Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Бактериальные токсины 8
1. 1.1. Стафилококковый энтеротоксин В 10
1. 1.2. Дифтерийный токсин 15
1.1.3. Столбнячный токсин 20
1. 1.4. Сибиреязвенный токсин 21
1.2. Растительные токсины 25
1.2. 1 .Рицин 25
1.2.2. Вискумин 31
1.3. Методы обнаружения биотоксинов в окружающей среде 32
1. 4. Белковые микрочипы 33
1.4.1. Двумерные белковые микрочипы для обнаружения биотоксинов 34
1.4. 2. Белковые микрочипы на основе гидрогелей 35
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 39
2. 1. Белковые микрочипы 41
2. 2. Белковый гидрогелевый микрочип для обнаружения биотоксинов 44
2. 3. Регистрация результатов иммуноанализа 47
2.4. Исследование процессов, проходящих в объеме гелевой
ячейки 47
Различные варианты иммуноанализа анатоксина рицина, проводимые на микрочипе 50
Иммуноанализ анатоксинов: вискумина, стафилококкового энтеротоксина В, столбнячного токсина, дифтерийного токсина и летального фактора сибиреязвенного токсина 54
Прямой анализ анатоксина стафилококкового энтеротоксина В
с масс-спектрометрической регистрацией сигнала 56
2. 8. Параллельный анализ нескольких анатоксинов на микрочипах 57
2. 9. Стабильность микрочипов с иммобилизованными антителами 60
2.10. Гликопротеиновый микрочип 61
2.10.1. Выбор способа иммобилизации углеводов в гелевом
элементе микрочипа 61
2.10.2. Комбинированный гликопротеиновый микрочип для определения
анатоксинов, обладающих углеводсвязывающей активностью (на примере
анатоксина рицина) 66
Оптимизация условий для проведения иммуноанализа на гелевых белковых микрочипах на примере прямого анализа анатоксина рицина 69
Определение констант ассоциации (Kass) бинарного комплекса флуоресцентно меченного анатоксина с иммобилизованными на микрочипе моноклональными антителами 72
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 74
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 76
Приборы и реактивы 76
Получение анатоксинов и моноклональных антител против токсинов....77
Получение моноклональных антител против трисахаридов
групп крови 78
Изготовление белковых микрочипов 78
Методика получения конъюгатов антител с биотином 79
Методика получения конъюгатов антител с пероксидазой хрена 79
Окрашивание белков флуоресцентными красителями СуЗ/Су5 80
Методики проведение анализов на микрочипах 80
Флуоресцентные и хемилюминесцентные измерения 80
Кинетические измерения на микрочипах 81
MALDI-TOF масс- спектральный анализ на микрочипе 82
Иммуноанализ анатоксинов на белковых микрочипах 83
Прямой иммуноанализ анатоксинов на микрочипах 83
Конкурентный иммуноанализ на микрочипах (анатоксин рицина) 84
Сэндвич- иммуноанализ анатоксинов 84
Одновременный анализ нескольких анатоксинов на
микрочипах 86
3.8.9. Определение констант ассоциации (Kass) бинарного комплекса
флуоресцентно меченного анатоксина с иммобилизованными на микрочипе
моноклональными антителами 86
3.9. Исследование при помощи флуоресцентного сканирующего
конфокального микроскопа проникновения белков с различной молекулярной
массой в гелевый элемент микрочипа (на примере прямого и сэндвич- анализа
анатоксина рицина) 88
Определение степени иммобилизации белков (антител и анатоксинов) и сахаридов в геле 89
Гликочипы, содержащие иммобилизованные неогликоконъюгаты и спейсерированные трисахариди 89
Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) культуральной жидкости, содержащей антитела против трисахарида А (А16) на 96-луночном планшете 90
Анализ сыворотки третьей группы крови на гликочипах, содержащих иммобилизованный трисахарид А в спейсерированной форме 91
Комбинированный гликопротеиновый микрочип для определения анатоксинов, обладающих углеводсвязывающей активностью (на примере
анатоксина рицина) 91
ВЫВОДЫ 93
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 94
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ITs- иммунотоксины
RTB - лектиновая субъединица рицина, цепь -В
RTA- токсическая субъединица рицина, цепь -А
RCA (R120) - агглютинин рицина
RIPs- рибосом - инактивирующий белок
LD 50 - летальная доза токсина (50% исследуемой популяции животных погибала)
ED 50- эффективная доза (концентрация токсина, при которой у 50% людей
наблюдались симптомы отравления)
SEB - стафилококковый энетротоксин В
TSST-1 - токсин синдрома токсического шока
ELISA - иммуноферментный анализ
ПЦР - полимеразно - цепная реакция
EF-2 - фактор элонгации 2
NAD- никотинамид динуклеотид
ЭР - эндоплазматический ретикулум
PBS - фосфатно-солевой буфер (0,01 М, 0,15 М NaCl, рН 7,2)
PBSt - фосфатно-солевой буфер, содержащий Tween 80 (0.1%)
BSA - бычий сывороточный альбумин
PVA - поливиниловый спирт
PVP - поливинил - пирролидон
R60- рицин
HRP - пероксидаза хрена
LF - летальный фактор сибиреязвенного токсина
DFT - дифтерийный токсин
Atri - Gal NAca 1—3Ga!pl->(CH2)2-NH2
І Fucal
Btri - Gal a 1— 3Gaipi—(CH2)2-NH2 2 t Fucal
Bind Silan - (З-метоксисиллил)пропилметакрилат АР - щелочная фосфатаза
Введение к работе
Разнообразные природные токсины представляют серьезную угрозу здоровью человека. В настоящее время хорошо известны многие бактериальные, растительные и животные токсины, обладающие сильным токсическим действием на человеческий организм. К наиболее сильным относятся бактериальные токсины (ботулинический и столбнячный токсины, токсины золотистого стафилококка), токсины растительного происхождения (рицин, вискумин, токсины сине-зеленых водорослей), микотоксины и пр. Эти токсины могут попадать в организм не только в результате инфицирования, но и с пищей, водой, а также воздушно-капельным путем. Поэтому большое значение в настоящее время имеет разработка быстрых и чувствительных методов определения токсинов для проведения клинических анализов, проверки пищевых продуктов, экологического мониторинга.
Для идентификации и анализа, как самих токсинов, так и организмов, которые их вырабатывают, в настоящее время используются различные лабораторные методы, включающие тесты на животных, микробиологические методы, анализ ДНК с использованием ПЦР, иммунологические методы: радиоиммунологический, иммунофлуоресцентный и иммуноферментный анализы. Одним из чувствительных, быстрых и удобных методов анализа токсинов является твердофазный иммуноанализ. При разработке иммуноанализа токсинов используют антитела, специфичные к токсинам, а в качестве антигена, как правило, используют анатоксины, которые являются инактивированными токсинами.
К недостаткам традиционных иммунологических методов относится невозможность одновременно тестировать образец на наличие нескольких биологически активных соединений. Эта проблема решается в случае проведения анализа на белковых гидрогелевых микрочипах, разработанных в данной диссертации, которые позволяют обнаружить присутствие нескольких анатоксинов в анализируемом образце. Для создания белковых микрочипов и оптимизации методов иммуноанализа биотоксинов были использованы антитела и анатоксины, любезно предоставленные коллегами из Института Биоорганической Химии им. Ю. А. Овчинникова и М. М. Шемякина (В. А. Несмеянов).
Технология гидрогелевых олигонуклеотидных микрочипов была разработана в ИМБ РАН под руководством академика А.Д. Мирзабекова и совершенствуется по настоящее время. Белковый гидрогелевый микрочип представляет собой матрицу
индивидуальных гелевых ячеек на поверхности стекла, содержащих различные ковалентно иммобилизованные зонды (антитела, антигены).
Микрочип для одновременного определения нескольких анатоксинов позволит значительно увеличить эффективность анализа, ускорить и миниатюризировать проведение исследований и может найти применение в клинической и лабораторной практике.
