоксаль-5 -фосфата проводили методом спектрофотометрического титрования. К раствору апофермента (0,2 - 0,3 мг/мл) в 0,1 М калий-фосфатном буфере, рН 7,8 добавляли кратные количества раствора пиридоксаль-5 -фосфата. После 30 минут инкубации при 30 С регистрировали юменения в спектрах поглощения при 425 нм. Количество связанного с ферментом кофермента определяли, используя молярный коэффициент поглощения кетоенамина (є = 10680 М -см"1 для Arg226Ala мутантного фермента, є = 10580 ІУГ -см"1 для фермента дикого типа), который был рассчитан из спектров холофермента с известным содержанием пиридоксаль-5 -фосфата. Параметры связывания рассчитывали с помощью построения графика в координатах Скэтчарда (147). Константу диссоциации пиридоксаль-5 -фосфата для Tyr72Phe мутантного фермента определяли с использованием метода ультрафильтрации (148). К раствору апофермента (1 мг/мл) в 0,1 М калий-фосфатном буфере, рН 7,0 добавляли аликвоты пиридоксаль-5 - фосфата. Смесь инкубировали при 30 С в течение 1 часа, затем помещали в микроконцентратор Centricon-30 фирмы "Amicon" и центрифугировали при 5000 об/мин при комнатной температуре в течение 5 мин. Определеляли концентрацию пиридоксаль-5 - фосфата в фильтрате и в белковой смеси. За свободный пиридоксаль-5 -фосфат принимали концентрацию пиридоксаль-5 -фосфата в фильтрате. Параметры связывания рассчитывали с помощью построения графика в координатах Скэтчарда (147).
