Клонирование и молекулярно-генетическая характеристика (GATA)_n-содержащих локусов генома партеногенетических ящериц Darevskia unisexualis Корчагин Виталий Иванович

Содержание к диссертации

ВВЕДЕНИЕ 2

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 4

Гипервариабельные последовательности генома: минисателлиты. 4

Минисателлиты М13 -типа. 8

Мутации в минисателлитах. 8

Гипервариабельные последовательности генома: микросателлиты 11

Типы микросателлитов. 11

Геномная локализация. 12

Участие в формировании хромосомных структур. 14

Влияние на рекомбинацию. 15

Влияние на репликацию. 17

Участие в регуляции экспрессии генов. і 8

Участие в образовании неканонических структур ДНК. 19

Механизмы нестабильности микросателлитов. 21

Факторы, влияющие на нестабильность микросателлитов. 24

Ретропозоны и нестабильность тандемных повторов ДНК. 27

///. Использование мини- и микросателлитных последовательностей в молекулярно-генетических исследованиях.

Однополые позвоночные как модельные организмы для исследования изменчивости гипервариабельных последовательностей ДНК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 39

РЕЗУЛЬТАТЫ 51

1. Получение геномной библиотеки D. unisexualis и отбор клонов, содержащих микросателлитные повторы. 51

2. ПЦР-анализ внутри и межпопуляционного полиморфизма D. unisexualis по локусам Du323, Du215 и Du281. 55

3. ПЦР-анализ локусов, гомологичных Du323, Du215 и Du281, у родительских видов D. nairensis и D. valentini. 62

4. Нуклеотидные последовательности аллельных вариантов локусов Du323, Du215 и Du281. 64

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 69

ВЫВОДЫ 77

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 78 

Введение к работе

Обнаружение и последующее применение гипервариабельных минисателлитных [Jeffreys et al., 1985] и микросателлитных последовательностей ДНК внесло значительный вклад в молекулярно-генетические исследования последних лет. У человека и остальных двуполых видов мини- и микросателлитные маркерные системы являются наиболее информативными, эффективно применяемыми в популяционной и эволюционной биологии, медицинских исследованиях, геномном картировании и определении родства [Goldstein and Pollock, 1997; Jeffreys et al., 1997; Ryskov, 1999; Ellegren, 2000]. Однако, до сих пор мало известно о природе генетической нестабильности, аллельной структуре, уровне и природе мутаций гипервариабельньгх мини- и микросателлитных локусов, особенно у видов с клональной структурой популяций.

С другой стороны, именно клональные виды (партеногенетические и гиногенетические), система размножения которых исключает рекомбинацию с мужским геномом, являются уникальными объектами для мониторинга генетической изменчивости в локусах с повышенной мутационной активностью [Даревский с соавт., 1993]. Партеногенетические виды ящериц рода Darevskia имеют гибридное происхождение, характеризуется диплоидным набором хромосом, невысоким уровнем гетерозиготносте аллозимных локусов [Fu et al., 1998] и незначительной вариабельностью сайтов рестрикции митохондриальной ДНК [Moritz et al., 1992].

Ранее с помощью мультилокусного ДНК-фингерпринтинга была изучена изменчивость различных типов мини- и микросателлитных маркёров ДНК у четырёх партеногенетических видов рода Darevskia [Канн и соавт. 1998; Tokarskaya et al., 2001; Мартиросян с соавт., 2002; Мартиросян с соавт., 2003]. Было показано, что на фоне видоспецифических картин ДНК-фингерпринтных спектров партеновидов выявляется генетическая неоднородность партеногенетических особей по некоторым микросателлитным маркёрам ДНК.

В то же время, молекулярная природа и механизмы возникновения микросателлитных мутаций, а также уровень аллельного полиморфизма микросателлитных локусов остаются неясными. Очевидно, определённый прогресс в решении этих вопросов могут дать генно-инженерные исследования этих локусов.

Целью настоящей работы является клонирование и молекулярно-генетический анализ 3-х (ОАТА)п-содержащих локусов D. unisexualis, изучение внутривидового полиморфизма этих локусов у D. unisexualis, молекулярная характеристика аллельных вариантов клонированных локусов и выявление гомологичных локусов у двуполых родительских видов D. nairensis и D. valentini.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

/. Гипервариабельные последовательности генома: минисателлиты.

В настоящее время известно, что в геноме всех живых организмов существуют участки с повышенной вариабельностью. Существование различий в строении ДНК у разных представителей одной популяции получило название полиморфизма ДНК. Полиморфные участки ДНК могут быть выявлены с помощью блот-гибридизационного анализа при гидролизе ДНК ферментами рестрикции и использовании определенных клонированных последовательностей генома - ДНК зондов. Это явление получило название полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Различные рестрикционные фрагменты выявляются по гомологии с определенными ДНК-зондам, следовательно, ПДРФ и соответствующий ДНК-зонд представляют собой систему, за наследованием которой можно проследить. Впервые явление геномного полиморфизма было использовано в 1974 г. Дж. Сэмбруком, осуществившим картирование температурочувствительных мутаций аденовируса с помощью полиморфных маркеров. В 1978г. Д. Ботстейном и соавт. [Botstain et al., 1980] было высказано предположение, что любые анонимные последовательности ДНК могут служить маркерами полиморфизма, и могут быть использованы для генетического анализа. При этом любые генетические признаки, сегрегирующие в поколениях, может быть маркированы вариантами ПДРФ, которые наследуются как простые менделевские признаки [Botstain et al., 1980]. Ценность отдельного полиморфного маркера зависит от числа его аллельных вариантов в популяции. В большинстве случаев варианты ПДРФ возникают в результате точковых нуклеотидных замен, небольших делеций и вставок в сайтах узнавания рестриктазами. Такие изменения (мутации) приводят к появлению всего двух аллельных вариантов. Однако диморфные маркеры малоинформативны. Поэтому используют ДНК-зонды, детектирующие области генома с повышенной вариабельностью, позволяющие получить маркеры, характеризующиеся многоаллельностью. Существование подобных гипервариабельных локусов впервые было показано при исследовании генома человека в 1980г. А. Вайманом и Р. Уайтом [Wyman and White, 1980]. Этот гипервариабельный локус выявили с помощью клонированной анонимной последовательности ДНК из теломерного района 14 хромосомы человека. Проведенный сегрегационный анализ показал, что все аллельные варианты данного локуса наследуются по менделевскому типу. Авторы также показали, что по структуре локус представляет собой повторяющиеся олигонуклеотидные звенья. Позднее подобные локусы были обнаружены в других участках генома человека. Характерным свойством локусов, состоящих из тандемно повторяющихся олигонуклеотидных звеньев, является заметная асимметрия в содержании пуринов и пиримидинов в разных звеньях, что напоминает сателлитную ДНК. При таком необычном нуклеотидном составе они, как правило, не содержат сайтов узнавания большинства рестриктаз. Однако, в отличие от сателлитной ДНК, сконцентрированной в основном в центромерных районах хромосом, эти локусы имеют разную геномную локализацию. Поскольку гипервариабельные локусы высоко полиморфны, то их информативность как маркеров, в частности для анализа сцепления, значительно выше, чем у большинства биохимических маркеров (например, изозимов ферментов или групп крови), а гетерозиготность в популяциях приближается к 100%.

Минисателлиты - это участки ДНК длиной 0.5 - 30 т.п.о., состоящие из повторяющихся звеньев размером от 6 до 100 п.о. [Jeffreys et al., 1995]. Последовательность нуклеотидов, образующая повторяющееся звено получила название «коровой Последовательности». Минисателлиты могут отличаться не только «коровой последовательностью», но и количеством ее повторений, а также некоторыми различиями в составе самого повторяющегося звена. Такие минисателлиты представляют собой разные аллельные варианты, число которых в популяциях живых организмов может быть очень велико. По этой причине минисателлиты также называют «гипервариабельными участками ДНК» (hypervariable regions - HVR).

Роль минисателлитов в геноме практически не изучена. Считается, что они могут участвовать в процессе связывания различных белков, а также являются горячими точками рекомбинации. В пользу последнего предположения свидетельствуют факты гомологии между последовательностями некоторых минисателлитов и участков, отвечающих за рекомбинацию: например, коровая последовательность Джеффриса, М13 минисателлит и сЫ-сайт E.coli имеют участки гомологии. Последовательность, гомологичная коровой последовательности Джеффриса, была найдена в гене Ер главного комплекса гистосовместимости мышей, который содержит горячую точку рекомбинации. Однако ряд данных, указывают на то, что присутствие минисателлита не является необходимым условием для рекомбинации [Jeffreys, 1987]. Таким образом, выяснение роли минисателлитов и других типов тандемных повторов в геноме живых организмов требует проведения дополнительных исследований.

Значительный вклад в изучение гипервариабельных локусов и их использование для генетического анализа внесли А. Джеффрис и соавт. [Jeffreys et al., 1985, 1987]. В первом интроне миоглобинового. гена человека ими был открыт 33-нуклеотидный минисателлитный повтор, фланкированный прямыми повторами из девяти нуклеотидов. Используя данную коровую последовательность в качестве зонда для скрининга библиотеки геномной ДНК человека, А. Джеффрис показал, что этот фрагмент способен гибридизоваться с другими участками ДНК человека. В результате были выделены и охарактеризованы минисателлитные последовательности, состоящие из 3-29 тандемно организованных звеньев, повторяющиеся единицы которых различались по нуклеотидному составу и варьировали по длине от 16 до 64 п.о. Однако все повторяющиеся звенья содержали практически одинаковую «коровую последовательность» длиной 16 нуклеотидов. За пределами коровой последовательности повторяющиеся звенья не имели гомологии.

Применив для блот-гибридизации различные поликоровые пробы (33.15 и 33.6), Джеффрис и соавт. впервые показали, что на одной гибридизационной картине можно выявить сразу все или почти все локусы, содержащие минисателлитные последовательности данного семейства. Полиморфизм таких картин блот-гибридизации чрезвычайно высок, так как определяется комбинацией многих, до нескольких десятков, независимых полиморфных локусов. Как показывают расчеты, вероятность совпадения гибридизационных профилей, то есть всех фрагментов, для двух неродственных индивидуумов очень мала , 10"и , только при использовании одной поликоровой пробы [Jeffreys et al., 1985], а для родственников первого порядка она составляет 10"5 . Получаемые картины гибридизации оказались индивидуально высоко специфичными и, по аналогии с картинами папиллярных линий, были названы «ДНК-фингерпринтами» или «дактилоскопическими оттисками» генома. Дальнейшие исследования показали, что профили гибридизации с гипервариабельными минисателлитами обладают соматической стабильностью, различия выявляются лишь для рестриктаз, сайты узнавания которых блокируются при метилировании.

В ходе дальнейших исследований Уонг и соавт. [Wong et al., 1986] впервые показали, что пробы Джеффриса могут служить не только для получения фингерпринтов тотальной человеческой ДНК, но также для скрининга геномных библиотек и выявления клонов, представляющих индивидуальные гипервариабельные локусы. Такие последовательности, которые содержат тандемные повторы, но представляют только один локус, обозначили как локусы с различающимся числом тандемных повторов (variable number of tandem repeats - VNTR) [Nakamura et al., 1987]. Эти локусы представляют большую ценность как точки отсчета при составлении генетической карты сцепления. Вследствие высокой гетерозиготности эти локусы достаточно информативны для картирования генетических болезней и могут использоваться при работе с малочисленными родословными.

Минисателлиты МІЗ — типа.

Семейство гипервариабельных последовательностей, детектируемое минисателлитной ДНК бактериофага М13 бьшо обнаружено в 1987 г. при изучении полиморфизма ДНК человека. В качестве пробы использовали конструкцию из ДНК человека и фага М13 [Джинчарадзе и др., 1987], а также ДНК фага М13 дикого типа [Vassart et al., 1987]. При определенных условиях наблюдалась гибридизация ДНК человека и ДНК бактериофага. При дальнейших исследованиях показали, что в гибридизации участвовал фрагмент ДНК в гене фагового белка III, состоящий из двух кластеров повторяющихся 15-нуклеотидных звеньев. Обнаруженный минисателлит давал удовлетворительные картины гибридизации с образцами ДНК разных объектов, и оказался уникальной пробой, которую можно использовать для выявления множества гомологичных локусов в геноме различных живых организмов [Ryskov et al., 1988].

Мутации в минисателлитах. Вариабельность в минисателлитных локусах связана со спонтанным мутагенезом и частота мутационных событий различна для разных типов минисателлитов. Это может зависеть не только от структуры минисателлита, но и от локализации его в геноме, пола объекта, от того, в каких клетках проводился анализ - половых или соматических, от возраста исследуемой особи.

Минисателлиты могут различаться не только строением, длиной и степенью изменчивости, но и частотой мутаций в мужских и женских половых клетках [Jeffreys et al., 1997]. Например, для минисателлита человека СЕВ1 эта величина составляет 15% для сперматозоидов и 0.5% - для ооцитов. Для других минисателлитов, например XMS1, этого не наблюдается. Эти различия могут отражать разные механизмы, приводящие к появлению тех или иных мутаций в геноме, такие как рекомбинация, репликация и генная конверсия.

Анализ частоты спонтанно возникающих мутаций (около 5% на гамету), приводящих к появлению новых аллельных вариантов человеческого минисателлита AMS1, показал, что эта величина пропорциональна размеру исходного аллеля. При этом частота мутаций растет с увеличением гетерозиготности, что согласуется с теорией нейтральных мутаций или случайного дрейфа генов [Jeffreys et al., 1988]. Исследования XMS1 не обнаружили отличий в частоте мутаций между мужскими и женскими половыми клетками, однако характер возникающих изменений был разный. В сперматозоидах изменения затрагивали участки минисателлита от 4 до 10 пар оснований, а в ооцитах — около 200 п.о. Это свидетельствует о различных механизмах возникновения новых аллелей: возможно, изменения в мужских половых клетках происходят в результате проскальзывания вилок репликации, а в женских - в результате генной конверсии в мейозе [Jeffreys et al., 1988].

В случае других минисателлитов человека - MS32, MS205, В6.7, СЕВ1 было показано, что независимо от длины исходного аллеля большинство изменений аллелей представляют собой увеличение числа повторов. Это может иметь большое значение для изучения распределения минисателлитов в популяциях и для объяснения того, каким образом из короткой и относительно стабильной исходной последовательности может возникнуть длинный и очень изменчивый тандемно организованный локус [Jeffreys et al., 1997]. Анализ изменчивости 50 аллельных вариантов минисателлита человека MS32 показал, что все они отличаются друг от друга строением одного из концов. Изменения числа повторов происходили в участке, который ранее был идентифицирован как «горячая точка нестабильности» [Jeffreys et al., 1995] и при этом наблюдалось равновесие между частотой меж- и внутриаллельных конверсионных событий. Похожие результаты были получены при изучении нестабильности MS205, В6.7 и СЕВ1, однако степень полярности внутриаллельных мутаций отличалась в зависимости от исследуемого локуса [Jeffreys et al., 1995]. Было показано, что основной механизм возникновения новых аллельных вариантов минисателлитов - это генная конверсия. Рассмотрим немного подробнее этот процесс.

В процессе мейоза происходит конъюгация гомологичных хромосом и образование структуры Холлидея. При этом в одном аллеле, который называется акцепторным, может произойти двунитевой разрыв в начале минисателлита, и возникшая брешь будет достраиваться по матрице другого, донорного аллеля. Таким образом, в результате конверсии, участок аллеля-донора появится в акцепторном аллеле. Более простые случаи, такие как делении и дупликации в акцепторном аллельном варианте, можно объяснить однонитевым разрывом в его начале. В обоих случаях возникновение разрывов нитей ДНК предполагает существование некоего белка - с/5-действующего фактора, который связывается с участком ДНК, фланкирующим акцепторный аллельный вариант минисателлита:

Модель такого механизма генной конверсии получила название «модели инициирующего фактора». Одним из доказательств, подтверждающих верность этой гипотезы, является то, что частота мутаций в исследуемых минисателлитах остается постоянной независимо от длины исходного аллеля. Участки изучаемого локуса, удаленные от инициаторной последовательности ДНК, с которой связывается c/s-фактор, не затрагиваются мутацией. Это было показано для минисателлитов человека MS32, MS205, СЕВ1, В6.7. Точечные замены в области связывания фактора влияют на частоту мутаций [Jeffreys et al., 1997].

II. Гипервариабельные последовательности генома: микросателлиты

Микросателлиты, SSR (short simple repeats) или STR (short tandem repeats) представляют собой тандемно повторяющиеся элементы генома из одного и более (до б) пар оснований, способные образовывать достаточно протяжённые кластеры, до 60 и более повторов. Также, как и минисателлиты, микросателлиты относятся к гипервариабельным участкам генома, так называемому классу VNTR (variable number of tandem repeats), полиморфизм которых связан прежде всего с изменениями числа повторов в кластере. Частота мутаций индивидуальных микросателлитных локусов варьирует от 10" до 10 событий на генерацию, что является чрезвычайно высоким показателем, при сравнении с частотой мутаций в кодирующих областях генома. Обычно микросателлитные локусы имеют 10 и более аллельных вариантов и гетерозиготность выше 60%, даже при небольшой выборке [Bowcock et al., 1994; Deka et al., 1995]. Все вышеперечисленные качества, в совокупности с широкой распространённостью микросателлитов по всему геному, делает их наиболее привлекательными генетическими маркерами для высокоэффективного генетического картирования [Dib et al., 1996; Dietrich et al., 1996]. Кроме того, они всё чаще подменяют RFLP и RAPD в популяционно-генетических и филогенетических исследованиях. Интерес к микросателлитам и механизмам их повышенной нестабильности связан, также, с их ролью в возникновении различных наследственных заболеваний, таких как синдром фрагильной Х-хромосомы, хорея Гантингтона, спиноцеребральная атаксия, миодистрофия Дюшена и др. Имеются данные о связи некоторых онкологических заболеваний с микросателлитными последовательностями.

Однако к настоящему времени, благодаря существенной интенсификации молекулярно-генетических исследований, доступны микросателлитные карты практически всех генетически и экономически важных организмов, включая человека, мышь, дрозофилу, коров, овец, кур, свиней, томатов, сои, риса и т.д. Имеются работы посвященные микросателлитам простейших [Su and Willems, 1996] и растений [Causse et al., 1994].

Классификация микросателлитов основана на повторяющемся мономерном звене: мононуклеотидные (А)п; динуклеотидные (СТ)П, (АС)П; тринуклеотидные (САС)П, (ТСС)„, (CTG)n, (ТСТ)П; тетрануклеотидные (GATA)n, (GACA)n и т.д. Р. Шафером и совт. [Schafer et al., 1994] в поисках подходящих информативных проб было изучено восемь простых повторяющихся олигонуклеотидов и обнаружено, что наиболее информативные картины гибридизации с ДНК человека даёт проба (CAC)s. При использовании её в методе ДНК-фингерпринтинга в сочетании с рестриктазами Alul, Hinfl, Mbol получаемые картины гибридизации фрагментов ДНК были идентичны у монозиготных близнецов, соматически стабильны и наследовались согласно законам Менделя. Широко применяется в популяционных исследованиях проба Bkm-2(8) (Banden krait minor satellite). Эта последовательность первоначально была выделена из геномной ДНК одного из видов змей Bungarus fasciatus, а позднее обнаружена у многих эукариот. Показано, что у некоторых видов Bkm-повтор локализован на половых хромосомах [Lang et al., 1993]. Bkm-проба содержит в основном GATA/GACA повторы и эффективно используется для изучения геномного полиморфизма у высших эукариот.

Геномная локализация.

Многочисленные исследования демонстрируют, что локализация микросателлитов в геноме не является случайной. Обычно их рассматривают как эволюционно нейтральные последовательности ДНК [e.g. Tachida & Iizuka, 1992; Awadalla & Ritland, 1997; Schlotterer & Wiehe, 1999]. Чаще всего микросателлиты входят в состав обширной фракции некодирующей ДНК и относительно редки в кодирующих областях генома. Например, для 54 растительных вида показана локализация 101 моно-, ди- и тетрануклеотидных повторов в некодирующих областях [Wang et al., 1994]. Все типы микросателлитных повторов (от моно- до гексануклеотидных) были в избытке обнаружены в некодирующих областях генома эукариот разных классов: Saccharomyces cerevisiae, Caenorabditis elegans, Shizosaccharomyces pombe, Mus, Drosophila [Metzgar et al., 2000]. В геноме рыбы Fugu rubripes 11.6% из 6042 микросателлитов обнаружено в кодирующих областях [Edwards et al., 1998]. Ранее сходная картина геномной локализации триплетных повторов в кодирующих и некодирующих областях генома была описана для грибов, простейших, прокариот, вирусов, органелл, плазмид и человека [Field & Wills, 1996; Wren et al., 2000]. Тем не менее, триплетные повторы, связанные с различными заболеваниями, были найдены и в кодирующих областях генома человека [Nadir et al., 1996].

Подавляющее большинство микросателлитов (48-67%), представленных в геномах многих видов являются динуклеотидами [Wang et al., 1994; Schug et al., 1998], однако, у приматов наиболее копийными в геноме являются мононуклеотидные повторы (главным образом поли-А/Т-кластеры)[ТоШ et al., 2000; Wren et al., 2000]. В противоположность тринуклеотидным микросателлитам, ди- и тетрануклеотидные повторы значительно более редки в кодирующих областях. Например, динуклеотидные повторы приблизительно в 20 раз реже встречаются в экспрессируемых последовательностях генома ели Picea abies [Scotti et al., 2000]. В восьми прокариотах и дрожжах длинные моно- и динуклеотидные тракты представлены исключительно в некодирующих областях [Field & Wells, 1998]. В некоторых геномах динуклеотидные повторы могут находится в нетранслируемой 5 и 3 областях. Это показано для пяти генов рыбы Ictalurus punctatus [Liu et al., 1999] и для генов белка теплового шока 70 млекопитающих (hsp 70), содержащих (GA)6CAG(TC)24-кластер [Lisowska et al., 1997]. Динуклеотидные повторы также обнаружены в интронах. Например, в интроне А гена Adh-1 Mus musculus имеется (ТА)н, (TG)s и (TA)i9 кластеры, а интрон гена IL-5 содержит (АТ)п-кластер. В интроне гена BVGC 34 генома берёзы Betula pendula находятся (СА)п, (ТА)н и (TGTA)3 микросателлиты. Возможные изменения размеров тандемных повторов в 5 и 3 областях и интронах способны привести к изменениям в структуре кодируемых белков и/или формированию новых генов за счёт сдвига рамки считывания (ORF) [Bachfrog et al., 1999; Liu et al., 1999].

Toth et al. (2000) провели детальный анализ микросателлитов в нескольких классах эукариот, от грибов до человека, и установили высокую«видовую специфичность в локализации различных типов повторов (от моно- до гексануклеотидов) для разных мотивов в кодирующих и некодирующих областях, интронах и межгенных спейсерах. Такая специфичность может быть частично объяснена совокупным действием мутационных механизмов и дифференцирующего отбора. Накопленные эмпирические сведения с известной долей вероятности указывают, что микросателлитные последовательности более распространены и протяжённы у позвоночных, чем у беспозвоночных, и среди позвоночных наиболее протяжённые микросателлиты представлены у холоднокровных видов [Chambers & MacAvoy, 2000]. Интересно, что среди таксонов, исследованных Toth et al. (2000) наибольшая представленность микросателлитов показана для грызунов, а наименьшая - для С. elegans.

Участие в формировании хромосомных структур.

Некоторые аспекты широкой распространённости микросателлитных последовательностей в геноме основаны на их вероятной роли в формировании видоспецифичных хромосомных структур. Например, сигнал гибридизации микросателлитного зонда в сходных хромосомных позициях, независимо от используемого мотива, выявляет заметное сходство полученных паттернов в пшенице и ржи, что свидетельствует о специфической роли микросателлитов в хромосомной организации, поскольку выявляет вероятные древние компоненты генома семейства Во многих видах центромерная область хромосом образована множеством тандемных повторов, влияющих на центромерную организацию. Длинные микросателлиты с моно-, ди-, три- и тетрануклеотидными мотивами высоко кластеризованы в центромерных областях томатов [Areshchenkova &• Ganal, 1999], Arabidopsis [Brandes et al., 1997] и свёклы Beta vulgaris [Schmidt & Heslop-Harrison, 1996]. В Neurospora crassa анализ центромерной последовательности ДНК обнаружил уникальную структуру, содержащую разнообразные семейства специфических повторов [Centola & Carbon, 1994]. Характеристики и строение простых повторов в центромере N. crassa сходно с таковым центромер Drosophila, но представленность каждого класса повторов уникальна для Neurospora [Cambareri et al., 1998]. В минихромосомах Drosophila участки ДНК, фланкирующие центромеры, состоят преимущественно из большого числа повторяющихся последовательностей, причём количество повторов различается между полами [Murphy & Karpen, 1995].

Агрегация различных тандемных повторов в высокоорганизованные хромосом-специфичные повторы является общим свойством большинства центромер и предполагает, что эволюционные механизмы формирования и поддержания таких структур высоко консервативны для большинства геномов [Janzen et al., 1999]. Повсеместная представленность повторяющихся последовательностей в геномах различных видов свидетельствует о эволюционных связях между структурой и функциями их в центромерах [Eichler, 1999]. Предположительно, повторы фланкирующие центромерные области могут выполнять две функции: удержание сестринских хроматид и косвенное участие в образовании и функционировании кинетохор [Murphy & Karpen, 1995].

Влияние на рекомбинацию.

Большое число микросателлитных и минисателлитных ДНК являются, вероятно, «горячими» точками рекомбинации [Jeffreys, 1998; Templeton et al., 2000]. Это подтверждается экспериментами, проведёнными на вирусах [Wahls & Moore, 1990], дрожжах [Treco & Aruheim, 1986], человеке [Aharoni et al., 1993; Majewski & Ott, 2000; Templeton et al., 2000], и клеточных линиях млекопитающих [Wahls & Moore ,1990].

Динуклеотидные повторы являются предпочтительными сайтами рекомбинации из-за их высокого сродства к ферментам рекомбинации [Biet et al., 1999]. Некоторые микросателлиты способны вызывать рекомбинацию непосредственно влияя на структуру ДНК. Предположительно, белки, связывающиеся с (GT)n, (CA)n, (CT)n, (GA)n, (GC)n или (АТ)П -повторами могут участвовать в рекомбинационном процессе, индуцируя Z-конформацию или другие альтернативные вторичные структуры ДНК [см. обзоры: Kord et al., 1994; Karlin et al., 1998; Biet et al., 1999]. Экспериментальные данные свидетельствуют, что на рекомбинацию влияет, также, количество повторов в микросателлите. Например, при изучении влияния GT/GC-микросателлитов на RecA-зависимую гомологичную рекомбинацию in vitro, было установлено, что количество молекул ДНК, претерпевших обмен цепями уменьшался от 100% до 80% и 30% для ДНК, содержащей 7, 16 и 37 повторов (GT)n, соответственно [Dutreix, 1997]. Majewski and Ott (2000) анализировали представленность разных микросателлитов и интенсивность рекомбинации вдоль 22 хромосомы человека. Существенная взаимосвязь между усилением рекомбинации и присутствием микросателлитньгх повторов была установлена только для (GT)n-noBTopoB. У дрожжей (СГ)п-микросателлитный повтор в локусе ARG4 приводит к увеличению частоты генной конверсии; повторяющаяся последовательность стимулировала образование множественных кроссоверов, но не влияла на одиночные кроссоверы [Genderel et al., 2000]. Очевидно, что на рекомбинацию влияет не только мотив микросателлита, но и количество повторов в кластере.

Влияние на репликацию.

Установлено, что микросателлитные последовательности способны влиять на репликацию ДНК [Field & Wills, 1996]. Так, в клетках крыс амплификация ДНК останавливалась внутри специфической области, содержащей d(GA)27"d(TC)27-iuiacTep. Он обнаруживается на конце ампликона и коньюгирует с обратным повтором, выступая в качестве сайта терминации репликации ДНК in vivo [Caligo et al., 1999]. Имеются данные, свидетельствующие о способности простых тандемных повторов влиять на клеточный цикл. Например, в человеческом гене СНК1 ответственном за прохождение клеточного цикла, в кодирующей области имеется (А)9-кластер [Codegoni et al., 1999], который является потенциальным сайтом мутаций, вызывающих нарушение клеточного цикла и образование опухолевых клеток [Bertoni et al., 1999]. Изменения в гене СНК1, наблюдаемые при некоторых видах рака у человека связаны с высокой степенью поли-А-нестабильности. Инсерция или деления одного А-нуклеотида в кластере влияет на структуру экспрессируемого белка. Таким образом, мутации в гене СНК1 представляет собой ещё один путь образования раковых клеток с нарушениями в клеточном цикле [Bertoni et al., 1999]. Некоторые гены, контролирующие клеточный цикл, такие как hMSH3, hMSH6, ВАХ, IGFIIR, TGFpTIR, E2F4 и BRCA2, имеют в своём составе повторяющиеся последовательности, играющие важную роль в контроле роста клетки. Нестабильность повторяющихся последовательностей этих генов связана как с инсерциями, так и с делениями мономерных звеньев. Большинство опухолей, ассоциируемых с этими повторами, связаны с мутациями в более чем одном из этих генов, причем длинные повторы являются наиболее частыми мишенями для мутаций [Johannsdottir et al., 2000].

Участие в регуляции экспрессии генов.

Некоторые исследования показывают, что микросателлиты, расположенные в промоторных областях могут влиять на активность генов. Так, в промоторной области ген белка теплового шока hsp26 находится (ТС)п-кластер выступающий в качестве транскрипционного элемента у Drosophila [Sandaltzopoulos et al., 1995], Aspergillus [Punt et al., 1990] и Phytophtora [Chen & Roxby, 1997]. Делеция различных ди-, три- и тетрануклеотидных повторов заметно хменяет транскрипционную активность. Например, транскрипционная активность промоторов генов c-KI-ras [Hoffman et al., 1990] и TGF-рЗ [Lafyatis et al., 1991] может критически снижаться при делеции (ТССС)п-кластера из промоторной области. A (GT)n-noBTOp способен увеличивать активность гена независимо от его ориентации, находясь на некотором расстоянии от гена, однако, наиболее эффективное усиление транскрипции будет наблюдаться при локализации (GT)n-noBTopa в непосредственной близости от промотора [Stallings et al., 1991].

Тандемные повторы в области интронов могут также существенно влиять на транскрипцию генов. Например, тетрануклеотидный микросателлитный локус HUMTH01, расположенный в первом интроне гена тирозингидроксилазы, выступает в качестве регуляторного элемента транскрипции [Meloni et al., 1998]. Gebhardt et al. (1999, 2000) установили, что транскрипционная активность гена рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) подвержена влиянию (СА)п-кластера, расположенного в первом интроне гена. Предполагается, что тандемный повтор выступает в качестве «соединителя», переносящего промоторный участок ближе к возможному белку-репрессору, расположенному по цепи ниже (СА)п-кластера.

Во многих случаях простые тандемные повторы выступают ключевым элементом в регуляции экспрессии генов. Некоторые гены могут экспрессироваться только в присутствие специфических тандемных повторов. Например, (GAA)n в промоторе гена LacZ Е. coli способствует экспрессии этого гена, в то время, как ни (GAA)i4-i6 ни (GAA)5-n не влияют на его экспрессию [Liu et al., 2000]. Некоторые гены могут экспресироваться в узкой области числа тандемных повторов, вне пределов этой области ген инактивируется. У дрожжей, промотор содержит (CTG/CAG)n с п=25 и отвечает за экспрессию репортерного гена URA3. Тем не менее, при изменении числа повторов 30 ген выключается [Miret et al., 1998]. У цыплят, конструкция из 10, 15 или 22 повторов (СТ) в промоторной области гена (malic enzyme) усиливает экспрессию по сравнению с диким типом, содержащим (СТ)7 [Xu & Goodridge, 1998]. Некоторые тандемные повторы, располагающиеся выше активаторной последовательности служат сайтом связывания для различных регуляторных белков [Lue et al., 1989; Csink & Henikoff, 1998]. Например, белки связывающие nonn-(GA) и поли-(СТ) последовательности обнаружены в фибробластах человека [Aharoni et al., 1993].

Участие в образовании неканонических структур ДНК.

Микросателлитные последовательности способны образовывать большое количество неканонических структур ДНК. Структурные характеристики (GA)„- цепей представляют биологический интерес, в связи с их широкой распространённостью в геномах [Manor et al., 1998], включая центромеры, где они по всей вероятности участвуют в специфических конформационных изменениях ДНК [Grady et al., 1992; Chou et al., 1996]. Повторяющиеся (GA)npaKTbi способны образовывать различные варианты так называемых гомеодуплексов - параллельных и антипараллельных. [Vorlichkova et al., 1999]. 20-мерный (GA)io повтор образовывал гомеодуплекс в условиях близких к физиологическим. Другой 20-мерный повтор (GATA)s вёл себя в одном случае как (ТА) і о в АТ-дуплексе, в другом случае как (GA)io в GА-дуплексе. При этом он свободно переходил из одного состояния в другое. [Vorlichkova, 1998].

К неканоническим структурам ДНК относятся шпильки, образуемые повтором (CCG)n (фрагильный Х-повтор) или триплетная структура формируемая (GAA)n/(TTC)n.

Подобные триплеты могут иметь важное регуляторное значение для экспрессии генов [Fabregat et al., 2001]. Человеческий центромерный (AATGG)n может образовывать двойную шпилечную ДНК-структуру [Catasti et al., 1999]. Короткие тринуклеотидные повторы также способны формировать протяжённые вторичные структуры в одноцепочечном состоянии, как показано Zheng et al. (1996). Длинные (CAG)n и (CTG)n повторы образуют необычные вторичные структуры при денатурации с последующей ренатурацией [Pearson & Sinden, 1996]. Помимо шпилек, тринуклеотидные повторы могут образовывать и другие конформации ДНК. Одноцепочечные (CGG)n повторы сворачиваются в устойчивую четырёхспиральную структуру (квадруплекс), стабилизируемую квартетами G-G-G-G и С-С-С-С [Usdin et al., 1998]. Под влиянием отрицательной сверхспирализации повторы (GAAV(TTC)n могут приобретать конформацию трёхспиральной Н-ДНК [Сиянова, Миркин, 2001]. Формирование подобных стабильных структур предполагает наличие механизма разворачивания, что выгодно для транскрипции и способствует образованию участков узнавания белков [Catasti et al., 1999].

Значительная распространённость динуклеотидных тандемньгх повторов в геномах многих организмов может свидетельствовать об их роли в формировании таких высокоорганизованных структур ДНК, как суперскрученная [Karlin et al., 1998; Baldi & Basnee, 2000]. Количество повторов, вероятно, является критическим параметром, определяющим равновесие между «выгодностью» необычных структур для экспрессии гена и «невыгодностью» подобных структур при репликации [Catasti et al., 1999], поскольку известно, что ДНК-полимераза может замедляться или останавливаться на стабильных шпильках, триплексах и квадруплексах [Сиянова, Миркин, 2001].

Механизмы нестабильности микросателлитов.

Именно способность простых тандемных повторов к формированию неканонических структур ДНК стала основой для их исключительной нестабильности. Основными механизмами мутации микросателлитов, как уже отмечалось ранее, являются неравный кроссинговер, проскальзывание вилок репликации и ошибки при репарации ДНК. В основе последних двух механизмов лежит описанная выше способность некоторых микросателлитов ((CGG)n, (CTG)n, (GAG)n и др.) к образованию вторичных структур ДНК [Wells, 1996]. Хотя мутационные процессы различны среди разных видов, типов повторов, локусов и аллелей и зависят от возраста и пола [Brock et al., 1999; Hancock et al., 1999; Ellegren, 2000; Schlotterer et al., 2000], нестабильность их преимущественно связана с изменениями в числе повторов. Значительные изменения количества повторяющихся звеньев в микросателлитных локусах происходит за счёт ошибок проскальзывания в ходе ДНК-репликации [Eisen, 1999]. Некоторые из этих ошибок исправляются различными механизмами, но многие избегают исправления и становятся мутациями. Изучение проскальзывания вилок репликации (slipped-strand), как механизма нестабильности микросателлитов, проводили на (CTG)n-noBTopax у Е. coli. Было показано, что в зависимости от ориентации повтора относительно точки начала репликации происходит либо увеличение, либо уменьшение числа повторяющихся звеньев. Выявлено, что нарушение процесса репликации происходит на «отстающей» цепи. Если (СГС)п-повтор расположен на матричной цепи ДНК, то на ней могут образовываться шпильки за счёт образования антипараллельных дуплексов. Вновь синтезированная цепь ДНК в свою очередь будет содержать меньшее число повторов, чем исходная цепь [Wells, 1996].

нормальная двлеция репликация

Если же (СТС)п-повторы находятся в растущей цепи, то образование ими шпилечных структур приводит к увеличению (экспансии) числа повторов в образующейся цепи. Образование шпилек на растущей цепи может быть вызвано «прыжками» ДНК-полимеразы в области 5 -концов фрагментов Оказаки [Djian, 1998].

Прямое доказательство сворачивания удлиняемых повторов (CGG)n, (CGC)n, (CTG)n и (CAG)n в несовершенные шпильки, стабилизированные как уотсон-криковскими, так и неканоническими парами нуклеотидов получено с помощью ЯМР-анализа [Zheng et al., 1996; Gacy et al., 1995; Chen et al., 1995]. Установлено, что шпильки, образуемые четырьмя перечисленными выше повторами, различаются природой некомплементарных пар, а их стабильность меняется в ряду CGOCCG CTG CAG [Gacy et al., 1995]. У дрожжей были также изучены CTG/CAG и CGC/CCG повторы способные к образованию петлеобразных структур [Moore et al., 1999]. Таким образом, нестабильность тандемных повторов может быть представлена как равновесие между образованием ошибок репликации и их г исправлением. В случае мутаций генов, отвечающих за исправление ошибок репликации, нестабильность микросателлитов возрастает. Это в свою очередь может приводить к возникновению «микросателлитных» заболеваний и онкогенезу.

Однако, и сама система репарации повреждений ДНК (MMR - mismatch repair) способна индуцировать нестабильность микросателлитных последовательностей. Повреждения ДНК, вызывающие одно- и двухнитевые разрывы, приводят к появлению свободных однонитевых участков ДНК.

Тандемные повторы, содержащиеся в таких участках могут образовывать петлеобразные структуры и последующая репликация, восстанавливающая повреждения, приводит к увеличению числа повторов [Djian, 1998].

5 =, 5і С „Б1 9 51 3 3 3 3 разрыв образование экспансий шпильки

Так, изучение линии дрожжей, мутантньгх по генам, контролирующим систему репарации неспаренных оснований, выявило увеличение нестабильности участков ДНК, состоящих из повторяющихся GT-последовательностей [Strand et al., 1993; Vilkki et al., 2001]. Недавние исследования обращают внимание на важную роль неравной рекомбинации в дестабилизации тандемных повторов (большинства мини- и микросателлитов) [Jakupciak & Wells, 2000; Richard & Paques, 2000]. Неравный кроссинговер приводит к увеличению числа повторов в одном аллеле и уменьшению в другом.

—яи»-«ш-нш18-«ш —ат-швж ш-иш —шш-юа-їш неравный кроссинговер В связи с этим, частота мутаций может расти с увеличением различий по длине между аллелями одного локуса [Goldstein & Pollock, 1997]. В зависимости от мотива, неравный кроссинговер может вызывать однонаправленные или двунаправленные изменения. Неравный обмен в комбинации с генетическим дрейфом и отбором может иметь сильное влияние на накопление тандемных повторов в геноме [Charlesworth et al., 1994]. Однако, по некоторым данным, преимущественным механизмом мутации микросателлитов является проскальзывание вилки репликации, поскольку мутантные аллели нерекомбинантны по фланкирующим маркерам, что свидетельствует о внутрикластерных мутациях [Ellegren, 2000]. Факторы, влияющие на нестабильность микросателлитов. В настоящее время имеется большое количество данных о зависимости частоты мутаций микросателлитов от их структуры: мотива, длины — и от фланкирующих последовательностей. Так Чакраборти [Chakraborty et al., 1997] показал, что динуклеотидные повторы мутируют с частотой в 1.2-2.4 раза чаще, чем три- или тетрануклеотидные повторы. Однако, эти закономерности верны только для «нейтральных» микросателлитов. Установлены относительные различия в частоте мутаций микросателлитов среди ди-, три- и тетрануклеотидных повторов в геноме D. melanogaster. Так, три- и тетрануклеотидные повторы мутируют в 6.4 и 8.4. раза реже, чем динуклеотидные соответственно [Shug et al., 1998]. Эти данные были соотнесены с тем, что длина три- и тетрануклеотидных повторов в геноме D. melanogaster меньше, чем длина динуклеотидных повторов. Положительная корреляция между длиной микросателлитного кластера и аллельным полиморфизмом предполагает, что частота мутаций увеличивается с увеличением длины микросателлита. Подобные данные получены для Drosophila ananassae, в геноме которой были выявлены динуклеотидные повторы более короткие, чем в геноме D. melanogaster. Тем не менее, уровень генетической вариабельности сравним с таковым у D. melanogaster [Schug et al., 2004]. Данные полученные при изучении дрожжей in vitro указывают, что длинные динуклеотидные повторы более мутабельны чем короткие [Wierdl, Dominska, 1997]. Сходные результаты получены при исследовании микросателлитных мутаций у человека [Brinkmann et al., 1998] и ласточки Hirundo rustica [Primmer et al., 1998]. Кроме того, в некоторых исследованиях установлена зависимость нестабильности микросателлитных локусов от пола родителя-носителя, которая выражается не только в разной частоте возникающих нарушений, но и в их характере. Например, у самок изменения представляют собой небольшие делеции, затрагивающие от двух до семи повторов, и возникающие приблизительно в 60% случаев. У самцов мутации возникают с частотой 10% - 70% и это в основном увеличение числа повторов. Наблюдаемые половые различия могут быть связаны с разным механизмом гаметогенеза мужских и женских половых клеток, а также полоспецифическими /rans-действующими факторами. Индивидуальные различия могут быть вызваны действием индивидуум - специфических с/я-факторов. Высокий уровень соматической нестабильности и присутствие мутантных аллелей почти во всех тканях организма могут быть связаны с возникновением мутаций на очень ранних стадиях эмбриогенеза — во время первых двух делений после оплодотворения [цит. по Monckton et al., 1997].

Согласно модели Маркова [Kruglyak et al., 1998], частота изменений в микросателлите зависит не только от его длины, но и от частоты возникновения точковых мутаций в нём и явлений проскальзывания вилок репликации. Для микросателлитных локусов характерна положительная асимметрия распределения мутаций, т.е. склонность к увеличению числа повторов в новых аллелях. Число повторяющихся звеньев в микросателлитах обычно не превышает 60, за исключением локусов, образованных тринуклеотидными повторами и вызывающими генные заболевания. Для всех типов микросателлитов существует зависимость частоты мутаций от размера исходного аллеля. Мораном в 1975 г. была предложена формула, согласно которой различия по размеру для локуса, подверженного одноступенчатым изменениям, равны мутационному дрейфу [цит. по Goldstein and Pollock, 1997]: 2(N-1)P, где N- гаплоидный размер популяции, 2р - общая частота мутаций.

Объяснение закономерностей мутационных изменений в микросателлитах получило отражение в «одноступенчатой» и «двухступенчатой» мутационных моделях.

Согласно «одноступенчатой» мутационной модели размер новых аллелей микросателлита увеличивается или уменьшается на одно звено. Все аллели случайно распределены в популяциях и имеют одинаковое селективное значение.[Valdes et al., 1993].

Изменения в микросателлнтах в соответствии с «двухступенчатой мутационной моделью» представляют собой совокупность одноступенчатых, т.е. изменение числа повторов на 1 или очень небольшое число звеньев, и скачкообразных (быстрое большое увеличение повторяющихся единиц) изменений. За основу было положено, что каждый локус нейтрален и изменение численности популяции происходит случайно [Di Rienzo et al., 1994]. Наблюдаемые частоты мультиступенчатых изменений (2-5 мономерных звена) существенно варьируют среди разных организмов, например, 4-14% у человека, 12% у pipefish, 16% у ласточки Hirundo rustica, 46% у австралийских ящериц и 74% у зелёных черепах.

Изучение мутационных изменений микросателлитов дрозофилы показало, что большинство нарушений представляют собой сложный процесс [Colson and Goldstein, 1999]. Особенностью этой работы являлось то, что все изучаемые повторяющиеся последовательности характеризовались небольшим числом звеньев и низким уровнем гетерозиготности. Была показана положительная корреляция между полиморфизмом микросателлита и числом повторов в нем, связь структуры микросателлита со структурой фланкирующих участков ДНК, а также подтверждена роль мутационных процессов в поддержании размера микросателлита. Микросателлиты, как и любая последовательность ДНК, подвержены точечным мутациям. Если предшествующий аллель состоял из «чистой» (совершенной) последовательности повторов, результирующий мутантный аллель может содержать прерывистый (несовершенный) кластер повторов из-за точечных мутаций. Несовершенные микросателлитные локусы менее вариабельны, чем совершенные [Weber & Wong, 1993]. Исследования свидетельствуют, что подобные изменения в структуре микросателлитного локуса ведут к уменьшению частоты мутации проскальзывания рамки ДНК-полимеразы. Таким образом, если мутации проскальзывания вилок репликации приводят к увеличению размера микросателлита, то точечные мутации приводят к его превращению в несовершенный повтор и, тем самым, к ослаблению его экспансии. Это может стать первым шагом к «смерти» микросателлита, поскольку несколько точечных мутаций превратят его в набор коротких несовершенных повторов [Ellegren, 2000].

Ретропозоны и нестабильность тандемных повторов ДНК.

В геномах многих организмов были обнаружены повторяющиеся последовательности ДНК, специфичные для таксономических групп и обладающие свойствами ретропозонов. Эти повторы можно разделить на два больших семейства: короткие диспергированные повторы - SINE (short interspersed repeats) и длинные диспергированные повторы - LINE (long interspersed repeats) [Сингер, Берг, 1998].

SINE элементы, вероятнее всего, представляют собой процессированные псевдогены, происходящие от генов, кодирующих тРНК и 7SL РНК. Они имеют длину, не превышающую 500 п.н., содержат А-богатую З -концевую последовательность, транскрибируются РНК полимеразой III и часто бывают окружены прямыми повторами. SINE последовательности также могут транскрибироваться РНК полимеразой II.

К группе SINE элементов относятся Alu-последовательности приматов, вероятно произошедших от 7SL РНК. Эти элементы составляют около 9% геномной ДНК человека (9x10 копий на гаплоидный геном) и содержат сайт узнавания эндонуклеазы Alu I [Сингер, Берг, 1998].

Строение Alu-повтора человека: 5 3" I ——Е7-ЗЯ7Т- I і —I участки, гомологичные ЬгггДИИ I I I ШШШШШШШШСз последовательностям 7SL РНК N /х/ N /sy А-богатые участки 12 12

Типичная Alu-последовательность представляет собой димер, состоящий из двух повторов длиной около 130 п.н., соединенных «голова-к-хвосту». Каждая мономерная единица содержит участки, гомологичные 5 - и 3 - концевым последовательностям 7SL РНК, однако центральная часть 7SL РНК длиной 155 п.н. у них делетирована. Соседние Alu-последовательности могут располагаться друг относительно друга в разной ориентации [Сингер, Берг, 1998].

В геноме млекопитающих также были обнаружены 8ГЫЕ элементы другого типа, вероятно, возникшие из генов транспортных РНК. К этой группе относятся MIR последовательности (mammalian wide interspersed repeats) или В1-В2-элементы [Krayev et al., 1980, 1982]. Они состоят из 5 - концевого промотора для РНК полимеразы III (гомологичного тому же участку гена тРНК) «коровой» последовательности из 65 п.н. и вариабельного 3 участка [Gilbert and Labuda, 1999]. Перемещение (ретропозиция) SINE элементов также может осуществляться за счет LINE последовательностей, кодирующих энзиматический механизм транспозиции [Ogiwara et al., 1999].

В геномах многих организмов были обнаружены длинные диспергированные повторы - LINE. У млекопитающих наиболее широко распространенным является семейство LINE-1 элементов.

Строение LINE- 5 , - и элементаОткрытая рамка считывания \ 2 - Стоп-кадон - А-богатый участок Размер LENE-1 последовательностей 6-7 т.п.н., однако многие представители этого семейства имеют меньшую длину за счет отсутствия 5 -концевых последовательностей. LINE элементы оканчиваются А-богатыми 3 участками и часто окружены прямыми повторами.

Недавние исследования показали, что некоторые мини- и микросателлиты встречаются в геноме в тесной связи с ретропозон-подобными элементами. В геноме человека и приматов существуют Alu-повторы, ретропозиция которых происходит с большой частотой. Эти элементы могут являться источником возникновения в геноме некоторых микросателлитных повторов, например (АС)П- типа, а следовательно, и связанного с ними полиморфизма ДНК [Arcot et al., 1995]. Существует несколько моделей возникновения микросателлитов при участии Ahi (Bl, В2) - элементов:

Изменение некоего исходного микросателлита в результате встраивания в его последовательность Alu - элемента

Встраивание в геном Alu - элемента, изменившегося в процессе обратной транскрипции. Изменения могут затрагивать области элемента, обогащенные А-основаниями (31 концевая область и/или центральная зона Alu - повтора) [Arcot et al., 1995].

Недавно было показано, что гипервариабельные мышиные минисателлиты Ms 6 — hm и Hm -2, возникли в результате изменений, связанных с ретропозон»лодобными элементами. Эти минисателлиты окружены длинными концевыми повторами (LTR - long terminal repeats) и содержат (GGGCA)n и (GGCA)n олигонуклеотидные повторы, присутствующие в центральной области некоторых LINE-элементов млекопитающих [Kelly, 1994].

Таким образом, существование диспергированных повторов со свойствами ретропозонов является еще одним источником полиморфизма ДНК. Обладая способностью к перемещению, SINE и LINE элементы, встраиваясь в различные участки генома, приводят к появлению различных изменений. Например, предполагается, что некоторые SINE элементы представлены в геноме в виде тандемно организованных кластеров, и изменение числа повторяющихся единиц или мутации в отдельном звене, могут приводить к появлению ДНК-полиморфизма [Spruell, Thorgaagd, 1996]. Последовательности со свойствами ретропозонов могут являться источниками возникновения мини- и микросателлитов и, следовательно, связанным с ними полиморфизмом ДНК [Spruell, Thorgaagd, 1996; Arcot et al., 1995; Bois et al., 1998; Kelly, 1994]. Предполагается, что длинные концевые повторы, окружающие некоторые мини- и микросателлиты, и образующиеся в результате обратной транскрипции LINE элементов, могут регулировать мутационные события в тандемно организованных последовательностях. LTR - повторы могут являться горячими точками гомологичной рекомбинации или cis - действующими промоторами в геноме млекопитающих [Kelly, 1994].

III. Использование мини- и микросателлитных последовательностей в молекулярно-генетических исследованиях

Присутствие гипервариабельных последовательностей в геноме живых организмов позволяет широко использовать маркерные системы на основе мини- и микросателлитных зондов для решения различных генетических задач. Картирование генов, сцепленных с тем или иным гипервариабельным маркером, создает предпосылки для выделения и клонирования последовательности генов, выяснения структуры кодируемых генами белков. Это, в частности, открывает возможности для изучения молекулярных механизмов различных генных болезней. Данные ДНК-фингерпринтного анализа сейчас используют в криминалистике, медицинской генетике, медицине.

Современные молекулярно-генетические методы, основанные на использовании мультилокусных маркеров ДНК, занимают сегодня выдающееся место не только в медицинских исследованиях, но и при решении таких фундаментальных проблем биологии, как структура и организация генома, его нестабильность, генетическая изменчивость, видообразование, эволюция и систематика. Метод геномной дактилоскопии эффективно используется для геномного маркирования, видового и популяционного типирования, установления родства в различных таксономических группах, включая прокариотические организмы [см. обзор: Рысков, 1999]. Например, была установлена степень генетического сходства и межвидовая изменчивость в группе диких копытных животных [Потапов и др., 1997], проведено изучение внутри- и межвидового генетического разнообразия у грызунов [Потапов и Рысков, 1993; Потапов и др., 1994], межпородного разнообразия у кур [Семенова и др., 1996]. Возможность определения родства позволяет выявить особенности структуры популяций изучаемых видов и основные генетические процессы, происходящие в них, что особенно важно для редких и исчезающих видов [Tokarskaya et al., 1994,1995].

Исследования, проводимые на разных объектах, показали, что различия в дифференцирующей способности маркеров различного типа связаны с особенностями структурной организации самих маркерных последовательностей ДНК, а также со спецификой их распределения в геноме различных групп животных.

Особый интерес представляет изучение популяционно-генетических закономерностей в клональных, малых и изолированных популяциях, т.к. действие факторов, нарушающих генетическое равновесие (дрейф генов, прохождение через «горлышко бутылки», случайная гибель особей и др.), в таких популяциях может быть легко прослежено. Процесс фиксации аллелей гипервариабельных локусов в малых изолированных популяциях идет быстрее, поэтому метод ДНК-фингерпринтинга является наиболее эффективным для изучения изменчивости в этих популяциях.

Однополые позвоночные как модельные организмы для исследования изменчивости гипервариабельных последовательностей ДНК.

Однополые виды представляют собой удобную - природную модель для решения важных биологических задач. Использование однополых видов позволит разработать новые тест-системы для, например, изучения спонтанного мутагенеза и мутагенного воздействия токсических веществ и радиации. Клонально размножающиеся позвоночные интересны и достаточно удобны для исследований, т.к. их клоны генетически стабильны в ряду поколений, что невозможно для животных с обычным типом полового размножения.

Известно, что для всех однополых видов позвоночных (кроме Poescilia Formosa), в том числе и в группе однополых кавказских скальных ящериц, характерен мейотический партеногенез [Cognetti et al., 1961]. Более детально механизм мейоза установлен у однополых ящериц рода Cnemidophorus. Доказано, что у этих видов имеет место премейотическое восстановление соматического набора хромосом. Изучение образования яиц у однополых ящериц-бегунов показало, что в клетках яичников [Коул, 1984] происходит премейотический эндомитоз, благодаря чему удваивается число хромосом в яйцеклетках [Dawley, 1989], и клетки становятся полиплоидными. У диплоидных видов образуются тетраплоидные клетки, а у триплоидных - гексаплоидные [Коул, 1984]. Мейоз начинается с образования пар между идентичными хромосомами. Между идентичными хромосомами происходит синапсис, что приводит к формированию псевдобивалентов. Дальше мейоз протекает как и у двуполых видов [Dawley, 1989], но происходящий при кроссинговере обмен ДНК не имеет генетических последствий, т. к. в нем участвуют идентичные молекулы ДНК [Коул, 1984]. Когда хромосомы переходят во вторую стадию мейотического деления, создается впечатление, что премейотической дупликации не происходило и первое деление мейоза отсутствовало [Dawley, 1989]. Как это обычно бывает при созревании половых клеток, вслед за кроссинговером клетки дважды делятся. И, в конечном счете, образуются яйца, в каждом из которых столько же хромосом и та же комбинация генов, что и в исходной клетке яичника до дупликации. С генетической точки зрения такое зрелое яйцо полноценно, в отличие от гаплоидного у самок двуполых видов, и может развиваться без оплодотворения [Коул, 1984].

Одной из центральных проблем изучения однополых видов позвоночных является оценка генетического и клонального разнообразия [Dawley, 1989]. Изучение изменчивости и клонального разнообразия у гиногенетического гибридного комплекса Phoxinus eos/ Phoxinus neogaeos [Elder and Schlosser, 1995], обитающего в Северной Америке [Dawley, 1989] показали, что существование большого числа клонов в популяциях клональных видов позвоночных не является правилом.

Низкий уровень клонального разнообразия в исследованных популяциях, по-видимому, связан со специализацией вида и с селективной ценностью одного определенного клона, который "колонизировал" определенную экологическую нишу.

Согласно данным электрофоретических исследований белков и рестрикционного анализа митохондриальной ДНК, партеногенетические виды рептилий в разной степени мультиклональны. Высокий уровень вариабельности аллозимных локусов бал обнаружен, например, у Heteronotra binoci (Gecconidae) и других представителей этого семейства (Nactus pelagiens) [Moritz et al., 1989]. Незначительная генетическая неоднородность была показана для американских партеногенетических ящериц рода Cnemidophorus [Cole et al., 1988]. У отдельных видов кавказских скальных ящериц рода Darevskia также наблюдалась морфологическая изменчивость. Своеобразные вариации окраски были обнаружены в одной из популяций D. dahli. Были обнаружены самки с ярко желтой окраской нижней стороны тела, которые в отличие от обычных самок с бледно-желтой окраской, откладывали меньше яиц и были менее устойчивы к засушливым условиям (персональные наблюдения, Даниелян, Даревский, Куприянова, Murphy) [Murphy, 1997]. Таким образом, в каждом из рассмотренных случаев имеет место появление новых морфологических партеноклонов. Однако, далеко не всегда, такие "морфологические" клоны совпадают с "генетическими", выявленными различными хМолекулярно-генетическими методами [Даревский, 1993]

Согласно , современным представлениям, все партеногенетические виды рода Darevskia появились на Кавказе в постледниковую эпоху и являются молодыми видами, теоретически имеющими равные шансы для возникновения новых клонов [Moritz et al., 1992; Darevsky, 1993]. Клональное разнообразие однополых видов, включая партеногенетических ящериц, принято объяснять мутациями, гибридным происхождением и незаконной рекомбинацией, возможной в популяциях однополых видов. Размер ареала, возраст вида и другие факторы также могут определять степень его генетического разнообразия [Parker et al., 1979]. Одновременно было высказано мнение о том, что нестабильность кариотипа гибридных геномов может тоже приводить к генетическому разнообразию партеногенетических видов и появлению у них мутаций, часто определенного типа [Куприянова, 1999].

Darevskia unisexualis, как и все партеногенетические виды рода Darevskia, имеет гибридное происхождение. Родоначальными видами считаются бисексуальные виды D. nairensis и D. valentini [Даревский, 1993]. Цитогенетические исследования D. unisexualis показали, что хромосомы у этого вида акроцентрические и число их в диплоидном наборе равно 38, включая пару микрохромосом. У D. unisexualis присутствует редуцированная половая хромосома продвинутого типа - W хромосома [Куприянова, 1999].

Вид D. unisexualis распространен в горных районах центральной Армении и прилегающих областях северо-восточной Турции на высоте 1700 - 2100 метров. D. unisexualis обычно населяет коренную подстилающую породу в основном вулканического происхождения, каменистые осыпи, кучи камней и большие фрагменты лавы в степях вокруг гор, в местах ныне исчезнувших горных лесов, камнях на берегу горных прудов [Darevsky et al., 1985].

Исследования митохондриальной ДНК с помощью рестрикционного анализа продемонстрировали очень низкий уровень нуклеотидной изменчивости как у партеногенетического вида в целом, так и у предполагаемого материнского предка [Moritz et al., 1992]. Степень дивергенции митохондриального генома между особями «материнского» бисексуального вида и партеногенетического вида позволяет определить возраст однополого вида; например, приблизительный возраст партеногенетического вида D. unisexualis составляет 5000 лет. Степень дивергенции митохондриального генома между «материнскими» и соответствующими партеногенетическими видами кавказских скальных ящериц составляет 0% - 0.6%, что свидетельствует о недавнем возникновении партеногенетического типа размножения в роде Darevskia, вероятно, около 10000 лет назад, после ледникового периода [Moritz et al., 1992].

Происхождение партеновидов кавказских скальных ящериц можно описать при помощи теории «сетчатого видообразования» [Даревский, 1993]. Один из бисексуальных видов является «материнским», а другой - «отцовским», т. е. в процессе гибридизации участвовали самки одного вида и самцы другого.

Аллозимный анализ 35 локусов у партеногенетических видов D. armeniaca, D. dahli, D. unisexualis показал, что каждый из 3-х исследованных видов представлен одним широко распространенным клоном, но в некоторых популяциях были обнаружены единичные особи, представляющие собой редкие клоны [MacCuUoch et al., 1995, 1997; Muphy et al., 1997; Fu et al., 1998]. У D. armeniaca найдено всего 4 клона [Fu et al., 1998], у D. dahli - 5 [Murphy, 1997], у D. unisexualis - 3 клона [MacCuUoch et al., 1995]. Редкие клоны различались аллельными вариантами минимум в двух локусах, причем соответствующие варианты были выявлены и у родительских видов. Однако были обнаружены редкие аллели, которые не встречались ни у одного из родительских видов. Таким образом, впервые было доказано, что партеногенетические виды рода Darevskia характеризуются генетической изменчивостью [Куприянова, 1999].

Уровень изменчивости по аллозимным локусам оказался почти таким же, как у партеногенетических ящериц Cnemidophorus tesselatus, но был гораздо выше, чем у Cnemidophorus neomexicanus. Генетическое разнообразие у D. dahli оказалось намного ниже, чем разнообразие, обнаруженное Морицем [Moritz et al., 1989] у однополых гекконов Heteronotia Ыпое [Murphy, 1997]. Электрофоретический анализ белков трех популяций ящериц D. unisexualis показал, что 21 из 36 аллозимных локусов были константно гомозиготны, 14 показывали фиксированную гетерозиготность и лишь один локус был вариабелен (два аллозимных варианта) [Fu, MacCuUoch, 1997]. При проведении экспериментов по пересадке участков ткани была доказана изогенность образцов ткани, полученных от отдаленных популяций из Армении. У 96% образцов ткани не отторгались, но небольшая вариабельность существовала [Даревский, 1993].

Наиболее эффективным методом изучения клональной изменчивости у однополых видов является метод ДНК-фингерпринтинга с использованием мини- и микросателлитных маркеров.

Исследование клонального разнообразия в популяции гиногенетического гибридного комплекса Phoxinus eos/Phoxinus neogaeos проводили с помощью ДНК-фингерпринтинга с олигонуклеотидными зондами и аллозимного анализа. Результаты, полученные при применении обоих методов, показали существование только одного клона. ДНК-фингерпринтный анализ гиногенетических особей комплекса Phoxinus eos /Phoxinus neogaeos в семействе Cyprinidae также обнаружил полное отсутствие клонального разнообразия по мини- и микросателлитным локусам. С помощью ДНК-фингерпринтинга проанализировали 464 особи, среди которых только 4 отличались одной полосой на фоне общей фингерпринтной картины. Наблюдаемые отличия авторы объясняли соматическим мозаицизмом особей [Elder and Schlosser, 1995]. Предварительные данные по анализу митохондриальной ДНК показали, что Phoxinus neogaeos является материнской родоначальной формой и подтвердили гипотезу о гибридном происхождении однополых видов путем многократных гибридизаций между родительскими формами [Dawley, 1989]. Исследования природных популяций Poecilia formosa [Turner et al., 1990] с помощью набора микросателлитных ДНК-проб позволили выявить гипервариабельные фрагменты, проявляющие изменчивость в ряду поколений [Schartl et al., 1991] и показали роль мутационных процессов в возникновении клонального разнообразия у этих видов рыб [Elder, 1995]. Среди 19 особей из одной популяции Poescilia formosa выявили 16 разных клонов, тогда как с помощью аллозимного анализа только 3. Число наблюдаемых полос на различных фингерпринтных картинах варьировало в зависимости от особи, вида, размера популяции и используемой рестриктазы.

Популяция рыб рода Carassius в Японии представлена диплоидными родственными видами и триплоидными гиногенетическими самками. С помощью мультилокусного ДНК-фингерпринтинга бьио выявлено 3 клона, из чего можно сделать вывод, что почти вся популяция является потомком трех предковых материнских форм [Umino et. al., 1997].

С помощью ДНК-фингерпринтинга интенсивно изучались партеногенетические ящерицы рода Darevskia [Кан и соавт., 1998, 2000; Токарская и соавт., 2000; Рысков и соавт., 2000; Tokarskaya et al., 2000, 2001, 2003; Мартиросян и соавт., 2002]. Исследование семей D. armeniaca, состоящих из самок и их потомков (первое поколение), проводили с использованием маркеров М13 DNA, (GATA)4, (ТСС)5о- Были обнаружены идентичные картины гибридизации для всех потомков и их матерей. [Tokarskaya et al., 2001]. У D. unisexualis, фингерпринтные фенотипы потомков и матерей были также идентичны при анализе с пробой М13, однако, при использовании (TCT)s и (TCC)so была обнаружена внутрисемейная вариабельность во всех семьях [Рысков и др., 2003]. Высокая частота мутаций этих локусов (частота мутантньгх фенотипов около 1) коррелирует с высокой полиморфностью популяционных фингерпринтов с этими полипиримидиновыми пробами [Рысков и др., 2000]. ДНК-фингерпринтный анализ 25 семей D. unisexualis (более 84 потомков) с использованием пробы (GATA)4 демонстрировал мутантный фингерпринтный фенотип у 13 потомков, отличающихся от их матерей по нескольким рестриктным фрагментам ДНК [Токарская и др., 2003]. Мутантные фенотипы, обнаруженные в семьях также были обнаружены в популяционных образцах [Токарская и др., 2000]. Расчёт частоты мутаций (САТА)п-микросателлитов у данных ящериц показал, что она такая же, как у некоторых двуполых видов и составляет 15% на потомка или 0.95% на паттерн. Тем не менее, к настоящему времени практически нет данных о механизмах мутаций подобных полиморфных локусов у партеногенетических видов.

Очевидно, значительный вклад в решение этой проблемы могут внести генно-инженерные исследования вариабельных локусов у этих видов. Этим и определяются основные экспериментальные задачи настоящей работы.