Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы
1.1. Происхождение и эволюция домашних свиней 15
1.1.1. Систематика свиней 15
1.1.2. Дикий кабан 16
1.1.3. Домашние свиньи 17
1. 2. Исследованные в работе популяции домашних свиней 19
1. 2.1. Из истории создания отечественных мини-свиней 19
1.3. Использование иммуногенетических показателей крови в качестве генетических маркеров 22
1. 3.1. Иммуногенетические системы сывороточных аллотипов свиньи 25
1.3. 2. Общие сведения о строении, функции, классах и биосинтезе липопротеииов сыворотки крови 25
1. 3. 3. Структура и функции а-макроглобулинов 27
1. 3. 4. Иммуногенетическая система аллотипов сывороточных иммуноглобулинов 30
1. 4. Картирование генома свиньи 31
1. 4.1. Генетическая карта свиньи 33
1. 5. Ретровирусы. Общая характеристика ретровирусов 34
1. 5.1. Эндогенные ретровирусы свиней (PERV) и проблемы ксенотрансплантации 36
1. 5. 2. Молекулярная характеристика PERV 37
1. 5.3. Филогенетический анализ PERV 39
1. 5. 4. Разработка диагностических методов для контроля за экспрессией и передачей PERV 43
1. 5. 5. Экспрессия и выделение PERV клетками свиньи 46
1. 5. 6. Тропизм PERV к клеткам человека 49
1.5. 7. Ретроспективные исследования на больных, при лечении которых использовали биологический трансплантационный материал от свиньи 52
1. 5. 8. Использование некоторых видов мелких животных в качестве биологической модели 54
1. 5. 9. Использование приматов в качестве модели 55
1. 5.10. Патогенный потенциал PERV 56
1. 5.11. Данные о картировании и локализации PERV 60
Глава II. Материалы и методы исследований
2.1. Материалы исследований
2.1.1. Характеристика исследуемых животных 62
2.1.2. Получение и хранение биологического материала 65
2.1.3. Характеристика аллоантисывороток 67
2. 2. Методы исследований
2. 2.1. Выделение ДНК 67
2.2.2. Праймеры 68
2. 2. 3. ПЦР-анализ , / 71
2. 2. 4. Определение аллотипов сывороточных белков 72
2.3. Статистическая обработка результатов 78
2. 4. Компьютерные базы данных 79
Глава III. Результаты
3.1. Генотипирование PERV разных популяций домашних свиней и диких кабанов 81
3.1.1. Наличие PERV разных типов в популяциях домашних свиней и диких кабанов 81
3.1. 2. Влияние генотипа и среды на частоту носителей различных типов PERV у диких кабанов и домашних свиней 84
3.1. 3. Попарное сравнение выборок по частотам носителей различных типов PERV 90
3.1. 4. Отцовский и материнский эффект на частоту PERV у потомков 92
3. 2. Иммуногенетическое изучение полиморфизма сывороточных белков у домашних свиней и диких кабанов 95
3.2.1. Иммуногенетический анализ среднеазиатского дикого кабана 98
3.3. Изучение ассоциаций различных типов PERV с аллотипами сыворотки крови и полом животных в популяциях домашних свиней и диких кабанов 100
3. 4. Изучение ассоциаций между наличием различных типов PERV в геномах домашних свиней и диких кабанов 105
Глава IV. Обсуждение результатов
4.1. PERV разных типов в популяциях домашних свиней и диких кабанов 107
4. 2. Разнообразие популяций диких и домашних свиней по комплексу аллотипов сыворотки крови 121
4. 3. Ассоциации PERV разных типов с генетическими маркерами в популяциях домашних и диких свиней 123
Выводы 128
Список литературы
- Систематика свиней
- Общие сведения о строении, функции, классах и биосинтезе липопротеииов сыворотки крови
- Получение и хранение биологического материала
- Влияние генотипа и среды на частоту носителей различных типов PERV у диких кабанов и домашних свиней
Введение к работе
Актуальность проблемы
Ретровирусы - вирусы с необычным способом репликации генетического материала. Для цикла репродукции этого большого семейства вирусов характерен обратный поток генетической информации: вместо обычной транскрипции ДНК в РНК, как это происходит в клетке, их геномная РНК транскрибируется в ДНК. Эта особенность репродукции ретровирусов отражена в названии: «ретро», что значит «обратный». Следующая за обратной транскрипцией стадия интеграции ДНК-копии в геном хозяина необходима для размножения нового поколения ретровируса (Temin, Mizutani, 1970). В геноме человека выявлены многочисленные повторяющиеся элементы, которые напоминают интегрированную форму инфекционных ретровирусов, которые получили название эндогенных ретровирусов человека. Предполагается, что эндогенные ретровирусы являются латентной «молчащей» формой экзогенных вирусов. В то же время эндогенные ретровирусы способны активироваться и продуцировать инфекционные частицы, индуцируя болезнь (Petropoulos, 1997; Vobis et al., 2003). Члены семейства ретровирусов вызывают ряд тяжелых заболеваний животных и человека. К наиболее изученным ретровирусам относятся вирусы лейкемии птиц, мышей, кошек и приматов, а также вирусы иммунодефицита кошек, обезьян и человека (Coffin, 1996).
В последнее время, все большую остроту приобретает проблема исследования взаимодействия генома ретровируса с геномом человека. Развитие современной науки предполагает использование ретровирусов в качестве молекулярного инструмента для генотерапии, адресной доставки биорегуляторов, создание вакцин нового поколения. Изучение ретровирусов оказало больше влияние на разные области биологии и медицины, на молекулярную генетику, на изучение контроля за ростом клетки и канцерогенеза, а так же на биотехнологию (Temin, 1992). Способность
8 ретровирусных векторов осуществлять перенос генов только в делящиеся клетки была использована при развитии методов генотерапии аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит и рассеянный склероз (Кристофер, 2001). Ретровирусные системы переноса и экспрессии генов являются удобным и эффективным инструментом исследования во многих фундаментальных областях биологической науки. Уже сейчас они с успехом применяются для развития совершенно новых подходов к лечению наследственных, онкологических и некоторых вирусных заболеваний, составляющих основу нового направления биомедицины - генной терапии (Прасолов, Иванов, 2000).
Присутствие в геномах млекопитающих множества эндогенных ретровирусов ставит серьезные проблемы перед медициной. Одним из возможных негативных последствий искусственного ретровирусного заражения может быть нарушение взаимоотношений организма с эндогенными ретровирусами, неконтролируемая активация последних или возникновение патогенных рекомбинантов. Вопросы безопасности, связанные с наличием эндогенных реторвирусов, приобретают особую остроту для ксенотрансплантации, при которой органы животного пересаживают человеку (Patience et al., 1997; Кристофер, 2001; Lee et al., 2002; Айтназаров, 2003; Scobie et al., 2004; Niebert, Tonjes, 2005).
Из-за дефицита донорских органов в нашей стране лишь около 30% пациентов из сниска ожидания доживают до трансплантации. В развитых странах летальные цифры укладываются примерно в 10%. В США ежегодно получают около 20 тыс. донорских органов. В России доноры обеспечивают менее 10% необходимого количества органов для пересадки. В России развитие клинической трансплантологии сопряжено со значительными трудностями. Одной из таких трудностей является недостаточное количество трансплантационных центров, их неравномерное расположение на территории Российской Федерации. Другая трудность - неготовность к констатации смерти человека на основании диагноза смерти мозга из-за
9 низкой технической оснащенности реанимационных отделений интенсивной терапии, поскольку отсутствует необходимая диагностическая аппаратура. Существуют также этические проблемы, связанные с констатацией смерти человека по критериям смерти мозга.
Длительное время отсутствовало правовое регулирование в данной области, в том числе в отношении заготовки донорских органов. Ее правовая база была заложена в России лишь в 1992 г. с принятием Закона Российской Федерации "О трансплантации органов и (или) тканей человека" от 22.12.1992 г.
Существуют три основных пути решения проблемы нехватки органов для пересадки: 1) создание качественных искусственных органов длительного действия, 2) ксенотраисплантация (пересадка человеку органов животных) и 3) клонирование органов, предназначенных для трансплантации (Шумаков и др. 1995).
Одним из преимуществ ксенотрансплантацій перед аллотрансплантацией (внутривидовая пересадка органов и тканей) является возможность более детального обследования донора, так как многие инфекции передаются при гемотрансфузии и аллотрансплантации: вирусы иммунодефицита человека, гепатита В и С, герпеса, а также туберкулез; всего этого можно избежать при использовании ксеногенных тканей (Weiss, 1999). При проведении манипуляций с органами и тканями животных необходимо тщательное обследование животного-донора, чтобы избежать риска возникновения вирусной инфекции. Более того, при ксенотрансплантации искусственно создаются условия, которые не могли возникнуть в природе. Поэтому нельзя исключить вероятности рекомбинации близкородственных вирусов человека и животного и адаптации к организму человека вирусов, репродуцирующихся в организме животных (Fox, 1997; Brown et al., 1998). Развитие этого направления медицины ставит новые задачи перед селекционерами, биотехнологами и ветеринарами.
Ксенотрансплантація органов от свиньи человеку связана с
потенциальной опасностью заражения реципиента эндогенными
ретровирусами (porcine endogenous retrovirus PERV), которые являются составной частью генома свиньи. Показано, что PERV способны инфицировать клетки человека in vitro (Martin et al., 1998). Внедренный эндогенный ретровирус навсегда остается в составе ДНК клеток хозяина и превращается в новый генетический элемент его генома (Wilson et al., 2000; Wood et al., 2004). Были выделены три типа ретровирусов PERV (А, В и С), которые различаются по последовательности нуклеотидов гена env и своим биологическим свойствам (Takeuchi et al., 1998).
Находясь в латентной форме, ретровирусы, тем не менее, с некой вероятностью, могут вызывать заболевания у человека, в том числе, онкологические, если они активируются при пересадке органа от животного-донора (Шумаков, 1995). Кроме того, существует опасность активации эндогенных ретровирусов животного в клетках человека и появление нового типа вируса за счет рекомбинаций эндогенных ретровирусов животного и человека (Свердлов, 1999). Эндогенный ретровирус свиней, передающийся при межвидовой трансплантации, может являться причиной эпидемий, подобных эпидемии СПИДа.
Свинья является главным претендентом на роль донора органов при ксенотрансплантации, так как ее органы более всего сходны с человеческими по размеру и физиологическим параметрам. Для таких целей в настоящее время за рубежом созданы и используются специальные породы лабораторных свиней (геттингентские мини-свиньи, юкатанские мини-свиниьи и т.д.).
В Институте цитологии и генетики СО РАН создано и широко использовалось для многих медико-биологических исследований стадо первых отечественных лабораторных миниатюрных свиней «Минисибс» (Тихонов, 2000).
Сибирские мини-свиньи апробированы в ряде медицинских и биологических институтов Сибири для моделирования атеросклероза, механизма взаимодействия гетерогенных тканей в плаценте, патогенеза язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, влияния стресса при трансплантации кожи и сосудов (Тихонов, 1990; Горелов и др., 2001).
Впервые сердечные клапаны мини-свиней для пересадки человеку были использованы в Кемеровском кардиологическом центре (Тихонов, 2000; Горелов и др., 2001). Несколько лет успешного использования клапанов свиных сердец в качестве биопротезов показали, что в отличие от зарубежных аналогов, они гораздо дешевле и более надежны. В Институте патологии кровообращения им. Мешалкина МЗ РФ проводятся исследования по трансплантации сердца, клапанов, кровеносных сосудов и других тканей у мини-свиней. В Новосибирском научно-исследовательском институте травматологии и ортопедии МЗ РФ на мини-свиньях ведутся исследования по коррекции сколиоза.
Перечисленные проблемы обусловливают актуальность изучения эндогенных ретровирусов PERV типов А, В и С у лабораторных мини-свиней, созданных для медико-биологических исследований в ИЦиГ СО РАН, а также у некоторых родоначальных пород домашних свиней и диких кабанов. Цель и задачи исследования
Целью исследования является выявление эндогенных ретровирусов типов А, В и С в геномах лабораторных мини-свиней и их некоторых родоначальных пород, а также изучение факторов, влияющих на частоту встречаемости PERV. В задачи исследования входило:
1. Изучить частоту встречаемости эндогенных ретровирусов разных типов у нескольких пород домашних свиней и диких кабанов.
Оценить влияния средовых (условия содержания и обитания) и генетических факторов (породы и подвиды) на наличие разных типов ретровирусов в геноме домашних и диких свиней.
Провести анализ ассоциаций различных типов эндогенных ретровирусов между собой и традиционными генетическими маркерами, использовавшимися при селекции свиней.
Научная новизна и практическая ценность
Впервые изучена порода лабораторных сибирских мини-свиней на наличие эндогенных ретровирусов PERV типов А, В, С. Показано, что эндогенные ретровирусы типа А, В и С широко распространены у лабораторных миниатюрных свиней. Обогащенность геномов животных этой породы ретровирусами, вероятно, обусловлена внесением их от пород-основателей. В то же время среди пород-основателей (диких и домашних свиней) имеются животные, свободные от некоторых типов эндогенных ретровирусов. Поскольку существует опасность активации эндогенных ретровирусов свиней при ксенотрансплантации, необходимо учитывать, что частота встречаемости эндогенных ретровирусов в некоторых выборках домашних и диких свиней существенна. На наличие эндогенных ретровирусов разных типов в популяциях свиней оказывает влияние не только порода (подвид), но и условия содержания (обитания). При селекции и разведении свиней для медико-биологических исследований необходимо строгое соблюдение зоогигиенических норм. В ходе работы выявлены ассоциации эндогенных ретровирусов свиней с разными генетическими маркерами и полом животного, которые могут быть использованы в дальнейших научных исследованиях и при селекции. Положения, выносимые на защиту
1. Изучение влияния генотипа (породы и подвиды животных) на уровень встречаемости у свиней эндогенных ретровирусов PERV показало статистически значимые различия частот носителей различных типов ретровируса (А, В и С) как внутри популяций одной породы, так и между
различными породами, а также у диких кабанов Южной Украины и Средней Азии.
Метод однофакторного дисперсионного анализа, кластеризация методом двух главных компонент и семейный анализ пометов свиньи крупной белой породы, показали достоверное влияние факторов среды {условия содержания и обитания) на частоту носителей PERV в популяциях домашних и диких свиней.
Выявлены ассоциации ретровируса PERV типа А с локусами эритроцитарных антигенов ЕЛЕ, ЕАК, липопротеином LPB к полом животных, а также ассоциации ретровируса PERV типа В с локусами аЫ, ЕЛЕ и LPB у разных подвидов диких кабанов и домашних пород свиней. Показана ассоциация между PERV типов А и В у некоторых пород свиней.
Высказана гипотеза о возможности, кроме вертикальной передачи эндогенных ретровирусов свиней всех трех типов по наследству от родителей потомкам, горизонтальной передачи от особи к особи, при которой PERV могут выступать в качестве инфекционного вируса. Апробация работы
Материалы исследования были представлены на XII Международной
конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии,
фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, 2004); на международном
конгрессе "Progress in Fundamental and Applied Sciences for Human Health"
(Ukraine, 2004); на международной научно-практической конференции
молодых ученых СО РАСХН «Новейшие направления развития аграрной
науки в работах молодых учёных» (Новосибирск, 2004); на Сибирском
международном ветеринарном конгрессе «Актуальные вопросы
ветеринарной медицины» (Новосибирск, 2005); на отчетной конференции «Динамика генофондов растений, животных и человека» (Москва, 2005); на отчетной сессии ИЦиГ СО РАН (Новосибирск, 2006). Публикации По теме диссертации опубликовано 11 работ.
14 Структура и объем диссертации
Диссертация содержит 158 страницы машинописного текста, иллюстрирована 23 таблицами и 17 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы. Указатель литературы содержит 256 работ, из которых 159 зарубежных авторов. Благодарности
Автор выражает сердечную признательность безвременно ушедшему первому научному руководителю к.с.-х.н. И,Г. Горелову, заложившему основы данной работы. Глубокую и искреннюю признательность автор выражает зав. лабораторией молекулярных основ генетики животных ИЦиГ СО РАН к.б.н. А. Г. Ромащенко за помощь и поддержку на всех этапах работы, а также соавторам опубликованных работ: к.б.н. М.А. Савиной, В.Ф. Кобзеву (ИЦиГ СО РАН); к.б.н. СП. Князеву (НГАУ), д.с.-х.н. В.А. Бекеневу, к.с.-х.н. Г.М. Гончаренко, кх.-х.н. А.А. Заболотиой (СибНИПТИЖ СО РАСХН); к.б.н. В.Д. Афонюшкину (ИЭВСиДВ СО РАСХН). Автор признателен к.б.н. СВ. Никитину и к.б.н. А.В. Кириченко за помощь в проведении статистической обработки данных. Автор приносит благодарность сотруднику Института патологии кровообращения им. акад. Мешалкина проф. д.м.н. П.М. Ларионову за помощь при обсуждении медицинских аспектов диссертационной работы. Автор искреннее благодарит проф. д.в.н. Жунушева А.Т и проф. д.б.н. Захарова И.К. за предоставленную возможность целевой подготовки в рамках соглашения между СО РАН и Национальной академией наук Кыргызской Республики о подготовке научных кадров. Автор признателен Т.И. Тарасовой и всему коллективу лаборатории молекулярных основ генетики животных ИЦиГ СО РАН за техническую помощь при проведении экспериментов. В работе использовалось оборудование Межинститутского центра секвенирования ДНК СО РАН.
Систематика свиней
Дикий кабан - широкоареальная и малоспециализированная группа млекопитающих очень древнего происхождения (Майнхардт, 1983). Кабан -наиболее крупная форма рода Sus. Oliver (1995) и Данилкин (2002) описывают следующие подвиды: S.s. scrofa, S.s. meridionalis, S.s. algira, S.s. attila, S.s. lybicus, S.s. nigripes, S.s. davidi, S.s. cristatus, S.s. affiriis, S.s. sibiricus, ussuricus, S.s. leucomysiax, riukiuanus, S.s. taivamts, S.s. moupinenus. S.s. vittatus. Кабаны распространены на большой части Европы, юге Азии, включая острова Тихого океана, севере Африке. В Центральную Азию, Европу и Африку древний, кабан распространился из Юго-Восточной Азии. В последние века представители рода акклиматизированы в Северной и Южной Америке и Австралии. Дикий кабан характеризуется очень большой внутривидовой изменчивостью (Боголюбский, 1959; Соколов, 1959), которая в значительной степени связана с высокой экологической приспособленностью, благодаря чему этот вид широко распростраиился на огромной территории от Атлантического до Тихого океана (Epstein, 1971).
На территории бывших союзных республик СССР обитает пять подвидов кабана: центральноевропейский (Sus scrofa scrofa), кавказский или румынский (S.s. attila), забайкальский (S.s. sibiricus), уссурийский (S.s. ussuricus) и среднеазиатский (S.s. nigripes) (Горелов, 1994; Данилкин, 2002). Важно отметить, что заметные отличия по феногенетическим признакам наблюдаются и среди кабанов одного и того же подвида. Например, кабаны Юга Киргизии (S.s. nigripes) более крупные, высоко-передые и темно-окрашенные, по сравнению со своими северными сородичами (Слудский, 1956).
В пределах современного евразийского ареала можно выделить более крупные, чем подвид, географические формы дикого кабана - западную, центральную и восточную (Громова, 1962). Западная форма - европейский кабан S. s. scrofa, центральная географическая форма - в рангах подвида, кабан румынский (кавказский), 5. s. attila, и кабан среднеазиатский, S. s. nigripes. Восточная форма может быть подразделена на континентальную и островную. Восточная континентальная форма объединяет подвиды забайкальский (сибирский), S. s. raddeanus, (синонимом названия этого подвида считается S. s. sibiricus) и уссурийский (дальневосточный), S. s. ussuricus (синоним S. s. continentalis). Восточная островная форма включает ряд подвидов, в частности, рюкюанский, S. s. riukiuanus, и японский, S. s. leucomystax (Боголюбский, 1959; Oliver, 1995; Genov, 1999; Larson et al., 2005).
Дикие свиньи были одомашнены в период между 4900 и 4000 годами до н. э. в ряде географических районов (Овсянников, 1974). Предполагается, что домашние свиньи S. s. domesticus происходят из двух или трех независимых центров доместикации (Боголюбский, 1959). Первый из таких центров находился в Юго-Восточной Азии, где форма Sus vittatus, якобы, послужила основой для выведения азиатских форм домашних свиней; второй центр - в Европе, где подвид S. s. scrofa стал родоначальником коренных европейских пород, а третий центр - в Средиземноморье, где родоначальником средиземноморских пород свиней был подвид S. s. attila (Дарвин, 1951).
В настоящее время все еще традиционно популярна точка зрения, выдвинутая в XIX в. Натузиусом (Дарвин, 1951), согласно которой дикая свинья Sus vittatus, обитающая в Юго-Восточной Азии (современная систематика даже не включает ее сейчас в перечень видов, образующих род Sus) (Соколов, 1979), была родоначальником всех коренных домашних свиней Востока, а европейский кабан S. s. scrofa - домашних свиней Запада. Обмен генами между центрами доместикации и привел к современному разнообразию пород свиней (Дарвин, 1951). В настоящее время современные методы иммуно генетики приобретают все большую теоретическую и практическую значимость для изучения проблем микроэволюции и породообразования (Тихонов, 2002; 2005).
С точки зрения других авторов доместикация происходила главным образом на территории первичного ареала Sm scrofa, т.е. на исторической родине этого вида, в соответствии с теорией Вавилова о центрах происхождения культурных видов (Князев, Никитин, 2004). При исследовании образцов древней ДНК и митохондриальной ДНК современных млекопитающих было высказано предположение, что ряд пород крупного рогатого скота, овец, коз, свиней и собак происходит от небольших групп прирученных животных (Vila et al., 2005).
Общие сведения о строении, функции, классах и биосинтезе липопротеииов сыворотки крови
Наиболее распространенными из представленных иммуно-генетических систем являются липопротеины - известно более 30 антигенных вариантов. Липопротеины делят на классы в зависимости от их гидратной плотности. Различают пять основных классов липопротеинов: хиломикроны (ХМ) - липопротеины, флотирующие (всплывающие) при плотности раствора 0,95г/мл; липопротеины очень низкой плотности (ЛОНП) - флотирующие в диапазоне от 0,95 до 1,006г/мл; липопротеины низкой плотности (ЛНП) - от 1,006 до 1,063г/мл; липопротеины высокой плотности (ЛВП) - от 1,063 до 1,2 Юг/мл; липопротеины очень высокой плотности (ЛОВП) - плотность раствора более 1,2 Юг/мл. Из представленных пяти классов наиболее изученными являются ЛНП и ЛВП (Баранов, Савина, 1988).
Рядом исследователей (Rapacz, 1978; Ермолаев, 1997; Горелов и др., 2000) показано, что сывороточные белки, содержащие в своем составе жиры (липопротеины низкой и очень низкой плотности), способствуют развитию атеросклеозов и инфарктов у человека, и, вероятно, животных.
Напротив, липопротеин высокой плотности (Lpr) является антирискфактором как для ишемической болезни сердца, так и для диабета, обладая обратным, чем липопротины низкой и очень низкой плотности, эффектом. Так, например, у свиней позитивных по Lpb3, Lpb8 обнаружено достоверно меньшее отложение жира в стенках аорты по сравнению с животными, обладающими геном аллотипа Lpi5 (Князев, 1982).
Помимо этого, установлено, что, участвуя в транзите и метаболизме липидов, липопротеины низкой плотности, в частности аллотип липопротеина низкой плотности - Lpb2, влияют на вкусовые качества сала и устойчивость свинины к прогорканию. Существуют целые группы животных, обладающих локусами групп крови Н, А и аллотипами сывороточной системы липопротеинов Lpb, мясо и сало которых отличается низким качеством (Buckley et al., 1989).
Кроме того, некоторые аллотипы системы липопротеинов Lpb являются породоспецифичными (Горелов и др., 2000).
Этот аспект проблемы изучался А. А. Новиковым совместно В. И. Ермолаевым (1996) на свиньях крупной белой и цивильской групп. Изучена частота встречаемости 25 аллотипов иммуногенетических систем липопротеинов. Отдельные антигенные варианты аллотипов Lp5, Lp4, Lp9, Lpr, Lp6 встречались у 7% животных, другие - Lpbl2, у 85 - 99%. Частота встречаемости аллотипов колеблется в зависимости от породы и популяции. Частота встречаемости Lp4 колеблется у крупной белой от значения 0,02 - по популяции эстонского корня, до значения 0,2 - популяция краснодарской селекции, у цивильской группы этот аллотип не встречается. Подобная картина наблюдается по аллотииам Lpb3. Была исследована связь аллотипов сывороточных белков с репродуктивными качествами свиноматок. По системе Lpb /j2 незначительные преимущества наблюдались по сохранности у свиноматок с аллелем Lpbl2 по сравнению с Lpb2 на 6%. По системе LpbS различий не наблюдалось (Юдина, 2002).
Другая группа исследователей (Яник и др., 1996) использовала аллотипы для изучения их взаимосвязи с мясными и откормочными качествами свиней. Было установлено статистически достоверное различие между сравниваемыми генотипами Lpb в массе вырезки (Lpb 3,5 - 0,325 кг., Lpb 4,5 - 0,393 кг.), массе окорока (Lpb 3,5 - 5,07 кг., Lpb 4,5 - 5,82 кг.) и высоте мышечного глазка длиннейшей мышцы спины (Lpb 3,5 - 4,22 см., Lpb 4,5 - 4,91 см.). Животные с генотипом Lpb 3,5 характеризовались более низкими показателями качества мяса туш в сравнении с генотипом Lpb 2,5; Lpb 2,7; Lpb 5,7.
Подводя итог, нужно сказать, что хотя исследований в области использования аллотипов в селекции свиней не так много, как работ по группам крови и полиморфным белкам, но и имеющийся материал говорит о том, что аллотипы являются важной характеристикой генетической структуры разных пород и популяций свиней, и, кроме того, маркерами продуктивных качеств.
Альфа-макроглобулины представляют собой разнообразную группу гликопротеинов - ингибиторов протеаз, присутствующих в плазме крови позвоночных и беспозвоночных животных, а также в белках яиц птиц и рептилий (Roberts, 1985; Osaka et а]., 1988). Большинство альфа-макроглобулинов (аМ2) - это тетрамеры с молекулярным весом -720 000 Да, состоящие из дисульфидно-связаниых димеров с молекулярным весом 360 000 Да (Hall et al., 1981; Sottrup-Jensen et al., 1984). Но некоторые представляют собой димеры (Von Schoults, Stigbrand, 1974) и даже мономеры (Lonberg-Holm et al., 1987). Молекула аМ2 свиньи состоит из четырех идентичных полипептидных цепей. Попарно эти цепи связаны дисульфидными мостиками, образуя димеры, которые, в свою очередь, нековалентными связями объединяются в нативную молекулу (рис. 2).
Получение и хранение биологического материала
Образцы используемых в работе аллоантисывороток любезно предоставлены научным сотрудником лаборатории разведения экспериментальных животных ИЦиГ М.А. Савиной. Аллоантисыворотки были получены иммунизацией, где реципиентами послужили самки и самцы свиней крупной белой породы, а донорами иммуногена - свиньи нескольких пород (Митичашвили и др., 1988). Все аллоантисыворотки-реагенты прошли Международные сравнительные испытания в 1987-1988 гг. (Ермолаев и др., 1990). В настоящей работе иммуногенетический полиморфизм сывороточных белков изучали с помощью 6 аллоантисывороток, выявляющих 12 антигенов, относящихся к 6 генетическим системам аллотипов. В системе альфа-макроглобулинов выявляли 3 антигена (аМ1, аМ2 и аМ5), в системе иммуноглобулинов {IgG) выявляли 1 антиген - lgG2b, в системе липопротеиыов низкой плотности - 2 антигена (ЬрЬЗ, ЬрЫ2\ системе липопротеинов высокой плотности - 1 антиген - Lprl. 6 аллотипов, принадлежность которых перечисленным иммуногенетический системам пока не установлена, обозначены нами Igl и Ig2 (системы Ig - глобулинов) и Lp, Lp3 и Lp9 (система липопротеинов).
Выделение ДНК из образцов крови осуществляли методом фенол-хлороформной экстракции по модифицированной методике (Смит и др., 1990). К образцу крови ( 10 мл) добавляли 5-6 объемов буфера А (ЮмМ трис-HCl, рН=7.5; 10 мМ NaCI; ЗмМ MgCl2) и гомогенизировали, растирая сгустки в гомогенизаторе Поттера. Осадки, полученные центрифугированием при 2500g, промывали дважды буфером А и ресуспензировали в 0.5 мл буфера В (10мМ ЭДТА; 100 мМ NaCI; 50мМ трис-HCl, рН=8.5). После добавления SDS до 0.5% и протеиназы К до 200 мкг/мл смесь инкубировали 2 часа при 65С, или в течение ночи при 37С. Депротеинизацию проводили последовательно водонасыщенным фенолом, смесью фенол - хлороформ (1:1) и, наконец, хлороформом. ДНК осаждали добавлением раствора ацетата аммония до 2.5М и 2.5 объема этанола. Осадок, полученный центрифугированием при 12000g в течение 10 минут, промывали 70% этанолом и растворяли в воде до концентрации ДНК 0.5 мкг/мкл. Дополнительную очистку некоторых образцов ДНК проводили переосаждением с ПЭГ (полиэтил енглико ль). Для этого добавляли 1 объем 20% полиэтилеигликоля 6000 с 2,5 М NaCI и инкубировали 30 мин. при 37С. Осадок, полученный центрифугированием в течение 15 минут при 12000g, двукратно промывли 75% этанолом. Концентрацию нуклеиновых кислот в анализируемых образцах ДНК определяли спектро фотометрически при длине волны 260 нм.
Праймеры, специфичные для последовательности гена env свиных эндогенных ретровирусов (PERV) разных типов, были синтезированы на основании данных литературы (Le Tissier et al., 1997; Akiyoshi et al. 1998; Takeuchi et al., 1998) (табл. 3).
Фрагменты нуклеотидных последовательностей эндогенных ретровирусов свиней, содержащие ген env PERV трех типов (А, В и С) были получены из базы данных Gen Bank (accession number PERV типа A -Y12238, PERV типа B-Y 12239 и PERV типа C-AF038600, соответственно) Для анализа гена PERV А ПЦР проводили в режиме: денатурация 3 мин при 95С; затем 33 циклов денатурация 1 мин при 95С, отжиг 1 мин при 61 С; синтез 1 мин при 72С; Для PERV типов В и С амплификацию проводили по следующей схеме: предварительное нагревание при 95С - 3 мин, далее 34 циклов: денатурация 45 сек при 95С, отжиг 45 сек при 63С; синтез 45 сек при 72С. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала: 0,5 мкг тотальной ДНК, по 1 мкМ праймеров, по 0,2мМ каждого из dNTP, буфер (75мМ Трис-HCl (рН 9,0), 3 мМ MgCl2, 20 мМ (NH4)2S04, 0,01% твин-20) и 1,25 ед. Taq-полимеразы.
Условия амплификации фрагментов ретровирусов были взяты из оригинальных работ с незначительными модификациями (Le Tissier et al., 1997; Akiyoshi et al. 1998; Takeuchi et al., 1998). Как видно из электрофореграммы (рис. 11), все использованные праймеры позволяли синтезировать специфичный фрагмент. Продукты амплификации оценивали электрофорезом в 4% ПААГ, окрашивание проводили бромистым этидием, длину фрагмента определяли сравнением с ДНК-маркерами («СибЭнзим» г. Новосибирск).
Влияние генотипа и среды на частоту носителей различных типов PERV у диких кабанов и домашних свиней
Анализ в пространстве двух главных компонент показал, что выборки одной породы, живущие в условиях разных хозяйств или местообитания, оказались в разных кластерах, в то же время как свиньи разных пород вошли в один кластер. Чтобы проанализировать возможное влияние генотипа и среды на встречаемость ретровирусов разного типа у домашних свиней и диких кабанов, была проведена оценка влияния факторов генотипа и среды на частоты носителей PERV в популяциях свиней. Для этого применили систему однофакторных дисперсионных комплексов, в которых в качестве факторов выступали выборка (совместное влияние генотипа и среды) (табл. 6), порода/подвид (влияние генотипа), условия окружающей среды (табл. 8), а в качестве результативного признака - частота PERV того или иного типа. Условия окружающей среды разделили на четыре класса: естественные (дикие кабаны); высокое соответствие зооветеринарным нормам на протяжении последних 20-ти лет (племенная ферма ОАО "Кудряшовское"); хорошее или удовлетворительное соответствие зооветеринарным нормам (ЗАО АПК "Иня" и учхоз "Тулинское); на протяжении последних 20-ти лет соответствие зооветеринарным нормам ниже среднего. Приведенные данные свидетельствуют (табл. 8) о равном участии наследственности и окружающей среды в формировании частот носителей всех трех типов PERV.
Из таблицы 8 следует, что дикие и домашние свиньи различаются по встречаемости трёх типов PERV. При сравнении критерием % этих двух совокупностей по каждому типу ретровируса и подсчете суммарного критерия у диких кабанов встречаемость всех типов ретровирусов ниже.
Анализ влияния породной принадлежности и условий среды на частоту носителей PERV проводили с помощью системы из трёх однофакторных дисперсионных комплексов. К сожалению, использование стандартного двухфакторного дисперсинного анализа в данном случае невозможно, поскольку каждое хозяйство, как правило, характеризуется специфическими племенными породами. В первом из комплексов градациями фактора выступают выборки как таковые. Таким образом, подразделение массива данных максимально и включает в себя одновременно подразделение по генетической (порода) и средовой (условия содержания или местообитания) компонентам изменчивости. Во втором комплексе градациями фактора являются породы, таким образом, подразделение проведено по генетической компоненте изменчивости. В третьем комплексе осуществлено подразделение по условиям окружающей среды (хозяйствам или местообитание), то есть по средовой компоненте изменчивости. В целом, система из трёх однофакторных дисперсионных комплексов даёт ряд уравнений, позволяющих определить относительный вклад генетических и средовых факторов в вариацию частоты носителей PERV. Введём следующие обозначения: Dy - общая девиата (сумма квадратов отклонений) дисперсионного комплекса; Ц. - факториальная девиата; Д. - девиата, обусловленная действием факторов, не учитываемых данным конкретным комплексом; De - девиата, обусловленная действием случайных (не учитываемых всей системой комплексов) факторов; Dnopoi)a - девиата по фактору порода; ОХ03ЯІІСШО - девиата по фактору условий среды (хозяйство/место обитания); Одшшодейсташ - девиата взаимодействия учитываемых факторов (породы/подвида, условий среды). Комплекс 1. В первом комплексе градациями фактора выступают выборки как таковые: подразделенность массива данных максимальна и включает одновременно подразделённость по генетической (порода, подвид) и средовой (место и условия содержания/обитания) компонентам изменчивости. В этом случае девиаты комплекса могут быть представлены следующим образом:
Примечание; сила влияния фактора (г}х) во всех случаях статистически значима (РО.001).
Влияние всех рассматриваемых факторов достоверно. Наибольшее влияние факторов наблюдается на вариацию частоты встречаемости env С, что очевидно связано с его низкой, по сравнению с другими, частотой в популяциях. Влияние породной принадлежности и условий содержания (обитания) на вариацию частоты ретровирусов и общее разнообразие приблизительно одинаковы (табл. 9).
