Содержание к диссертации
УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1. Однополые виды позвоночных. 9
1.1. Общая характеристика однополых позвоночных. 9
1.2 Способы размножения. 10
1.3. Цитогенетические механизмы однополого размножения. 12
2. Партеногенез у рептилий. 15
Происхождение и эволюция партеногенеза у рептилий. 16
Сетчатое видообразование у кавказских скальных ящериц рода Darevskia. 17
Клональное разнообразие у однополых видов рептилий. 17 2.4 Характеристика вида Darevskia unisexualis. 19
3. Молекулярно-генетические маркеры ДНК. 20
Типы молекулярных маркеров. 21 3.1.1 Маркеры индивидуальных локусов. 22 3.1.2.Маркеры множественных локусов. 24
Основные критерии отбора маркеров для генетических исследований. 25
4. Повторяющиеся последовательности генома эукариот. 25
Классификация тандемно повторяющихся последовательностей. 26
Микросателлитные последовательности. 27
Распространение микросателлитов. 28
Структура микросателлитов. 29
Неканонические структуры ДНК, образуемые микросателлитами. 29
Возникновение и эволюция микросателлитов. 30
Возможные функции микросателлитов. 32 4.2.6 Микросателлиты как генетические и геномные маркеры. 34
5. Генетическая нестабильность микросателлитных локусов. 35
Молекулярные механизмы нестабильности микросателлитных 36 последовательностей.
Модели мутационного процесса микросателлитов. 42
Частота микросателлитных мутаций. 44
Факторы, влияющие на частоту микросателлитных мутаций. 44
Подходы к изучению микросателлитных мутаций. 46
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 48
Биологический материал. 48
Выделение геномной ДНК. 48
Выделение ДНК из крови. 48
Выделение ДНК из эмбрионов и тканей. 50
3. Анализ геномной клонотеки D. unisexualts. 51
Скрининг геномной библиотеки на наличие микросателлитных 51 последовательностей.
Приготовление меченых зондов. 51
Гибридизация. 52
Получение радиоавтографов. 53
Выделение плазмидной ДНК. 53
Обработка плазмидной ДНК рестрикционными эндонуклеазами. 54
Электрофоретическое фракционирование фрагментов ДНК. 54
Перенос ДНК на мембрану. 55 3.9. Секвенирование рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей 55 микросателлитные последовательности.
4.Постановка локус-специфической полимеразной цепной реакции. 55
Подбор праймеров. 55
Подбор условий для амплификации. 56 4.2.1 Электрофоретическое фракционирование PCR-фрагментов ДНК. , 56 4.2.2. Перенос PCR-фрагментов ДНК на нейлоновую мембрану "Hybond N+". 56
Полимеразная цепная реакция. 57
5. Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ). 57
Приготовление 8% ПААГ. 57
Подготовка стекол. 57
Вертикальный электрофорез. 58
6. Элюция и секвенирование ДНК. 58
6.1 Элюция ДНК из агарозного геля на DEAE ватман. 58
6.2. Элюция ДНК из полиакриламидного геля. 59
6.3 Переклонирование продукта ПЦР в плазмиду. 59
6.3.1 рК реакция. 59
6.3.2. Лигирование. 59
Трансформация. 60
Выделение трансформированных клеток. 60
6.4 Секвенирование и анализ PCR-продуктов. 61
РЕЗУЛЬТАТЫ 62
1. Изучение структурной организации и полиморфизма микросателлит 62
содержащих локусов у D.unisexualis и двуполых родительских видов D. raddei
(nairensis) и D.valentinL
Получение и молекулярная характеристика рекомбинантных клонов партеновида 62 D. unisexualis содержащих микросателлитные кластеры.
Анализ популяций D. unisewxdXis по локусам Du47, Du418, Dul61, Du222 и 62 Du334.
Анализ внутри- и межпопуляционного полиморфизма локусов Du47, Du418 и 64 Dul61 у двуполых родительских видов D. raddei (nairensis) и D.valentini.
Первичная структура ДНК аллельных вариантов локусов Dn47, Du418 и Dul61 у 65 D.unisexualis.
Первичная структура ДНК локуса Du47 у двуполых родительских видов D. 68 raddei (nairensis) и D.valentini.
2. Выявление и молекулярная характеристика de-novo мутаций в (GATA),, 70
содержащих локусов у партеногенетических потомков D.unisexualis.
Монолокусный PCR-анализ анализ локусов Du281 и Du215 на панели семейных 71 образцов D. armeniaca.
Монолокусный PCR-анализ локусов Du281 и Du215 на панели семейных 71 образцов D.unisexualis.
Молекулярная характеристика мутантных аллелей у потомков D.unisexualis. 72
3. Сравнительный анализ (GATA)n- содержащих локусов Du281 и Du47 у 75
различных двуполых видов рода Darevskia.
Полиморфизм двуполых видов рода Darevskia по локусу Du281. 75
Полиморфизм двуполых видов рода Darevskia по локусу Du47. 11
Секвенирование аллельных вариантов локуса Du281 у ряда представителей 78 двуполых видов рода Darevskia.
Секвенирование аллельных вариантов локуса Du47 у ряда представителей 81 двуполых видов трот Darevskia.
Структурные взаимоотношения аллельных вариантов локуса Du281 у разных 83 видов рода Darevskia
Структурные взаимоотношения аллельных вариантов локуса Du47 у разных 84 видов рода Darevskia
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 85
выводы юі
БЛАГОДАРНОСТИ 126
УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ
DEAE - ионообменная нитроцеллюлозная мембрана с диэтиламиновой функциональной
группой
dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate) - дезоксинуклеотидтрифосфат
GF/C-фильтр - стеклянный фильтр Ватман (градуировка С)
LINE (Long Interspersed Repeats) - длинные диспергированные повторы
LTR (Long Terminal Repeats) — длинные концевые повторы
NET-буфер — солевой буфер для элюции, в состав которого входят NaCl, ЭДТА, Трис
PCR (Polymerase Chain Reaction) - Полимеразная Цепная Реакция (ПЦР)
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) - Додецил сульфат натрия
SINE (Short Interspersed Repeats) - короткие диспергированные повторы
SMM (Stepwise Mutation Model) - одноступенчатая модель микросателлитных мутаций
SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) - однонуклеотидный полиморфизм
SSC (Sodium Saline Citrate) -натрий- цитратный буферный раствор
ТХУ - Трихлоруксусная кислота
VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) - вариабельные тандемные повторы
ПААГ - полиакриламидный гель
ТВЕ-буфер - Трис-ЭДТА-боратный буфер (ТБЭ-буфер)
ТЕ-буфер - Трис-ЭДТА буфер (ТЭ-буфер)
ТЕМЕД - КД^,М',М'-тетраметилэтилендиамин
ЭДТА (EDTA) - Динатриевая соль этиледиаминтетрауксусной кислоты (Disodium Salt:
Dihydrate)
Введение к работе
Партеногенетические позвоночные благодаря особенностям системы размножения образуют линии генетически идентичных животных и поэтому являются уникальными модельными организмами для различных биологических, экологических, эволюционных и молекулярно-генетических исследований. В частности, они могут быть использованы для изучения генетической нестабильности гипервариабельных ДНК, причин и механизмов, приводящих к ее появлению. Для большинства однополых позвоночных установлено, что они возникают в результате межвидовой гибридизации изменяющей цитологические механизмы их репродукции [Dawley, 1989; Vrigenhoek, 1994]. Их популяции состоят из самок, размножающихся клонально. Даули [Dawley, 1989] сформулировал две наиболее важные проблемы в исследовании клональных видов позвоночных: выяснение цитологических механизмов клонального размножения и определение причин внутри и межпопуляционного клонального разнообразия.
Кавказские скальные ящерицы рода Darevskia (ранее принадлежащие к роду Lacerta [Arribas, 1999]) представлены в Закавказье и соседних районах Турции восемнадцатью бисексуальными и семью партеногенетическими видами. Все партеногенетические виды рода Darevskia имеют гибридное происхождение, характеризуется диплоидным набором хромосом, невысоким уровнем гетерозиготносте аллозимных локусов [Fu et al, 1998] и незначительной вариабельностью сайтов рестрикции митохондриальной ДНК [Moritz et al., 1992]. Ранее проведенные ДНК-фингерпринтные исследования Кавказских скальных ящериц рода Darevskia выявили значительный уровень популяционной неоднородности особей по отдельным микросателлитным маркерам ДНК [Кан и др., 1998; Токарская и др., 2000]. Популяционной разнообразие однополых видов принято объяснять мутациями, множественным гибридным происхождением и возможной незаконной рекомбинацией [Parker and Selander, 1976; Parker, 1979; Cole et al., 1988; Moritz et al., 1989; Fu et al., 2000].
Однако степень влияния каждого из этих факторов на уровень генетической вариабельности остается неясным. Более того, практически нет данных о природе мутаций и их вкладе и в геномное и клональное разнообразие однополых позвоночных. Наиболее простой путь для выявления мутационной составляющей это прямое изучение мутационных событий в родословных, например при сравнении геномов матери и потомков. ДНК-фингерпринтный анализ семей партеногенетических ящериц показал, что в геноме D. unisexualis и D. armeniaca существуют нестабильные локусы, изменчивость в которых приводит к разнообразию ДНК-фингерпринтных фенотипов у потомков и в популяциях [Токарская и др., 2003, Malysheva et al, 2007]. Однако что лежит в основе наблюдаемых изменений - мутации в сайтах рестрикции, изменение длины микросателлитного кластера или мутации в участках ДНК, прилежащих к микросателлитному кластеру остается неясным. Поэтому необходимо проведение молекулярно-генетических исследований индивидуальных микросателлитсодержащих локусов в популяционных и семейных образцах ДНК, что позволит определить структуру аллельных вариантов локусов, молекулярную природу и механизмы возникновения микросателлитных мутаций у клонально размножающихся животных.
Целью настоящей работы является изучение структурной организации и полиморфизма микросателлитных локусов генома, поиск и характеристика мутаций по этим локусам у партеногенетических ящериц Darevskia unisexualis и Darevskia armeniaca, а также у ряда двуполых видов рода Darevskia. Для выполнения этой работы были поставлены следующие задачи:
Выделение и характеристика рекомбинантных клонов, содержащих (GATA)n, (ТСС)П и (ТСТ)П микросателлиты из геномной библиотеки D.unisexualis.
Молекулярно-генетический анализ микросателлитсодержащих локусов у D.unisexualis и двуполых родительских видов D. raddei (nairensis) и D.valentini.
Поиск и характеристика de-novo мутаций полиморфных локусов на больших выборках семейных образцов D.unisexualis и D. armeniaca.
Молекулярно-генетическая характеристика и сравнительный анализ вариабельных микросателлитсодержащих локусов у ряда представителей двуполых видов рода Darevskia.
