Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Происхождение и эволюция домашних свиней 15
1.1.1. Систематика свиней 15
1.1.2. Дикий кабан 16
1.1.3. Домашние свиньи 17
1.2. Исследованные в работе популяции домашних свиней 19
1.2.1. Из истории создания отечественных мини-свиней 19
1.3. Использование иммуногенетических показателей крови в качестве генетических маркеров 22
1.3.1. Иммуногенетические системы сывороточных аллотипов свиньи 25
1.3.2. Общие сведения о строении, функции, классах и биосинтезе липопротеииов сыворотки крови 25
1.3.3. Структура и функции а-макроглобулинов 27
1.3.4. Иммуногенетическая система аллотипов сывороточных иммуноглобулинов 30
1.4. Картирование генома свиньи 31
1.4.1. Генетическая карта свиньи 33
1.5. Ретровирусы. Общая характеристика ретровирусов 34
1.5.1. Эндогенные ретровирусы свиней (PERV) и проблемы ксенотрансплантации 36
1.5.2. Молекулярная характеристика PERV 37
1.5.3. Филогенетический анализ PERV 39
1.5.4. Разработка диагностических методов для контроля за экспрессией и передачей PERV 43
1.5.5. Экспрессия и выделение PERV клетками свиньи 46
1.5.6. Тропизм PERV к клеткам человека 49
1.7. Ретроспективные исследования на больных, при лечении которых использовали биологический трансплантационный материал от свиньи 52
1.5.8. Использование некоторых видов мелких животных в качестве биологической модели 54
1.5.9. Использование приматов в качестве модели 55
1.5.10. Патогенный потенциал PERV 56
1.11. Данные о картировании и локализации PERV 60
2. Материалы и методы исследований
2.1. Материалы исследований
2.1.1. Характеристика исследуемых животных 62
2.1.2. Получение и хранение биологического материала 65
2.1.3. Характеристика аллоантисывороток 67
2.2. Методы исследований
2.2.1. Выделение ДНК 67
2.2.2. Праймеры 68
2.2.3. ПЦР-анализ 71
2.2.4. Определение аллотипов сывороточных белков 72
2.3. Статистическая обработка результатов 78
2.4. Компьютерные базы данных 79
3. Результаты
3.1. Генотипирование PERV разных популяций домашних свиней и диких кабанов 81
3.1.1. Наличие PERV разных типов в популяциях домашних свиней и диких кабанов 81
3.1. 2. Влияние генотипа и среды на частоту носителей различных типов PERV у диких кабанов и домашних свиней 84
3.1.3. Попарное сравнение выборок по частотам носителей различных типов PERV 90
3.1.4. Отцовский и материнский эффект на частоту PERV у потомков 92
3.2. Иммуногенетическое изучение полиморфизма сывороточных белков у домашних свиней и диких кабанов 95
3.2.1. Иммуногенетический анализ среднеазиатского дикого кабана 98
3.3. Изучение ассоциаций различных типов PERV с аллотипами сыворотки крови и полом животных в популяциях домашних свиней и диких кабанов 100
3.4. Изучение ассоциаций между наличием различных типов PERV в геномах домашних свиней и диких кабанов 105
4. Обсуждение результатов
4.1. PERV разных типов в популяциях домашних свиней и диких кабанов 107
4.2. Разнообразие популяций диких и домашних свиней по комплексу аллотипов сыворотки крови 121
4.3. Ассоциации PERV разных типов с генетическими маркерами в популяциях домашних и диких свиней 123
Выводы 128
- Исследованные в работе популяции домашних свиней
- Ретроспективные исследования на больных, при лечении которых использовали биологический трансплантационный материал от свиньи
- Статистическая обработка результатов
- Изучение ассоциаций различных типов PERV с аллотипами сыворотки крови и полом животных в популяциях домашних свиней и диких кабанов
Введение к работе
Актуальность проблемы
Ретровирусы - вирусы с необычным способом репликации генетического материала. Для цикла репродукции этого большого семейства вирусов характерен обратный поток генетической информации: вместо обычной транскрипции ДНК в РНК, как это происходит в клетке, их геномная РНК транскрибируется в ДНК. Эта особенность репродукции ретровирусов отражена в названии: «ретро», что значит «обратный». Следующая за обратной транскрипцией стадия интеграции ДНК-копии в геном хозяина необходима для размножения нового поколения ретровируса (Temin, Mizutani, 1970). В геноме человека выявлены многочисленные повторяющиеся элементы, которые напоминают интегрированную форму инфекционных ретровирусов, которые получили название эндогенных ретровирусов человека. Предполагается, что эндогенные ретровирусы являются латентной «молчащей» формой экзогенных вирусов. В то же время эндогенные ретровирусы способны активироваться и продуцировать инфекционные частицы, индуцируя болезнь (Petropoulos, 1997; Vobis et al., 2003). Члены семейства ретровирусов вызывают ряд тяжелых заболеваний животных и человека. К наиболее изученным ретровирусам относятся вирусы лейкемии птиц, мышей, кошек и приматов, а также вирусы иммунодефицита кошек, обезьян и человека (Coffin, 1996).
В последнее время, все большую остроту приобретает проблема исследования взаимодействия генома ретровируса с геномом человека. Развитие современной науки предполагает использование ретровирусов в качестве молекулярного инструмента для генотерапии, адресной доставки биорегуляторов, создание вакцин нового поколения. Изучение ретровирусов оказало больше влияние на разные области биологии и медицины, на молекулярную генетику, на изучение контроля за ростом клетки и канцерогенеза, а так же на биотехнологию (Temin, 1992). Способность
8 ретровирусных векторов осуществлять перенос генов только в делящиеся клетки была использована при развитии методов генотерапии аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит и рассеянный склероз (Кристофер, 2001). Ретровирусные системы переноса и экспрессии генов являются удобным и эффективным инструментом исследования во многих фундаментальных областях биологической науки. Уже сейчас они с успехом применяются для развития совершенно новых подходов к лечению наследственных, онкологических и некоторых вирусных заболеваний, составляющих основу нового направления биомедицины - генной терапии (Прасолов, Иванов, 2000).
Присутствие в геномах млекопитающих множества эндогенных ретровирусов ставит серьезные проблемы перед медициной. Одним из возможных негативных последствий искусственного ретровирусного заражения может быть нарушение взаимоотношений организма с эндогенными ретровирусами, неконтролируемая активация последних или возникновение патогенных рекомбинантов. Вопросы безопасности, связанные с наличием эндогенных реторвирусов, приобретают особую остроту для ксенотрансплантации, при которой органы животного пересаживают человеку (Patience et al., 1997; Кристофер, 2001; Lee et al., 2002; Айтназаров, 2003; Scobie et al., 2004; Niebert, Tonjes, 2005).
Из-за дефицита донорских органов в нашей стране лишь около 30% пациентов из сниска ожидания доживают до трансплантации. В развитых странах летальные цифры укладываются примерно в 10%. В США ежегодно получают около 20 тыс. донорских органов. В России доноры обеспечивают менее 10% необходимого количества органов для пересадки. В России развитие клинической трансплантологии сопряжено со значительными трудностями. Одной из таких трудностей является недостаточное количество трансплантационных центров, их неравномерное расположение на территории Российской Федерации. Другая трудность - неготовность к констатации смерти человека на основании диагноза смерти мозга из-за
9 низкой технической оснащенности реанимационных отделений интенсивной терапии, поскольку отсутствует необходимая диагностическая аппаратура. Существуют также этические проблемы, связанные с констатацией смерти человека по критериям смерти мозга.
Длительное время отсутствовало правовое регулирование в данной области, в том числе в отношении заготовки донорских органов. Ее правовая база была заложена в России лишь в 1992 г. с принятием Закона Российской Федерации "О трансплантации органов и (или) тканей человека" от 22.12.1992 г.
Существуют три основных пути решения проблемы нехватки органов для пересадки: 1) создание качественных искусственных органов длительного действия, 2) ксенотраисплантация (пересадка человеку органов животных) и 3) клонирование органов, предназначенных для трансплантации (Шумаков и др. 1995).
Одним из преимуществ ксенотрансплантацій перед аллотрансплантацией (внутривидовая пересадка органов и тканей) является возможность более детального обследования донора, так как многие инфекции передаются при гемотрансфузии и аллотрансплантации: вирусы иммунодефицита человека, гепатита В и С, герпеса, а также туберкулез; всего этого можно избежать при использовании ксеногенных тканей (Weiss, 1999). При проведении манипуляций с органами и тканями животных необходимо тщательное обследование животного-донора, чтобы избежать риска возникновения вирусной инфекции. Более того, при ксенотрансплантации искусственно создаются условия, которые не могли возникнуть в природе. Поэтому нельзя исключить вероятности рекомбинации близкородственных вирусов человека и животного и адаптации к организму человека вирусов, репродуцирующихся в организме животных (Fox, 1997; Brown et al., 1998). Развитие этого направления медицины ставит новые задачи перед селекционерами, биотехнологами и ветеринарами.
Ксенотрансплантація органов от свиньи человеку связана с
потенциальной опасностью заражения реципиента эндогенными
ретровирусами (porcine endogenous retrovirus PERV), которые являются составной частью генома свиньи. Показано, что PERV способны инфицировать клетки человека in vitro (Martin et al., 1998). Внедренный эндогенный ретровирус навсегда остается в составе ДНК клеток хозяина и превращается в новый генетический элемент его генома (Wilson et al., 2000; Wood et al., 2004). Были выделены три типа ретровирусов PERV (А, В и С), которые различаются по последовательности нуклеотидов гена env и своим биологическим свойствам (Takeuchi et al., 1998).
Находясь в латентной форме, ретровирусы, тем не менее, с некой вероятностью, могут вызывать заболевания у человека, в том числе, онкологические, если они активируются при пересадке органа от животного-донора (Шумаков, 1995). Кроме того, существует опасность активации эндогенных ретровирусов животного в клетках человека и появление нового типа вируса за счет рекомбинаций эндогенных ретровирусов животного и человека (Свердлов, 1999). Эндогенный ретровирус свиней, передающийся при межвидовой трансплантации, может являться причиной эпидемий, подобных эпидемии СПИДа.
Свинья является главным претендентом на роль донора органов при ксенотрансплантации, так как ее органы более всего сходны с человеческими по размеру и физиологическим параметрам. Для таких целей в настоящее время за рубежом созданы и используются специальные породы лабораторных свиней (геттингентские мини-свиньи, юкатанские мини-свиниьи и т.д.).
В Институте цитологии и генетики СО РАН создано и широко использовалось для многих медико-биологических исследований стадо первых отечественных лабораторных миниатюрных свиней «Минисибс» (Тихонов, 2000).
Сибирские мини-свиньи апробированы в ряде медицинских и биологических институтов Сибири для моделирования атеросклероза, механизма взаимодействия гетерогенных тканей в плаценте, патогенеза язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, влияния стресса при трансплантации кожи и сосудов (Тихонов, 1990; Горелов и др., 2001).
Впервые сердечные клапаны мини-свиней для пересадки человеку были использованы в Кемеровском кардиологическом центре (Тихонов, 2000; Горелов и др., 2001). Несколько лет успешного использования клапанов свиных сердец в качестве биопротезов показали, что в отличие от зарубежных аналогов, они гораздо дешевле и более надежны. В Институте патологии кровообращения им. Мешалкина МЗ РФ проводятся исследования по трансплантации сердца, клапанов, кровеносных сосудов и других тканей у мини-свиней. В Новосибирском научно-исследовательском институте травматологии и ортопедии МЗ РФ на мини-свиньях ведутся исследования по коррекции сколиоза.
Перечисленные проблемы обусловливают актуальность изучения эндогенных ретровирусов PERV типов А, В и С у лабораторных мини-свиней, созданных для медико-биологических исследований в ИЦиГ СО РАН, а также у некоторых родоначальных пород домашних свиней и диких кабанов. Цель и задачи исследования
Целью исследования является выявление эндогенных ретровирусов типов А, В и С в геномах лабораторных мини-свиней и их некоторых родоначальных пород, а также изучение факторов, влияющих на частоту встречаемости PERV. В задачи исследования входило:
1. Изучить частоту встречаемости эндогенных ретровирусов разных типов у нескольких пород домашних свиней и диких кабанов.
Оценить влияния средовых (условия содержания и обитания) и генетических факторов (породы и подвиды) на наличие разных типов ретровирусов в геноме домашних и диких свиней.
Провести анализ ассоциаций различных типов эндогенных ретровирусов между собой и традиционными генетическими маркерами, использовавшимися при селекции свиней.
Научная новизна и практическая ценность
Впервые изучена порода лабораторных сибирских мини-свиней на наличие эндогенных ретровирусов PERV типов А, В, С. Показано, что эндогенные ретровирусы типа А, В и С широко распространены у лабораторных миниатюрных свиней. Обогащенность геномов животных этой породы ретровирусами, вероятно, обусловлена внесением их от пород-основателей. В то же время среди пород-основателей (диких и домашних свиней) имеются животные, свободные от некоторых типов эндогенных ретровирусов. Поскольку существует опасность активации эндогенных ретровирусов свиней при ксенотрансплантации, необходимо учитывать, что частота встречаемости эндогенных ретровирусов в некоторых выборках домашних и диких свиней существенна. На наличие эндогенных ретровирусов разных типов в популяциях свиней оказывает влияние не только порода (подвид), но и условия содержания (обитания). При селекции и разведении свиней для медико-биологических исследований необходимо строгое соблюдение зоогигиенических норм. В ходе работы выявлены ассоциации эндогенных ретровирусов свиней с разными генетическими маркерами и полом животного, которые могут быть использованы в дальнейших научных исследованиях и при селекции. Положения, выносимые на защиту
1. Изучение влияния генотипа (породы и подвиды животных) на уровень встречаемости у свиней эндогенных ретровирусов PERV показало статистически значимые различия частот носителей различных типов ретровируса (А, В и С) как внутри популяций одной породы, так и между
различными породами, а также у диких кабанов Южной Украины и Средней Азии.
Метод однофакторного дисперсионного анализа, кластеризация методом двух главных компонент и семейный анализ пометов свиньи крупной белой породы, показали достоверное влияние факторов среды {условия содержания и обитания) на частоту носителей PERV в популяциях домашних и диких свиней.
Выявлены ассоциации ретровируса PERV типа А с локусами эритроцитарных антигенов ЕЛЕ, ЕАК, липопротеином LPB к полом животных, а также ассоциации ретровируса PERV типа В с локусами аЫ, ЕЛЕ и LPB у разных подвидов диких кабанов и домашних пород свиней. Показана ассоциация между PERV типов А и В у некоторых пород свиней.
Высказана гипотеза о возможности, кроме вертикальной передачи эндогенных ретровирусов свиней всех трех типов по наследству от родителей потомкам, горизонтальной передачи от особи к особи, при которой PERV могут выступать в качестве инфекционного вируса. Апробация работы
Материалы исследования были представлены на XII Международной
конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии,
фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, 2004); на международном
конгрессе "Progress in Fundamental and Applied Sciences for Human Health"
(Ukraine, 2004); на международной научно-практической конференции
молодых ученых СО РАСХН «Новейшие направления развития аграрной
науки в работах молодых учёных» (Новосибирск, 2004); на Сибирском
международном ветеринарном конгрессе «Актуальные вопросы
ветеринарной медицины» (Новосибирск, 2005); на отчетной конференции «Динамика генофондов растений, животных и человека» (Москва, 2005); на отчетной сессии ИЦиГ СО РАН (Новосибирск, 2006). Публикации По теме диссертации опубликовано 11 работ.
14 Структура и объем диссертации
Диссертация содержит 158 страницы машинописного текста, иллюстрирована 23 таблицами и 17 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы. Указатель литературы содержит 256 работ, из которых 159 зарубежных авторов. Благодарности
Автор выражает сердечную признательность безвременно ушедшему первому научному руководителю к.с.-х.н. И,Г. Горелову, заложившему основы данной работы. Глубокую и искреннюю признательность автор выражает зав. лабораторией молекулярных основ генетики животных ИЦиГ СО РАН к.б.н. А. Г. Ромащенко за помощь и поддержку на всех этапах работы, а также соавторам опубликованных работ: к.б.н. М.А. Савиной, В.Ф. Кобзеву (ИЦиГ СО РАН); к.б.н. СП. Князеву (НГАУ), д.с.-х.н. В.А. Бекеневу, к.с.-х.н. Г.М. Гончаренко, кх.-х.н. А.А. Заболотиой (СибНИПТИЖ СО РАСХН); к.б.н. В.Д. Афонюшкину (ИЭВСиДВ СО РАСХН). Автор признателен к.б.н. СВ. Никитину и к.б.н. А.В. Кириченко за помощь в проведении статистической обработки данных. Автор приносит благодарность сотруднику Института патологии кровообращения им. акад. Мешалкина проф. д.м.н. П.М. Ларионову за помощь при обсуждении медицинских аспектов диссертационной работы. Автор искреннее благодарит проф. д.в.н. Жунушева А.Т и проф. д.б.н. Захарова И.К. за предоставленную возможность целевой подготовки в рамках соглашения между СО РАН и Национальной академией наук Кыргызской Республики о подготовке научных кадров. Автор признателен Т.И. Тарасовой и всему коллективу лаборатории молекулярных основ генетики животных ИЦиГ СО РАН за техническую помощь при проведении экспериментов. В работе использовалось оборудование Межинститутского центра секвенирования ДНК СО РАН.
Исследованные в работе популяции домашних свиней
Породы свиней, на которых мы проводили исследования: крупная белая, ландрас, дюрок и СМ-1. Свиньи крупной белой породы и свиньи специализированных мясных пород - дюрок и ландрас, являются наиболее распространенными в Сибири. В последнее время выведены и апробированы новые высоко продуктивные внутрипородные типы свиней крупной белой породы - новосибирский и ачинский, которые обладают специфической генетической структурой (Бекенев, 1997; Заболотная, 2004). Работа по созданию скороспелой мясной породы свиней новосибирской селекции (СМ-1) начата в 1981 году. Порода выведена путем сложного скрещивания животных кемеровской мясной породы (КМ-1), полтавского мясного (ПМ-1) типа и белорусско-полтавских гибридов и универсального типа кемеровской породы (УКМ) с последующим разведением помесей «в себе» (Горин, 1993; Гудилин, 1997; Петухов и др., 2005). Руководитель работ И.И Гудилин (1997) отмечает хорошую приспособленность данной популяции свиней к условиям Западной Сибири. В выведение скороспелой мясной породы свиней новосибирской селекции -СМ-1, большой вклад внесли И.И Гудилин, К.В. Жучаев, А.И. Юрченко и др. (Гудилин, 1995). 1.2.1. Из истории создания отечественных мини-свиней Свиньи уже давно являются объектом генетических и медико-биологических исследований (Тихонов, 1977; 1990; Познахирев, 1979). Многоплодие, возможность быстрой смены поколений и многообразие диких и домашних форм делают их, по сравнению со всеми другими крупными сельскохозяйственными животными, поистине уникальным объектом для генетических и селекционных экспериментов. Кроме того, сходство анатомии и физиологии сердечно-сосудистой и пищеварительной систем с таковыми у человека вызывают интерес к ним как к медико-биологической модели и источнику ксенотрансплантатов. Главным недостатком свиней, затрудняющим их использование в лабораторных генетико-селекционных и медико-биологических экспериментах, является относительно большой размер, требующий, соответственно и значительных рабочих площадей. Для устранения данной проблемы были выведены свиньи специальных миниатюрных пород, которые, несмотря на некоторые присущие им специфические недостатки, всё же оказались вполне пригодными для экспериментальной практики (Тихонов, 1977; 1990; Познахирев, 1979; Понд, Хаупт,1983). Создание в нашей стране первых лабораторных свиней Минисибс (миниатюрная сибирская свинья) было начато в 1970 году, когда проф. В.Н. Тихоновым впервые было выдвинуто предложение использовать для этих целей синтез генофонда культурных европейских и азиатских пород свиней с двумя подвидами диких кабанов. Выведение было осуществлено в Экспериментальном хозяйстве Института цитологии и генетики СО РАН (ИЦиГ СО РАН) методом сложного воспроизводительного скрещивания.
Для скрещивания были использованы свиньи вьетнамский черной и пятнистой пород, шведского ландраса, а также кабанов европейского и среднеазиатского подвидов (рис. 1) (Тихонов, 1990; 2000; 2002; Tikhonov, 1996). В результате длительной селекционно-генетической работы, проводившейся под иммуно- и цитогеиетическим мониторингом, была создана популяция лабораторных свиней, не уступающая по основным показателям лучшим зарубежным породам мини-свиней (Tikhonov, 1996). конституция и высокая жизнеспособность, хорошее многоплодие (8 поросят на помет), белая масть у всех самцов и самок племенной части популяции. Важной особенностью Минисибс является их отличная изученность в отношении иммуно- и цитогенетических характеристик (Тихонов, 1990; 2000). Значительная группа самок и самцов Минисибсов была передана для медицинских исследований в подмосковную (г. Светлогорск) Научно-исследовательскую лабораторию экспериментальных биологических моделей РАМН (Тихонов, 2000). На основе Минисибсов в результате прилития к ним крови геттингенских мини-свиней и специальной селекции иа стресс-устойчивость была создана светлогорская популяция мини-свиней (Тихонов, 1990). С целью проведения опыта по картированию генома свиньи в ЭХ ИЦиГ СО РАН были завезены светлогорские мини-свиньи, которые были скрещены с самками свиней крупной белой породы сибирского типа из племзавода "Большевик". В нашей работе было необходимо использовать, в качестве генетических маркеров, такие полиморфные генетически- детерминированные системы, как группы крови и сывороточные полиморфные белки-аллотипы. Благодаря кодоминантному типу наследования и стабильности в онтогенезе, данные генетические маркеры стали основным инструментом для изучения селекционно-генетических процессов. 1. 3. Использование иммуногенетических показателей крови в качестве генетических маркеров Группы крови представляют собой изоантигены клеточных поверхностей эритроцитов живых организмов. По химическому строению это обычные белки, находящиеся на внешней поверхности мембраны клеток (Тихонов, 1963; 1967; Сердюк, 2002). В настоящее время относительно хорошо изучены 15 генетических систем групп крови свиней, объединяющих более 80 эритроцитарных антигенных факторов. Высокая специфичность эритроцитарных антигенов, не изменяющихся в течение всего периода постэмбрионального онтогенеза, кодоминантное наследование этих антигенов, как простых качественных признаков, и возможность их детекции сравнительно простыми иммунологическими реакциями делает возможным эффективное использование групп крови для прямого иммуногенетического контроля в медико-биологических исследованиях и при селекции сельскохозяйственных животных (Тихонов, 1965; 1966; 1991; Горелов, 1985). Каждая порода характеризуется особой, свойственной только ей частотой встречаемости отдельных групп крови (Тихонов, 1965; 2005; Сердюк, 2002; Топиха, Герасименко и др., 2003).
Поэтому данные об антигенных свойствах крови чрезвычайно ценны при анализе предшествующих селекционных процессов, породообразования, дифференциации на линии и т.д. Интересные результаты получены в исследованиях частоты встречаемости групп крови у разных пород и популяций свиней: показана разница по этому признаку между дикими свиньями, аборигенными и культурными породами (Тихонов, 1963; 1966; 1991; 2005; Сердюк, 2002). Ген, ответственный за выработку фактора крови или типа белка, может оказывать влияние одновременно и на формирование некоторых признаков продуктивности. Возможно также, что между генами, которые определяют образование полиморфных структур крови и генами, обуславливающими продуктивные признаки, существует сцепление, т. е. указанные гены находятся на одной хромосоме. В этом случае они служат маркерами продуктивных признаков, поскольку наследуются сцепленно. Количественные признаки (в том числе хозяйственно-полезные) полигенны. Как маркеры, группы крови могут находиться в одной группе сцепления с генами, контролирующими тот или иной селекционный признак. Тем самым, группы крови могут вовлекаться в селекционный процесс (Тихонов, 1967; Сухова и др., 1981). Большой интерес вызывают у исследователей G, F и D-системы групп крови (Тихонов, 1983; 1984). Поскольку эти кровогрупповые системы детерминируются относительно простыми диаллельными локусами, их можно использовать для изучение пород, различающихся по европейскому и азиатскому происхождению предковых форм свиней (Тихонов, 1991). По данным Петухова с соавторами (2005) европейский геном состоит из аллелей Ga, Fb и Db, а азиатский геном - из аллелей Gb, Fa и Da. Результаты исследования Т.Н. Сердюка (2000) свидетельствуют о том, что во многих породах (брейтовская, крупная белая, ландрас и др.) и их помесях самыми высокими откормочными качествами отличаются подсвинки, имеющие по G-системе гетерозиготный генотип Ga/в. Часто в связи с продуктивностью рассматривается система групп крови Е. В.Н. Тихонов (1991) установил сцепление аллелей Е-локуса групп крови с локусом (VE), детерминирующим жизнеспособность и многоплодие в организме свиней, Г.Н. Сердюк (2000) неоднократно указывал на связь Е-локуса групп крови и, в частности, аллеля „edglikmnps - Е с жизнеспособностью свиней.
Ретроспективные исследования на больных, при лечении которых использовали биологический трансплантационный материал от свиньи
Иммунная система человека препятствует инфекции ксенозоонозных ретровирусов через разнообразные механизмы, включая гуморальный и клеточный иммунитет, специфические и неспецифические иммунные реакции. Поскольку человек и приматы Старого Света не экспрессируют альфа-1,3-галактозилтрансферазу, высокие титры анти-gal-антител появляются у них в циркулирующей крови в результате постоянного контакта с микроорганизмами, несущими альфа-1,3 -галактозу. Эти предварительно сформированные или естественные антитела также эффективно нейтрализуют гамма-ретровирусы, включая PERV. Поскольку PERV, продуцируемые клетками свиньи, приобретают альфа-галактозил-эпитопы, ассоциированные с оболочечным гликопротеином, они инактивируются сывороткой крови через систему комплимента в экспериментах in vitro. Вероятно, этот механизм также высокоэффективен и in vivo (Rother et al., 1996; Takeuchi et al, 1996; Reed et at., 1997). До сих пор все результаты исследований больных, которых лечили с использованием клеток, тканей или органов свиньи, не представили ни одного доказательства инфекции PERV (Heneine et al., 1998; Patience et al., 1998; Paradis et al., 1999; Tacke et al., 2001; Herring et al., 2001). Хотя эти данные являются весьма обнадеживающими, исследования по безопасности ксенотропных органов имеют несколько недостатков: Менее 10% субъектов подвергали фармакологической иммуносупрессии. Если она применялась, то режим иммуносупрессии у этих больных был относительно мягким, с дозами, сопоставимыми с теми, которые обычно применяются при аллотрансплантации. В исследованиях не использовали клеток или тканей от свиней, трансгенных по генам, кодирующим белки системы комплимента человека. Не анализировали вероятное снижение уровня комплимента в плазме крови в процессе лечения, которое должно усилить выживание вируса и повысить риск потенциальной инфекции PERV. Снижение титра естественных aHTH-gaI-аитител, посредством иммуносорбции с применением иммуносорбционных колонок, которое должно способствовать выживанию PERV в плазме, анализировали только у двух пациентов при кратковременной экстракорпоральной перфузии ксеногенной почки (Patience et al., 1998). В большинстве случаев, время контакта пациента с клетками свиньи было очень ограниченным. Ясно, что с увеличением времени выживания трансплантанта, вероятность переноса PERV будет также увеличиваться. Во всех случаях, единственным типом клеток, которые анализировали на присутствие PERV, были мононуклеарные клетки периферической крови.
Поскольку еще окончательно не установлено, экспрессируют ли клетки этого типа рецепторы для PERV и способны ли они к распространению инфекции (Wilson et al., 1998; Specke et al., 2001), нельзя исключить, что репликация PERV происходила в другом типе клеток. Остается неясным, являются ли обнадеживающие до настоящего времени данные свидетельством реального отсутствия продукции вируса клетками свиньи или результатом эффективной иммунологической инактивации высвобождаемых вирусных частиц, например, посредством анти-gal-антител или комплимента. Поэтому сохраняется потенциальная опасность переноса PERV при клинических испытаниях и это делает необходимым продолжение режима жесткого вирусологического контроля. Было показано, что клетки некоторых видов мелких животных, включая мышь, крысу, кошку и норку, экспрессируют рецепторы к PERV и, в некоторых случаях, чувствительны к инфицированию (Takeuchi et al., 1997, 1998; Patience et al., 1997; Wilson et al, 1998; Specke et al., 2001). Поэтому мелких животных можно использовать в качестве модели для изучения факторов, которые влияют на перенос PERV In vivo. Следует заметить, что недостатком большинства моделей на мелких животных, используемых в настоящее время, является то, что наиболее важный у человека барьер против инфекции PERV - опосредованный альфа-1,3-галактозой лизис вируса, у этих видов отсутствует. Поэтому только мыши Gal-KO, у которых нокаутирован ген альфа-1,3 -галактозилтрансферазы, могут считаться наиболее подходящей моделью (Costa et aL, 1999). Однако, поскольку на мышах ещё не разработаны схемы для иммуносупрессии, сравнимые со схемами для приматов, полная имитация условий клинической ксенотрансплантации на мелких животных остается труднодостижимой целью. Исследования инфекции эндогенных ретровирусов свиньи с использованием либо иммунокомпетентных крыс, либо крыс с иммуносупрессией циклоспорином А, либо в присутствии или отсутствии фактора яда кобры (CVF), не обнаружили переноса вируса. Инфекционные исследования на интактных морских свинках не привели к определенным результатам (Specke et al., 2001). Отмечены незначительные уровни инфекции PERV после трансплантации островков поджелудочной железы мышам SCID (van der Laan et al., 2000). Перенос PERV при трансплантации мышам SCID не был неожиданностью, поскольку было показано, что некоторые клеточные линии мыши чувствительны к инфекции PERV (Takeuchi et al., 1998), а мыши SCID утратили как клеточный, так и гуморальный иммунитет. Более того, остается невыясненным, влияют ли на инфекцию PERV в этой модели эндогенные вирусы мыши. Критическим вопросом в оценке пригодности моделей остается определение того, могут ли PERV распространяться сами по себе или им необходимо псевдотипирование ксенотропными эндогенными ретровирусами видов-хозяев, В последнем случае, рассматриваемая модель может быть неприменимой к ксенотрансплантации у человека, поскольку эти вирусы могут отсутствовать в ДРІК герминативных клеток человека. 1. 5. 9. Использование приматов в качестве модели Представляется спорным, что при использовании приматов в качестве модели для изучения инфицирования могут быть решены все вопросы переноса инфекции PERV при ксенотрансплантации.
Хотя предварительные эксперименты показали, что приматы не инфицируются PERV и поэтому не подходят для исследований PERV-инфекции (Patience et al., 1997; Wilson et al., 1998; Takeuchi et al, 1998; Martin et al., 1999; Birmingham et al., 1999), недавние работы доказали возможность инфекции PERV определенных клеток различных видов приматов, включая гориллу, шимпанзе, бабуина и резус - макаки (Long et al., 1999; Blusch et al., 2000; Specke et al., 2001). В противоположность исследованиям in vitro, не было получено доказательств инфекции PERV у 15 бабуинов через 2 года после трансплантации эндотелиальных клеток свиньи животным, получавшим иммуносупрессорную терапию циклофосфамидом (Martin et al., 1998). Однако, значение этой работы невелико, поскольку, кроме того, что количество трансплантированных клеток было весьма малым, эта работа страдает от многих недостатков ранних клинических испытаний. А именно, естественные антитела и комплемент не были истощены и для трансплантации не были использованы клетки трансгенных свиней. Также были исследованы 12 макак после ксенотрансплантации почек и у них не были выявлены признаки инфекции PERV (Loss et al., 2001). Хотя ксенотрансплантанты выживали в течение 15 дней, экспозиция к вирусу, выделявшемуся, вероятно, клетками свиньи была минимальной, поскольку в плазме животных не обнаружили присутствие РНК PERV. Ключевой вопрос оценки значимости этих моделей заключается в относительной заражаемости клеток человека и приматов. Более того, интерпретация данных может быть вновь усложнена в связи с наличием псевдотипирования экотропными ретровирусами приматов, такими как эндогенный ретровирус бабуина (BaEV). В результате необходимы более тщательные исследования клеточного тропизма и потенциального псевдотипирования PERV для того, чтобы судить о пригодности приматов для исследований инфекции PERV. 1.5.10. Патогенный потенциал PERV Как упоминалось выше, PERV являются прототипом гамма-ретровирусов с последовательностями, сходными с рядом вирусов, для которых показан межвидовой перенос (Lieber et al., 1975). В то время как PERV способны, как ретровирусы лейкемии и саркомы, инфицировать и размножаться в клетках приматов in vitro (Sommerfelt et al., 1990; Patience et al., 1997; Martin et al., 2000), их патогенный потенциал, связанный с инфекцией in vivo ещё не ясен.
Статистическая обработка результатов
Статистическую обработку экспериментального материала проводили стандартными методами (Лакин, 1990). Анализ влияния породной принадлежности и условий среды на частоту носителей PERV проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа. По выделенным компонентам факториалы-юй девиаты рассчитывали дисперсию (s ) и силу влияния (2) каждой из компонент изменчивости по методу Н.А. Плохинского и оценивали статистическую значимость фактора (Плохинский, 1960;Лакин, 1990). Для определения взаимоотношений изучаемых популяций строили карту в пространстве двух главных компонент. Данный метод анализа межпопуляционных отношений был выбран потому, что иерархически упорядоченную кластеризацию (древовидную структуру) можно обоснованно применять лишь в том случае, когда исследователь уверен, что она естественным образом описывает изучаемые группировки (Животовский, 1991). Так как одной из задач исследования является именно выяснение этой иерархичности, был использован метод, где структура подразделения выборок априорно не задаётся. Генетические дистанции для построения карты в системе двух главных компонент определяли по формуле: D = JS (pf - 7,)\ (евклидова дистанция) где т - число фенотипов, pi и qt - частоты фенотипов в сравниваемых группах (Вейр, 1995). Для вычислений использовали компьютерную программу MGA-dist(http://mga,bionet.nsc.ru/MGA-dist/MGA-dist.htm). Наличие и силу ассоциации различных типов ретровирусов с генетическими маркерами определяли с помощью коэффициента ассоциации гА (Лакин, 1990) по формуле: ad - be где а - число носителей ретровируса, позитивных по маркеру, Ъ -число не-носителей, позитивных по маркеру, с - число носителей, негативных по маркеру, d - число не-носителей ретровируса, негативных по маркеру. Достоверность коэффициента ассоциации оценивали критерием % (Животовский, 1991) по формуле; где N - объём выборки. Направление связи определяли на основании знака коэффициента ассоциации: гА 0 - ретровирус и маркер находятся в "фазе притяжения", гА 0 - соответственно, в "фазе отталкивания".
Достоверность существования ассоциации ретровируса и маркерного локуса в целом оценивали суммарным критерием % (Животовский, 1991) по формуле: г1 -Уг2 А мац / , л. I 1 где хї - значения частных критериев, полученных для отдельных выборок и (или) отдельных маркеров исследуемого локуса 2.4. Компьютерные базы данных Молекулярно-геиетическая информация была получена из следующих баз данных: National Center for Biotechnology Information (ІЧСВІ) U.S. National Library of Medicine: http://www.ncbi,nlm.nih.gov/mapview/map search.cgi?taxid:=9823 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/pig ARKdb (Roslin Biotechnology and Biological Sciences Research Council): http://iowa.thearkdb.org/anubis?singlespecies=pia http://www.thearkdb.org/browser INRA (Laboratoire de Genetique cellulaire Centre de recherche de Toulouse, France): http://www.toulouse.inra.fr/lgc/pig/RH/M"enuchr.htm Общая схема исследований представлена на рисунке 7. Данные исследований по содержанию трех типов эндогенных ретровирусов (env А, env В и env С) у домашних свиней разньтх пород и двух подвидов диких кабанов в зависимости от условий их содержания и обитания представлены в таблице 6. Таблица 6, Наличие эндогенных ретровирусов PERV разных типов в популяциях домашних свиней и диких кабанов. Анализ распределения частот носителей PERV у диких кабанов и домашних свиней показал, что в целом по виду Sus scrofa, а так же для дикой и домашней формы в отдельности, имеют место значительные различия по частоте носителей различных типов PERV. Наиболее часто встречаются носители PERV А, с несколько меньшей частотой - носители PERV В, а самую низкую частоту имеют PERV С. Дикая и домашняя формы вида Sus scrofa весьма существенно различаются как по частотам носителей PERV (Р 0.001 для всех типов), так и по выраженности различий между этими частотами: частоты носителей выше у домашних свиней, а выраженность различий у диких кабанов. Пределы, в которых варьируют выборочные частоты носителей PERV, различны для разных типов ретровируса. Носителей эндогенного ретровируса типа env А в целом по виду 50-100%, для диких кабанов 50-74,2%, у домашних свиней 80-100%. Таким образом, области вариации частот носителей этого типа у дикой и домашней формы не перекрываются. Носителей env В в целом по виду 25-100%, из них для диких кабанов 25-67,7% у домашних свиней 40-100%, то есть области вариации перекрываются. PERV С в целом по виду и у диких кабанов 12,9-100%, у домашних свиней 17,2-98,8%, то есть в последнем случае область вариации выборочных частот у домашних свиней лежит внутри области вариации диких кабанов. Таким образом, выявлено достоверное отличие домашних свиней и диких кабанов по встречаемости у них ретровирусов разных типов, Карта, построенная в пространстве двух главных компонент, по частотам встречаемости носителей различных типов PERV в выборках диких кабанов и домашних свиней позволяет выделить четыре кластера (рис. 15): I. Среднеазиатский кабан; II. Кабан Юга Украины, свиньи пород ландрас и дюрок племфермы ОАО "Кудряшовское" и новосибирский тип крупной белой породы из ЗАО АПК "Иня"; III. Ачинский тип крупной белой породы из ЗАО АПК "Иня"; IV. Лабораторные мини-свиньи и ландрасы из ЭХ СО РАН и порода СМ-1 из учхоза "Тулинское". По-видимому, на формирование этих кластеров оказало влияние как генетическое родство популяций, так и сходство условий содержания или обитания. Все попавшие в кластер II породы находятся в той или иной степени родства как с европейским кабаном, так и друг с другом (Овсяников, 1974; Данилкин, 2002; Larson et al., 2005). Отметим, что выборки из пород, представленных в кластере II, оказались также в кластерах III и IV. Анализ в пространстве двух главных компонент показал, что выборки одной породы, живущие в условиях разных хозяйств или местообитания, оказались в разных кластерах, в то же время как свиньи разных пород вошли в один кластер. Чтобы проанализировать возможное влияние генотипа и среды на встречаемость ретровирусов разного типа у домашних свиней и диких кабанов, была проведена оценка влияния факторов генотипа и среды на частоты носителей PERV в популяциях свиней. Для этого применили систему однофакторных дисперсионных комплексов, в которых в качестве факторов выступали выборка (совместное влияние генотипа и среды) (табл. 6), порода/подвид (влияние генотипа), условия окружающей среды (табл. 8), а в качестве результативного признака - частота PERV того или иного типа. Условия окружающей среды разделили на четыре класса: естественные (дикие кабаны); высокое соответствие зооветеринарным нормам на протяжении последних 20-ти лет (племенная ферма ОАО "Кудряшовское"); хорошее или удовлетворительное соответствие зооветеринарным нормам (ЗАО АПК "Иня" и учхоз "Тулинское); на протяжении последних 20-ти лет соответствие зооветеринарным нормам ниже среднего. Приведенные данные свидетельствуют (табл. 8) о равном участии наследственности и окружающей среды в формировании частот носителей всех трех типов PERV.
Изучение ассоциаций различных типов PERV с аллотипами сыворотки крови и полом животных в популяциях домашних свиней и диких кабанов
Коэффициент ассоциации «тип ретровируса - маркер» вычисляли для 111 пар, включающих маркеры аллотипов сыворотки крови у животных четырех исследованных популяций (табл. 20), и для 33 пар, включающих маркеры систем групп крови у животных крупной белой породы новосибирского типа (табл. 21). При этом для 39 пар гА не был определен ввиду отсутствия в популяциях полиморфизма по маркеру. В целом, была проведена оценка коэффициента ассоциации в общей сложности для 105 пар - «тип ретровируса - маркер», среди которых 14 значений коэффициентов оказались статистически достоверными. Поскольку первый порог достоверности результатов предполагает 5% вероятность случайного получения статистически значимых оценок, в нашем исследовании ожидаемое число достоверно ассоциированных пар в результате случайной ошибки должно составить 105x0,05=5,25; что статистически значимо меньше (% = 15,35; Р 0,001) фактического их числа, т.е. 14 пар. Таким образом, около 9 пар обнаруженных достоверных ассоциаций ретровирусов PERV с генетическими маркерами свиней, можно рассматривать как реально существующие, У домашних свиней породы крупная белая выявлены ассоциации / 0 3 2 3 PERV В с л оку сом аМ (аМ и аМ ) (свиньи новосибирского типа), кодирующими аллотипы а-макроглобулина (аМ1, аМ2 и аМЗ) и PERV А с полом (самцами) свиней ачинского типа с отрицательным значением коэффициента ассоциации. Можно полагать, что эти типы ретровируса находится в "фазе отталкивания" с аллелями у домашних свиней пород крупная белая. Имеют место также ассоциации PERV В с маркером IgGl у свиней новосибирского типа, аллотипа Lpbl2 со всеми тремя типами ретровируса у свиней ачинского типа с положительным значением коэффициента ассоциации. Для того, чтобы выделить ассоциации, существование которых наиболее вероятно, дополнительно была проведена оценка ассоциаций отдельных типов ретровирусов PERV с изученными полиаллельными локусами в целом и (или) при объединении выборок из популяций с помощью суммарного критерия %2 (табл. 22).
Число генетических локусов, статистически значимо ассоциированных с тем или иным типом PERV, оказалось равным 6, а число выявленных для этих локусов достоверных ассоциаций специфических маркеров в отдельных популяциях животных равно 8. Это хорошо совпадает с ранее вычисленным предполагаемым их числом (около 9 пар, табл. 20, 22). Таким образом, есть основания полагать, что 6 из 10 исследованных маркеров действительно могут быть физически сцеплены с ретровирусами (табл. 22). 3. 4. Изучение ассоциаций между наличием различных типов PERV в геномах домашних свиней и диких кабанов. Помимо связи с генетическими маркерами, имели место ассоциации между разными типами эндогенных ретровирусов свиней. В таблице 23 показана ассоциация между тремя типами эндогенного ретровируса для четырех исследованных популяций. Анализ ассоциации между типами эндогенных ретровирусов показал, что ретровирус типа А встречается достоверно чаще с типом В. Существование связи между типами В и С и типами А и С было статистически недостоверно. Наличие связи между типами ретровирусов можно объяснить возникновением рекомбинантов между типами env А и env В (Lee et al, 2002). Таким образом, на основании данных, полученных методами однофакторного дисперсионного анализа, построением карты в пространстве двух главных компонент и семейного анализа, можно предположить, что наличие разных типов эндогенного ретровируса в геномах свиней зависит не только от породы животных, как было показано ранее (Akiyoshi et al., 1998; Takeuchi et al., 1998; Lee et al., 2002; Айтназаров и др., 2004; Niebert, Tonjes, 2005), но и от условий их содернсания и местообитания. Присутствие гена PERV типа envA в геноме домашних и диких свиней, по-видимому, мало зависит от породы или подвида животных и условий их содержания. Вместе с тем, частоты встречаемости ретровирусов PERV типов env В и env С существенно различаются не только между всеми исследованными выборками животных, но и при группировании их по породам или условиям содержания. Отмечены достоверные различия по встречаемости ретровирусов PERV env В и env С в популяции одной и тот же породы свиней (ландрас), принадлежащих разным племхозяйствам. Установлено также влияние подвида диких свиней (кабан Юга Украины и среднеазиатский кабан) и условий их обитания на встречаемость у них ретровирусов всех изученных нами типов. Каждый вирус поддерживается как вид в природе, переходя из одного организма в другой. Эндогенные ретровирусы, поскольку они встроены в геном в форме провируса, не являются патогенными. Они могут находиться либо в «молчащем», либо в «активном» состоянии, когда в нормальных, лишенных контакта с каким-либо вирусом клетках, вдруг начинает продуцироваться ретровирус. Причиной, вызывающей переход эндогенного ретровируса из «молчащего» состояния к «активному», может быть воздействие каких-либо химических или биологических факторов, либо ионизирующего излучения. В тех случаях, когда причина активизации эндогенного ретровируса не известна, говорят о спонтанной экспрессии вируса (Wood et al., 2004). Другая группа ретровирусов - экзогенные. Они, как обычные вирусы, могут попасть в клетку хозяина только путем инфекции извне (Лебедев, 2000). Ярким представителем экзогенного ретровируса являются вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), который может передаваться другим людям через кровь, семенную жидкость, шеечный секрет матки, слюну и грудное молоко (Herniou et al., 1998). Важно отметить, что между экзогенным и эндогенными вирусами не существует непроходимой пропасти: эндогенный вирус может стать экзогенным и, наоборот, при накоплении мутаций или с помощью рекомбинации с родственными геномами ретровирусов (Wood et al., 2004). Эндогенные ретровирусы свиней PERV присутствуют в геноме как соматических, так и половых клеток хозяина и наследуются из поколения в поколение вместе с остальной частью генома. Вирусный геном первоначально представляет собой РНК, которая при инфекции превращается в ДНК и, внедряясь в геном хозяйской клетки, становится провирусом (Leib-Mosch et al.,1996).
Наши исследования показали, что дикая и домашняя форма вида Sus scrofa весьма существенно различаются как по частотам носителей PERV всех типов, так и по выраженности различий между этими частотами: частоты носителей PERV выше у домашних свиней, а выраженность различий - у диких кабанов. Пределы, в которых варьируют выборочные частоты носителей PERV, различны для разных типов ретровируса. Отставание роста частоты носителей env С по сравнению с env А и env В, очевидно, связано с более высокими частотами носителей последних в нормальных естественных условиях. Европейские формы Sus scrofa (одна дикая и три домашние), видимо, находятся в условиях окружающей среды оптимальных или близких к оптимуму, поэтому, те соотношения частот носителей PERV, которые мы наблюдаем в отдельных группах - носителей эндогенного ретровируса, обычны для форм (дикой и домашней) вида Sus scrofa (табл. 6 и 7). Среднеазиатский кабан достоверно отличен по частотам носителей всех трех типов PERV (табл. 6, 7 и 8). Это связано со своеобразным, присущим только этой выборке соотношением частот носителей различных типов PERV. Возможно, что специфические параметры среднеазиатского кабана и его резкое отличие от кабана Юга Украины и домашних свиней обусловлены генетическими и филогенетическими особенностями и могут быть характерной чертой данного подвида. Имеются данные о выраженной географической клинальности генетических расстояний, рассчитанных по частотам групп крови разных подвидов диких кабанов (Тихонов и др., 1985; Горелов, 1994; Сердюк, 2000; Тихонов, 2005). Эти данные подтверждают значительную отдаленность среднеазиатских кабанов от кабана Юга Украины.
