Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы
1.1 Геном эукариот. Структура и характеристика генома эукариот 8
1.1.1 Уникальные последовательности генома эукариот 9
1.1.2 Умерено повторяющиеся последовательности генома эукариот 11
1.1.3 Часто повторяющиеся последовательности генома эукакриот 14
1.2 Микросателлитные последовательности ДНК 15
1.2.1 Определение и классификация микросателлитов 15
1.2.2 Роль и функции микросателлитов 16
1.2.3 Механизмы нестабильности микросателлитов 20
1.3 Термодинамический аспект структурной организации генома эукариот. Изохоры. CpG-островки 24
1.4 Вариабельность генома и генетико-популяционные исследования 30
1.4.1 Маркеры в генетических исследованиях: роль, свойства и классификация 30
1.4.1.1 Биохимические маркеры 31
1.4.1.2 ДНК-маркеры 32
1.4.1.2.1 Маркеры на основе ПДРФ 32
1.4.1.2.2 Маркеры, основанные на ПЦР 34
1.4.1.2.2.1 Мономорфные ДНК-маркеры 34
1.4.1.2.2.2 Полиморфные ДНК-маркеры 35
1.4.2 Математическое моделирование генетико-популяционных процессов 39
1.4.2.1 Классификация математических моделей в биологии, классы задач и математический аппарат 40
1.4.2.2 Математическое моделирование генетических процессов на популяционном и видовом уровнях 42
1.5 Однополые виды позвоночных животных и их популяции 44
1.5.1 Общая характеристика вида Darevskia unisexualis 44
2 Материалы и методы 46
2.1 Выделение ДНК из крови 46
2.2 Анализ нативности ДНК 47
2.3 Анализ ДНК на спектрофотометре 47
2.4. Анализ геномной клонотеки D. unisexualis 47
2.4.1 Скрининг геномной библиотеки на наличие (TG)n -
последовательностей 47
2.4.1.1 «Колони» - гибридизация 47
2.4.1.2 Приготовление (TG)9 -зонда 47
2.4.1.3 Гибридизация 48
2.5 Выделение плазмидной ДНК 48
2.6 Рестрикция плазмидной ДНК, электрофорез рестрикционных фрагментов в агарозном геле, блоттинг, блот-гибридизация
2.7 Секвенирование рекомбинантной ДНК, содержащей (TG)n -последовательности. Постановка вычислительного эксперимента
2.8 Постановка полимеразной цепной реакции (ПЦР) 52
2.8.1 Подбор праймеров 52
2.8.2 Подбор условий для ПЦР 52
2.9 ПЦР-анализ .- 52
2.9.1 Подготовка стекол 52
2.9.2 Приготовление 8 % полиакриламидного геля (ПААГ) для нативной ДНК и 6% геля ПААГ для денатурированной ДНК 53
2.9.3 Заливка ПААГ «накатом» 53
2.9.4 Электрофорез нативной ДНК и денатурированной ДНК в ПААГ 53
3 Результаты 55
3.1 Получение и характеристика рекомбинантных клонов, содержащих (ТО)п-микросателлиты, из геномной клонотеки D. unisexualis . 55
3.2 Анализ изменчивости микросателлитных локусов у партеновида D.unisexualis 56
3.3 ПЦР-анализ локусов, гомологичных Dul83, Du214, Du231, Du255 и Du365, у двуполых родительских видов Darevskia raddei и Darevskia valentini 60
3.4 Сравнительный анализ биохимических и физико-химических характеристик микросателлитных локусов генома D.unisexualis 63
5 Математическое моделирование и анализ закономерностей распределения частот аллелей вариабельных локусов в популяциях D.unisexualis. Разработка математической модели для характеристики генофонда однополых видов 88
4 Обсуждение результатов 94
1 Полиморфизм микросателлитсодержащих локусов генома у различных однополых и двуполых видов рода Darevskia 94
2 Интерпретация результатов биохимического и физико-химического анализа в приложении к исследованиям вариабельных участков генома 97
3 Сравнительный анализ, практика и перспективы применения предложенной математической модели 104
5 Выводы 109
Список литературы
- Геном эукариот. Структура и характеристика генома эукариот
- Термодинамический аспект структурной организации генома эукариот. Изохоры. CpG-островки
- Анализ ДНК на спектрофотометре
- Получение и характеристика рекомбинантных клонов, содержащих (ТО)п-микросателлиты, из геномной клонотеки D. unisexualis
Введение к работе
Молекулярные механизмы и характеристика процессов нестабильности генома являются наиболее актуальными вопросами молекулярной биологии и биохимии нуклеиновых кислот. Микросателлитные последовательности ДНК выступают как один из факторов подобной нестабильности. Микросателлиты представляют собой тандемные повторы ДНК с размером мономерного звена от 2 до 6 нуклеотидов. Микросателлитный кластер занимает в среднем от 20 до 60 пар нуклеотидов (за исключением экспансии триплетных повторов, наблюдаемой при некоторых наследственных болезнях человека [Гайцхоки с соавт., 2000]). Микросателлиты имеют высокие скорости мутирования от 10" до 10 в зависимости от типа микросателлита [Ellcgren, 2004], что приводит к накоплению популяционно-специфических мутаций и позволяет использовать информацию об изменчивости микросателлитных локусов для анализа структуры популяций [Rosenberg et al., 2002]. Тамдемные повторы в целом PI микросателлитные последовательности ДНК в частности наделяются рядом исследователей важной ролью в функционировании генома на биохимическом, молекулярном и субклеточном уровнях [Зимницкий с соавт., 2005]. В настоящее время к наиболее изученным относятся микросагеллиты человека, ряда животных и растений [Neff et al., 2001; Животовский, 2006]. В то же время, однополые виды животных с клональным типом размножения остаются все еще малоизученными как с точки зрения молекулярной биологии и биохимии ДНК, так и с точки зрения генетической изменчивости [Tokarskaya et al., 2001]. Уникальной природной моделью для проведения исследований по характеристике и анализу микросателлитных последовательностей ДНК является облигатно-партеногенетический вид кавказских скальных ящериц Darevskia unisexualis [Arribas, 1999], который имеет гибридное происхождение от родоначальных двуполых видов D. raddei и D. valentini. Среди всего спектра микросателлитных последовательностей особое значение имеют динуклеотидные микросателлиты, которые не только наиболее широко представлены в геноме эукариот [Sharma et al., 2007], но и являются наиболее эволюционно-консервативными генетическими маркерами ДНК.
Важным представляется характеристика полиморфных динуклеотидных микросателлитных участков генома на уровне первичной структуры молекулы ДНК. Подобные исследования становятся все более актуальными для геномов многих позвоночных животных, однако проводятся лишь в очень незначительной степени для геномов партеногенетических видов в целом и ящерицы D. unisexualis в частности. Мутационные изменения, затрагивающие размеры микросателлитных кластеров и число микросателлитных звеньев, изменяют такие важные молекулярно-биологические и биохимические характеристики как нуклеотидный состав, GC-содержание локусов, энергия Гиббса образования ДНК/ДНК-дуплекса, соотношение молекулярных масс 5 -3 и 3 -5 последовательностей. Количественная оценка подобных параметров характеризующих и объясняющих направление и интенсивность биохимических реакций и взаимодействий при формировании вторичной структуры, репликации и репарации молекулы ДНК поможет в дальнейшем раскрытию глубинных биологических закономерностей на различных уровнях организации живого.
Практическая ценность исследования микросателлитных участков ДНК заключается в том, что на основе анализа вариабельности и распространенности аллельных вариантов данных локусов в популяциях выделяются последовательности применимые в качестве генетических маркеров. Однако, распространенные математические модели в большинстве своем адаптированы для исследований популяций двуполых видов и не приспособлены для популяций партеновидов [Петросян с соавт., 2003]. В связи с этим, актуальной представляется разработка и реализация математической модели, количественно определяющей вклад популяций в генофонд партеногенетических видов и раскрывающая генетико-популяционную структуру партеновида. Данные количественные оценки могут быть широко применимы в работе по охране редких» видов позвоночных животных в целом и партеновида D. unisexualis в частности.
В связи с этим, цель данной работы - получение и молекулярная характеристика локусов, содержащих микросателлитные динуклеотидные последовательности генома партеногенетической ящерицы D. unisexualis, для оценки их изменчивости и вклада в генетическое разнообразие партеновидов.
Для достижения указанной цели в данной работе решались следующие задачи:
1) поиск вариабельных динуклеотидных микросателлитных последовательностей ДНК ге н ома D. ип isexualis;
2) определение молекулярной природы микросателлитных локусов в популяциях D.unisexualis;
3) исследование биохимических и молекулярно-биологических параметров микросателлитных последовательностей ДНК и их аллельных вариантов для характеристики и формализации процессов изменчивости молекулы ДНК;
4) разработка и применение системы количественной оценки вариабельности микросателлитных последовательностей ДНК как генетических маркеров для оценки внутри- и межпопуляционных закономерностей у партеновида/).unisexualis.
Геном эукариот. Структура и характеристика генома эукариот
Содержание уникальных нуклеотидных последовательностей (НП), встречающихся только один раз в геноме эукариот, варьирует у разных организмов и составляет от 15 до 98% всей ДНК [Патрушев с соавт., 2007]. Хотя во фракцию уникальных НП попадают многие структурные гены, большая их часть является некодирующей. Хорошо известным примером уникальных НП являются интроны, общий размер которых, как правило, превышает суммарный размер экзонов соответствующих генов. Интроном называют транскрибируемый участок гена, последовательность которого отсутствует в зрелой РНК и удаляется из предшественника РНК разными механизмами. Зрелая РНК составлена последовательностями экзонов гена. Мозаичная экзон-интронная структура генов обнаружена у представителей большинства таксономических групп современных биологических видов [Roy et al., 2006]. В соответствии с современной классификацией интроны разделяют на четыре основных класса, которые различаются по механизмам удаления из предшественников мРНК [Rodriguezrelles et al., 2006]. Обладание нитронами 4-го класса, вырезаемыми из молекул РНК под действием сплайсинга (иногда их называют сплайсинговыми или сплайсомными нитронами), является- исключительной прерогативой эукариотических организмов. Плотность интронов в эукариотических геномах (количество интронов на один ген) у разных видов эукариот различается более чем в 1000 раз. В частности, в геноме человека, наиболее богатом нитронами, обнаружено -140 000 интронов. (8,4 интрона/ген), тогда как геном микроспоридии Encepalitozoon cuniculi содержит всего 13 интронов (0,0065 интрона/ген). Более того, как и в случае размеров эукариотических геномов в целом, отсутствует корреляция между плотностью интронов, их локализацией в геноме и филогенетическими характеристиками биологических видов. Отмечено, что у человека гены «домашнего хозяйства», то есть экспрессирующиеся в клетках большинства тканей, имеют меньшую длину в кодирующей и некодирующей частях, чем гены «роскоши» специализированных тканей, что не свойственно, например, Arabidopsis thaliana и Drosophila melanogaster [Vinogradov, 2004]. Причины компактности генов «домашнего хозяйства», среди которых безинтронными являются, в частности, гистоновые гены и большая часть генов рецепторов, сопряженных с G-белками, остается неизвестной.
Еще одним классом уникальных НП эукариотического генома являются псевдогены. Псевдогенами называют НП ДНК, которые являются чаще всего неактивными копиями исходных генов, измененных мутациями. Одна из разновидностей таких НП составлена процессированньши псевдогенами, в которых отсутствуют интроны гена-предшественника. Предполагается, что процессированные псевдогены возникают путем интеграции в геном кДНК, образовавшейся в результате обратной транскрипции соответствующей мРНК, претерпевшей полный сплайсинг. При этом встраивание кДНК могут обеспечивать гены автономных ретротранспозонов. Содержание псевдогенов у представителей разных таксономических групп значительно различается. Больше всего псевдогенов найдено у человека (3600-19000), причем они рассеяны по всему геному, и их число в отдельных хромосомах коррелирует с размером последних [Патрушев с соавт., 2007]. В отличие от бактерий, псевдогены которых подвергаются быстрой дегенерации, эукариотам свойственно меньшее давление отбора, направленное- на элиминацию псевдогенов. Вопрос о роли псевдогенов в геноме является предметом дискуссий. В некоторых случаях продемонстрирована их функциональная значимость [Патрушев с соавт., 2007]. Имеются указания на возможное участие антисмысловых РНК псевдогенов в регуляции транскрипции. Предполагается участие псевдогенов в иммунном ответе человека и животных, причем для птиц это уже доказано. Псевдогены необходимы для. формирования генов обонятельных рецепторов человека. Многие псевдогены эукариот высоко консервативны и активно транскрибируются, а некоторые могут быть активированы точковыми мутациями.
Генные семейства состоят из многих генов, для которых характерна высокая гомология кодирующих (а в ряде случаев и некодирующих, интронных) НП. Предполагается, что в основе их происхождения лежат дупликации генов-предшественников или целых генетических локусов. В совокупности гены, объединенные общностью происхождения через дупликации генов-предшественников, называют парологами. Гены с идентичными НП, организованные в виде кластеров или рассеянные по геному, обеспечивают повышенные потребности клеток в продуктах их экспрессии. К таким генам у эукариот относятся, в частности, гистоновые гены, а также гены рРНК, тРНК и небольших ядерных (ня)РНК. Кроме того, функционирование генов мультигенных семейств контролирует формирование систем распознавания различных сигналов. В этой связи самое большое из известных генных семейств позвоночных животных составлено генами и псевдогенами обонятельных рецепторов. У человека и мыши их число составляет 800 и 1400, соответственно, причем псевдогены составляют соответственно 60% и 25%. Большими семействами представлены гены главного комплекса гистосовместимости и вариабельных частей иммуноглобулинов.
Умерено повторяющиеся НП генома эукариот представлены микро-, мини-, макросателлитами и многочисленными мобильными генетическими элементами (транспозонами). Поскольку нативные транспозоны также содержат конкретные гены, обеспечивающие их выживаемость в геноме, разделение умеренно повторяющихся НП на две вышеупомянутые группы условно и подчеркивает тот факт, что функциональная значимость транспозонов для эукариотического генома в настоящее время не вполне понятна [Biemont et al., 2006].
Мобильные генетические элементы представляют собой НП ДНК, способные изменять свое положение в геноме, то есть совершать акты транспозиции. Хотя официально признанная классификация транспозонов в настоящее время отсутствует, на основании молекулярных механизмов, используемых мобильными генетическими элементами для перемещения в геноме, их разделяют на два больших класса: ретроэлементы и ДНК-транспозоны.
ДНК-транспозоны типичны для генома бактерий и достаточно широко представлены в геномах эукариот. Их транспозиция осуществляется, как правило, по механизму вырезания и вставки (cut and paste) с участием транспозазы - хорошо изученного фермента класса рекомбиназ [Berger, 2002]. Реализация данного механизма приводит к дупликации (удвоению) короткой НП в сайте интеграции транспозона. При этом новое место интеграции мобильного элемента, как правило, находится недалеко от старого, и, в соответствии с этим, процесс перемещения ДНК-транспозонов получил название «локальных прыжков» (local hopping) [Carlson et al., 2005].
Ретроэлементы, в отличие от ДНК-транспозонов, используют для своей мобилизации механизмы, в которых важную роль играет обратная транскрипция — синтез ДНК на матрице РНК обратной транскриптазой. На основании особенностей структуры и механизмов репликации ретроэлементы, в свою очередь, разделяют на две большие группы [Патрушев с соавт., 2007]: LTR-содержащие ретроэлементы, включающие ретротранспозоны и эндогенные ретровирусы, и ретроэлементы, не содержащие LTR, составленные из длинных (LINE) и коротких (SINE) диспергированных элементов. У этих мобильных генетических элементов реализация акта транспозиции требует транскрипции их геномной НП, обратной транскрипции образовавшейся мРНК и интеграции кДНК в новый генетический локус (механизм «копирования и вставки» - copy and paste).
Термодинамический аспект структурной организации генома эукариот. Изохоры. CpG-островки
Наряду со структурной классификацией частей генома эукариот, представленной нами на рис.1, в рамках молекулярной биологии и биохимии среди структурных единиц и подразделений генома выделяют функциональные кластеры, обусловленные термодинамическими свойствами» нуклеотидных последовательностей. Нуклеотидный состав позволяет ученым произвести классификацию изучаемых локусов генома, а интегральные термодинамические параметры этих локусов позволяют выявить возможные пути и направления изменчивости данных участков генома на уровне нуклеотидной последовательности молекулы ДНК.
Когда геномная ДНК позвоночных случайным образом режется на фрагменты длиной 30-100 т.п.н., и эти фрагменты затем разделяются согласно нуклеотидному составу, они кластеризуются, образуя небольшое число классов, различающихся друг от друга по GC-содержанию. Каждый класс характеризуется линиями ("бэндами") сходного, хотя и не абсолютно одинакового состава [Costantini et al., 2006]. Присутствие в эукариотическом геноме дискретных, протяженных (сотни т.п.н.), высокогомогенных по
GC-составу участков, называемых изохорами, по-видимому, является одним из фундаментальных принципов его организации на уровне первичной структуры [Eyre-Walker et al., 2001]. Композиционное распределение фрагментов ДНК в значительной степени независимое от размера самого фрагмента, демонстрирует гомогенность состава протяженных участков ДНК.
Изохоры разделяют на несколько «легких» и «тяжелых» семейств (в зависимости от процентного содержания G + С оснований) [Fullerton et al., 2001]: 1. изохоры семейств L1 и L2 - 40% 2. изохоры семейства HI - 47%, 3. изохоры семейства Н2 - -52%, 4. изохоры семейства НЗ - 52%.
Хотя размеры генома многоклеточных эукариот гораздо больше, чем у прокариот, вариация в GC-содержании среди них весьма невелика. Одной из причин этого явления может быть то, что позвоночные, в отличие от бактерий, дивергировали не столь давно и не имели достаточно времени для накопления значительных различий в GC-содержании.
Несмотря на такое сходство в GC-содержании, геном позвоночных имеет гораздо болеесложныйкомпозиционный состав.
Существуют заметные различия в композиционной организации между геномами1 тепло- и холоднокровных позвоночных [Bernardi et al., 2007]. В геномах теплокровных существуют две легких компоненты (L їй ІУ ), в которые входит около 2/3 генома, и две или три тяжелых компоненты (Hi , Но и Нз ), составляющих остаток геномной ДНК. Геномная же ДНК холоднокровных состоит, в основном, из легких компонент.
Открытие того, что геном теплокровных имеет мозаичное строение, согласуется с данными по изучению дифференциальной окраски хромосом. Метафазные хромосомы теплокровных после воздействия флуоресцентных красителей, протеолитических ферментов или различных денатурирующих агентов, окрашенные по Гимзу, демонстрируют различные темные и светлые полосы (т.н. G - и R - bands) . Однако, метафазные хромосомы холоднокровных позвоночных демонстрируют либо слабую дифференцировку по яркости, либо вообще не проявляют различий. Исходя из этого, было выдвинуто предположение о том, что GC-богатые и GC-бедные изохоры приблизительно соответствуют G - и R -"бэндам" [Costantini et al., 2006]. Данные о времени репликации показывают, что гены, локализованные в GC-богатых изохорах, реплицируются в начале клеточного цикла, тогда как гены, локализованные в GC-бедных изохорах, реплицируются ближе к концу [Schmegner et al., 2007].
Можно говорить о существовании в геноме эукариот структур иерархического порядка. Примером служат изохоры в геноме человека - длинные, в среднем свыше 300 т.п.н. сегменты ДНК, гомогенные по композиции оснований или по GC-уровням. 62% генома состоит из GC-бедных изохор, в них локализовано около 34% генов. 31 % генома представлен GC-богатыми изохорами, содержащими 38% генов, и в 3% изохорах, обогащенных GC-последовательностями (так называемых НЗ изохор), находится 28% генов [Vinogradov et al., 2005].
Таким образом, существуют относительно небольшие участки ДНК, в которых плотность генов в 10-20 раз выше, чем в остальных последовательностях.
В GC богатых изохорах локализовано большое количество CpG-островков -последовательностей от 500 до 2000 п.о., характеризующихся очень высоким содержанием гуанина и цитозина (G+C более 60%), представленных в виде кластеров неметилированных CpG-дуплетов и так называемых G/C-боксов - локусов, родственных сайту узнавания для одного из транскрипционных факторов Spl - (G)4C(G)4C [Oliver et al., 2002]. CpG-островки содержат много сайтов узнавания для чувствительной к метилированию эндонуклеазы НраІІ , а также сайты для редкощепящих рестриктаз, узнающих неметилированные CpG-дуплеты. В частности, более 80% Nor 1-сайтов связано с CpG-богатыми островками.
Характерным свойством CpG-островков является их локализация вблизи структурных генов, преимущественно в их 5 -участках (регуляторные последовательности, промоторы, последовательности первого экзона) [Haiminen et al., 2007]. Например, анализ полностью расшифрованных к настоящему моменту нуклеотидных последовательностей хромосом 21 и 22 человека [Oliver et al., 2004] подтверждает это общее положение. Формальные признаки CpG-островков (присутствуют в промоторных зонах примерно 60% генов человека): 1. размеры от 0,5 до 5 тыс. пар оснований (т.п.н.) (в среднем 1 т.п.н.); 2. встречаемость примерно 1 на 100 т.п.н.; 3. обычное (т.е. соответствующее расчетному 1:16) содержание динуклеотида CpG; 4. С + G превышает 60%; отношение CpG/GpC не менее 0,6.
За несколькими известными исключениями CpG-островки не метилированы во всех типах тканей независимо от экспрессии соответствующего гена. С этой точки зрения важен вопрос о пространственной соотнесенности структурных генов и CpG-островков. Примерные расчеты свидетельствуют о том, что свыше половины генов, составляющих функционирующий геном человека содержат CpG-островки: они имеются, по-видимому,
у всех генов, выполняющих базовые клеточные функции (генов домашнего хозяйства), и у примерно 40% генов, выполняющих специализированные функции. Значительная часть тканеспецифических генов не имеет в своих промоторах CpG-островков: вместо них могут присутствовать" одиночные CpG-динуклеотиды. Наибольшая плотность CpG-островков наблюдается в теломерных участках хромосом 1, 9, 15, 16, 17, 19, 20, 22 [Duret et al., 2002]. Точные молекулярные методы регистрации CpG-островков показали, что их число в геноме человека приближается к 45 000 [Galtier, 2003].
В геноме человека и других теплокровных в изохорах посредством гибридизации с соответствующими пробами был локализован целый ряд генов [Bernardi, 2000]. Эти исследования подтвердили неслучайность распределения генов по геному, причем большинство из них располагается в самой тяжелой из компонент (Нз), в состав которой входит всего 3%-5% генома.
В большинстве случаев ген входит во фрагмент ДНК, имеющий сходное с ним GC-содержание. Данный факт является независимым доказательством существования изохор и их огромных размеров. Действительно, поскольку фрагменты ДНК, используемые при исследовании, были получены случайной деградацией, точный состав фрагментов, содержащих гены, демонстрирует, что они очень гомогенны в нуклеотидном содержании на дистанции примерно в два раза превышающей длину самих фрагментов (т.е. на длине около 200 т.п.н.).
Анализ ДНК на спектрофотометре
На чашку с LB -агаром (тетрациклин и ампицилин) помещали заранее разлинованный и обозначенный цифрами фильтр «Hybond N», на который стирильными типами «перекалывались» колонии клеток, содержащие рекомбинантную плазмиду. Инкубация осуществлялась в течение ночи при 37С. Фильтр денатурировали в буфере состава: NaCI - 1.5 М, NaOH - 0.5 М, а затем промывали в нейтрализующем буфере (NaCI - 1.5 М, трис-НС1 - 0.5 М). После чего фильтр промывали 2х раствором SSC (NaCI - 0.3 М, цитрат Na - 0.03 М), сушили и «запекали» на трансиллюминаторе (УФ).
В экспериментах использовали олигонуклеотид (TG)g. Олигонуклеотид метили по 5" концу в киназной реакции [Маниатис Т. с соавт., 1984] при помощи Т4-полинуклеотидкиназы. Реакционная смесь состояла из 2 мкл олигонуклеотида (0.005 о.е.), 4,5 мкл воды, 1,5 мкл 10х киназного буфера (состав 10х буфера: 0.7М трис-HCl рН 8.0, 0.1М MgCb, 50mM DTT), 5 мкл [у32 Р]- dATP (50 мкКи), Т4-полинуклеотидкиназа - 2 мкл (50 ед. акт.). Смесь (15 мкл) инкубировали 40 минут при 37С. После реакции мечения объем реакционной смеси доводили водой до 50 мкл. Очистку олигонуклеотидного зонда проводили на колонке с биогелем Р4 («BioRad») [ Маниатис Т. с соавт., 1984]. Колонку заполняли биогелем при определенном режиме центрифугирования (10 мин при 1500 об/мин), а затем через нее с помощью центрифугирования (10 минута при 1500 об/мин) пропускали 50 мкл реакционной смеси.
Включение метки контролировали с помощью минимонитора до и после процедуры очистки. Процент включившейся в ДНК метки определяли как отношение оставшейся после очистки метки к исходному ее количеству.
Гибридизацию проводили с меченным по [32Р] (ТО)9-олигонуклеотидным зондом в стандартном буфере состава: 6xSSC, 5 мМ ЭДТА, 0,2 % SDS, 5х раствора Денхардта (0,2 % поливинилпирролидон, 0,2 % фиколл, 0.2 % бычий сывороточный альбумин ("Sigma")). Для олигонуклеотидов температуру отжига рассчитывали по формуле То=Тт-5С Тт определяли согласно Сейну и со авторам, прибавляя по 2С на каждый А или Т и по 4С на каждый G или С.
Предгибридизацию проводили в течение 1 часа в 30 мл гибридизационного буфера при температуре 50С, гибридизацию - в 5-10 мл буфера при концентрации метки 10 млн. , им./мин на 1 мл смеси, при 49С в течение ночи. Фильтры отмывали в 2xSSC - 0.1 % SDS по 20 минут, при трехкратной смене буфера. Затем фильтр промывали в 2х растворе SSC, слегка подсушивали и заворачивали в пленку («Paclan»).
Фильтр закладывали с рентгеновской плёнкой на экспозицию в течение ночи. Проявляли радиоавтограф и отбирали колонии, дающие положительный сигнал гибридизации.
Отдельную колонию E.coli, содержащую рекомбинантную плазмиду, высевали в 10 мл LB среды и инкубировали на качалке при 200 об/мин и 37С в течение ночи. Затем культуру клеток центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин. Осадок клеток суспендировали в 300 мкл воды. Суспензию клеток охлаждали в ледяной бане (0С).
Затем к суспензии добавляли 450 мл лизирующего буфера № 2 следующего состава: 1 % SDS, 0.2 N NaOH. Смесь инкубировали в ледяной бане в течение 5 минут.
Выравнивали уровень рН добавлением 600 мкл З М раствора ацетата калия (рН 5.0). Содержимое клетки осаждали центрифугированием при 14000 об/мин в течение 20 минут. Супернатант переносили в новые пробирки и добавляли 2V охлажденного изопропанола (-20С). Центрифугировали при 14000 об/мин в течение 20 минут, супернатант сливали, осадок промывали раствором 75 % этанола, высушивали при 37С, растворяли в 150 мкл воды. Затем добавляли 300 місі 7,5 М NH4AC и инкубировали при -20С 30-40 минут. Далее смесь центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10-15 минут, переносили супернатант в новые пробирки и добавляли 2 объема сильно охлажденного 96 % этанола и повторяли центрифугирование с охлаждением при 14000 об/мин в течение 10-15 минут. Супернатант сливали, а осадок промывали 75 % раствором этанола, высушивали при 60 С, растворяли в 30 мкл воды. Затем добавляли РНКазу до концентрации 50-100 мкг/мл. Смесь инкубировали в термостате при температуре 37С в течение 1 часа. После инкубации в смесь добавляли воду до 200 мкл и 4М раствор ацетата натрия до концентрации 0,5 М, плавно перемешивали и добавляли фенол (насыщенный 1М трисом-НС1, рН 8.0 ) в объемном, соотношении 1:1. Депротеинизацию фенолом проводили в течение 10 минут. Фазы разделяли центрифугированием в течение 5 минут при 14000 об/мин. В результате центрифугирования происходило разделение на три фазы: верхнюю -раствор - ДНК, среднюю - денатурированные белки, нижнюю - фенол. Раствор ДНК отбирали в новые пробирки, затем добавляли фенол-хлороформную смесь (соотношение компонентов,в смеси 1:1). Далее повторяли депротеинизацию смесью фенол-хлороформ. Осаждение ДНК проводили 2 объемами сильно охлажденного 96 % этилового спирта. Раствор плавно перемешивали до полного высаживания ДНК. Далее смесь центрифугировали с охлаждением при 14000 об/мин в течение 10-15 минут, осажденную ДНК дважды промывали раствором 75 % этанола и один раз 96 % этанолом, высушивали при 60С до полного высыхания и растворяли в 20 мкл воды.
Получение и характеристика рекомбинантных клонов, содержащих (ТО)п-микросателлиты, из геномной клонотеки D. unisexualis
Гипервариабельные мини- и микросателлиты являются наиболее распространенной и универсальной системой молекулярных маркеров, широко используемых в популяционной, эволюционной биологии и геномном маркировании. В связи с этим в последнее время партеногенетические виды кавказских скальных ящериц, такие как D. armeniaca, D. dahli, D. unisexualis и D. rostombekovi, особенно активно исследовались при помощи мультилокусного фингерпринтного анализа и монолокусного ПЦР-анализа. В подобных исследованиях были охарактеризованы в основном тринуклеотидные и тетрануклеотидные микросателлитные локусы. Следует особо отметить, что динуклеотидные микросателлиты у D. unisexualis были исследованы впервые в данной работе.
Ранее с помощью мультилокусного ДНК фингерпринтинга была изучена изменчивость (ТСТ)п- микросателлитных и М13 минисателлитных повторов ДНК в популяциях, семьях и тканях партеногенетических скальных ящериц Кавказа Darevskia unisexualis [Рысков, 2003]. Было показано, что популяционные и семейные образцы ДНК D.unisexualis (всего 75 образцов) обладают индивидуально-специфическими ДНК фингерпринтными спектрами распределения (ТСТ)п-фрагментов. Наряду с обнаруженной супернестабильностью (ТСТ/ТСС)п-полипиримидиновых кластеров показана инвариабельность и мономорфность картины популяционных и семейных ДНК-фингерпринтных спектров по МІЗ- минисателлитам в тех же образцах ДНК D. unisexualis. Также был проведен ДНК-фингерпринтный анализ популяционных и семейных образцов двух морфоформ (мутантной и нормальной по дорзальной окраске туловища) партеногенетической ящерицы Darevskia armeniaca с использованием М13 мини- и (GACA)n, (ТСС)П микросателлитных маркеров ДНК [Мартиросян, 2003].
Тетрануклеотидные микросателлитные маркеры также широко применялись в фингерпринтном анализе популяций D. unisexualis [Токарская, 2003]. Несмотря на то, что во всех исследованных популяциях D.unisexualis ДНК-фингерпринтные профили практически идентичны по М13-минисателлитам (средний индекс сходства. S=0.992), указанные популяции оказались вариабельны по GATA-микросателлитам (S=0.862).
На примере партеногенетических ящериц наглядно продемонстрировано, что ДНК-фингерпринтинг является наиболее эффективным методом мониторинга тотальных изменений генома. Однако, следует отметить, что молекулярную природу и механизмы подобных изменений данным методом изучить не представляется возможным. Исследование подобных проблем лежит в области различных приемов и методов молекулярно-биологической и биохимической характеристики микросателлитных локусов, первым этапом которой является монолокусный ПЦР-анализ. В этой связи партеногенетический вид D.unisexualis и другие однополые и двуполые виды рода Darevskia достаточно интенсивно исследовались главным образом путем изучения локусов и аллельных вариантов локусов тетрануклеотидных микросателлитов [Корчагин с соавт., 2004; Kogchagin et al., 2007].
С помощью монолокусного ПЦР-анализа, используя пары праймеров, подобранные для локуса Du215 Darevskia unisexualis, было проведено изучение аллельного полиморфизма ортологичного локуса в популяциях родственного партеновида D. armeniaca [Малышева, 2005]. Было установлено, что Du215 (arm) является полиморфным и в популяциях партеновида D. агтепшса (п = 127) представлен как минимум тремя аллельными вариантами, которые различаются размером и составом микросателлитного кластера, а также одиночными нуклеотидными заменами в прилежащих ДНК. Показано, что микросателлитный кластер локуса Du215 (arm), в отличие от Du215, содержит не только GATA-, но и (САСА)-повторы, которые отсутствовали у D. unisexualis. Локус Du215 (arm) является гетерозиготным и в популяциях партеновида D. armeniaca представлен как минимум тремя аллельными вариантами, различающимися по электрофоретической подвижности продуктов амплификации в интервале 200-250 нуклеотидных пар. Причем исследованные популяции отличаются между собой по частоте встречаемости этих аллельных вариантов. Интересно отметить, что все особи из популяции Такярлу, представленной двумя морфоформами, различающимися по окраске туловища, оказались электрофоретически инвариантными и гетерозиготными по исследуемому локусу. Гетерозиготными оказались и особи из так называемой Украинской популяции (особи из локальной, изолированной популяции "Медведь-гора" в Армении, интродуцированные в 1964 г. на Украину). Следует отметить, что в данной популяции было обнаружено три аллельных варианта Du215 (arm). Три аллельных варианта этого локуса, различавшихся по электрофоретической подвижности, были выявлены и в популяции Алаверды. В остальных исследованных популяциях Du215 (arm) давал два четко различавшихся по электрофоретической подвижности амплификанта и, по-видимому, представлен только двумя аллельными вариантами. Изучение молекулярной природы аллельного полиморфизма локуса Du215 (arm) в популяциях D. armeniaca показало что, последовательности аллельных вариантов Du215 (arm) партеновида D. armeniaca отличаются от последовательности клона Du215 партеновида D. unisexualis размером и составом микросателлитных кластеров, а также некоторыми однонуклеотидными заменами и инверсиями в прилежащих ДНК. Анализ нуклеотидных последовательностей аллелей Du215 (arm) показал, что их микросателлитные кластеры имеют сложное строение. Аллели 1 и 2 Du215 (arm) содержат в своем составе как (GATA)n-. так и (САСА)п-кластеры и отличаются друг от друга на одно мономерное звено (GATA). Аллель 3 Du215 (arm) вообще не содержит (GACA)n-noBTopoB и имеет более короткий (САТА)п-кластер. Следует также указать на вариабельность концевых участков микросателлитов у аллелей локуса Dull5 (arm) и его ортолога Du215. Эта вариабельность выражается в наличии или отсутствии мономера GACA у 5 -конца и разной копийности GCAA-звена у З -конца соответствующих вариантов данного локуса. Кроме того, аллели 1-3 локуса Du215 (arm) друг от друга отличаются точковыми мутациями типа транзиций и трансверсий, расположенными на фиксированных расстояниях (-19, -38 и -58 пн) от начала микросателлитного кластера. При этом точковые мутации образуют два гаплотипа: T-G-C (аллели 1 и 2) и А-С-Т (аллель 3). Интересно отметить, что аллели ортологичного локуса Du215 у D. unisexualis также имеют фиксированные точковые замены, расположенные соответственно на расстояниях -42 и -69 пн от начала микросателлитного кластера, образуя двойные устойчивые нуклеотидные замены А-А и T-G.
Локус-специфическая ПЦР использована также и для определения генетического полиморфизма в трех популяциях партеногенетического вида ящериц Darevskia dahli [Давоян с соавт., 2007]. Анализ проведен на выборке 26 особей по двум (САТА)п-содержащим локусам (Du215 и Du281). Обнаружено восемь аллельных вариантов по локусу Du215 и три - по локусу Du281. Показало, что все исследованные особи гетерозиготны по этим локусам. У 12 особей по локусу DU215 обнаружен необычный аллельный вариант, происхождение которого может быть связано с различными типами геномной реорганизации или сегментной дупликации. Выявлены значительные различия по уровню аллельного полиморфизма между исследованными популяциями, что может объясняться различными экологическими условиями обитания популяций, приводящими к накоплению мутаций в некодирующей области генома. Таким образом, в отличие от D. unisexualis у D. dahli уровень внутривидового полиморфизма по локусу Du215 оказался гораздо выше, чем по локусу Du281: по локусу Du215 у D. dahli удалось выявить не менее 8 аллельных вариантов, а по локусу Du281 - три аллельных варианта.
