Содержание к диссертации
Введение 4
Обзор литературы 8
1 Таксономическое положение и биология рода Trichoderma (Pers.:Fr.)
1.1 Таксономическое положение рода Trichoderma 8
1.2 Внутривидовая и популяционная изменчивость грибов рода Trichoderma 12
1.3 Исследование популяционной структуры грибов 17
1.4 Виды рода Trichoderma, использующиеся в мировой практике защиты растений 18
1.5 Взаимоотношения грибов рода Trichoderma с фитопатогенами в биоценозах 22
1.6 Поиск и критерии отбора перспективных видов Trichoderma, использующихся в различных отраслях практической деятельности 26
1.7 Система интегрированной защиты растений. Эколого-биологические основы применения органических удобрений на основе гидролизного лигнина в сельском и лесном хозяйстве 36
2 Материалы и методы 57
2.1 Выделение и идентификация штаммов вида Trichoderma asperellum 57
2.2 Получение моноспоровых культур грибов 58
2.3 Оценка нестабильности исходных и моноспоровых штаммов Trichoderma asperellum 59
2.3.1 Оценка типов и реакций вегетативной совместимости 60
2.3.2. Определение антибиотической активности изолятов в отношении грибов рода Fusarium 60
2.4 Определение чувствительности и степени устойчивости штаммов Trichoderma к фунгицидам 61
2.5 Культивирование грибов рода Trichoderma на гидролизном лигнине 63
2.6 Методы определения химического состава субстратов после биодеструкции 65
2.7 Оценка действия внесения моноспорового штамма МГ/6 Trichoderma asperellum и гидролизного лигнина на пространственное заселение ризопланы и ризосферы сеянцев 68
2.8 Определение влияния биопрепаратов на основе грибов рода Trichoderma на биогенные процессы в почве 71
3 Экспериментальная часть 76
3.1 Гетерогенность сибирских изолятов вида Trichoderma asper-ellum и скрининг продуктивных штаммов 76
3.2 Антибиотическая активность моноспоровых клонов Trichoderma asperellum в отношении возбудителей фузариозов сеянцев хвойных 89
3.3 Вегетативная совместимость моноспоровых штаммов Trichoderma asperellum 97
3.4 Оценка моноспоровых и исходных штаммов Trichoderma asperellum на устойчивость к фунгицидам 100
3.5 Исследование фенолоксидазной и антибиотической активности моноспоровых штаммов Trichoderma при культивировании на гидролизном лигнине 111
3.6 Утилизация лигноуглеводного комплекса растительных отходов штаммами гриба Trichoderma asperellum 116
3..6.1 Влияние фракционного состава сырья гидролизного лигнина различной степени обработки на биодеструкцию штаммами рода Trichoderma 120
3.7 Оценка действия гидролизного лигнина и Trichoderma asperellum МГ/6 на рост лиственницы сибирской 127
3.7.1 Колонизация ризопланы сеянцев лиственницы сибирской грибами Fusarium oxysporum, F.sporotrichioides и Trichoderma asperellum и их влияние на выпад сеянцев Larix sibirica L. 131
3.8 Влияние гидролизного лигнина и Trichoderma asperellum штамма МГ/6 на биогенные процессы в почве 141
Выводы 146
Литература 148
Введение к работе
Современная стратегия фитосанитарной оптимизации растениеводства направлена на обеспечение экологической безопасности путем внедрения пестицидов с низкой токсичностью и высокой селективностью действия. Особое внимание в этом аспекте заслуживает микробиологический метод, позволяющий снижать плотность популяции фитопатогенов путем подавления их роста за счет антибиотической и литической способности биологического агента.
Традиционным направлением микробиологического метода защиты растений от болезней является использование различных видов рода Tricho-derma, показавших эффективность против многих болезней плодовых, овощных, бобовых и зерновых культур, вызываемых бактериями и грибами (Буйми-стру и др., 1986; Шовкопляс, 1986; Mukhopadhyay et al.; 1986; Sivan, Chet, 1989; Nelson et al., 1988; Devan, Sivasithamparam, 1988; Dunlop et al., 1989; Monaco, 1990). Такой, далеко не полный, перечень работ по использованию грибов рода Trichoderma показывает перспективность использования биологических препаратов на их основе.
Наиболее распространенные виды, упоминаемые в защите растений Т. harzianum, Т. viride, T.hamatum и T.koningn. Накоплен огромный фактический материал по рекомендуемым штаммам видов этого рода, их культу-рально-морфологическим, биохимическим свойствам, а также по технологии получения на их основе биопрепаратов. Т. asperellum - сравнительно недавно описанный вид (Samuels, 1998), и его биоконтрольные свойства изучены не так подробно, как других видов. Однако полученные положительные результаты испытания некоторых штаммов Т. asperellum (Литовка и др., 2002; Громовых, 2002) в защите сеянцев хвойных от фузариозов могут свидетельствовать о целесообразности поиска агентов биологической борьбы среди изоля-тов этого вида.
При исследовании биологии видов рода Trichoderma обычно в первую очередь акцентируют внимание на их антагонистической и микопаразитиче ской активности в отношении фитопатогенных микромицетов и влиянию отдельных экологических факторов на развитие их в культуре или естественных условиях. Однако такие сведения явно недостаточны для прогнозирования процесса интродукции активных штаммов этого рода в почвенные агро-системы.
Гетерогенность популяций грибов по признаку антагонистической активности, скорости репродукции, составу ферментов и.т.д. создает предпосылки для доминирования определенных форм в популяциях из разных регионов. Высокая изменчивость популяций видов рода Trichoderma может являться одной из причин более низкой эффективности биологического контроля по сравнению с лабораторными испытаниями. Многие активные штаммы-продуценты при неблагоприятных условиях хранения и культивирования теряют свои свойства, приближаясь к дикому типу, и вытесняются низкопродуктивными формами. Совершенно очевидно, что решение этих задач представляет экологическую проблему и вызывает необходимость проведения предварительного отбора активных штаммов со стабильными признаками и последующую их тщательную селекцию.
В нашей стране широко применяется препарат «Триходермин» на основе активных штаммов Trichoderma, получаемый путем культивирования этих грибов на различных растительных отходах, как в биологических лабораториях, так и непосредственно в хозяйствах. Для успешной интродукции в последнее время рекомендуют внесение древесных отходов и компостов, как дополнительных источников питания и иммобилизаторов грибов.
Перспективным направлением для получения дешевых биопрепаратов может быть использование в качестве сырья гидролизного лигнина, известного как структурообразователя и источника прогумусовых веществ в почве. Утилизация гидролизного лигнина путем биоконверсии грибами рода Trichoderma является экологически чистым способом, позволяющим вовлекать растительный отход в круговорот углерода.
Цель работы - исследование культурально- морфологических признаков и стабильности моноспоровых культур штаммов Trichoderma asperellum Samuels, выделенных из почв Средней Сибири; разработка критериев отбора штаммов Т. asperellum — антагонистов возбудителей фузариоза, изучение их физиолого-биохимических свойств. На основе использования свойств отобранного штамма Т, asperellum изучить возможность создания биопрепарата на основе гидролизного лигнина. В модельных опытах установить эффективность действия препарата по ограничению развития фузариоза сеянцев хвойных пород.
Задачи исследования:
1. Исследование внутривидовой изменчивости штаммов Т. asperellum, выделенных из почв Средней Сибири.
2. Отбор стабильных штаммов - продуцентов биопрепаратов по культурально- морфологическим признакам, антибиотической активности, вегетативной совместимости и устойчивости к фунгицидам.
3. Исследование возможности утилизации гидролизного лигнина штаммами Т. asperellum.
4. Установление пространственного распределения и колонизации ризо-планы сеянцев хвойных грибами. Оценка эффективности чистой культуры и культуры с гидролизным лигнином отобранного штамма для подавления фузариозного полегания сеянцев.
5. Оценка влияния биопрепаратов, полученных на лигноуглеводных субстратах, на биологическую активность почв.
Научная новизна. Впервые проведена оценка гетерогенности клонов Т. asperellum на территории Средней Сибири. По культурально-морфологическим признакам моноспоровые культуры распределены на 4 морфологических группы. Отобраны стабильные активные моноспоровые клоны, устойчивые к фунгицидам и проявляющие высокую антибиотическую активность в отношении патогенных микромицетов сеянцев хвойных рода Fusarium.
Впервые оценена возможность роста отобранных штаммов грибов на гидролизном лигнине для создания биопрепаратов путем твердофазной ферментации.
Установлено, что совместное внесение лигнина и антагонистически активного штамма Trichoderma asperellum МГ/6 полностью подавляет развитие сосудистого микоза сеянцев Larix sibirica L. Определены места пространственной колонизации фитопатогенными микромицетами и штаммами- антагонистами ризосферы и ризопланы растений.
В модельных опытах оценено влияние биопрепаратов на биологическую активность и сапрофитную микрофлору почв.
Практическая значимость. Установлены критерии оценки при отборе штаммов-антагонистов Trichoderma asperellum рдя защиты сеянцев при ле-совосстановлении.
Создана коллекция культур штаммов Trichoderma asperellum. Отобраны стабильные, высокопродуктивные и антагонистически активные моноспоровые клоны, способные расти на фенолсодержащих средах и гидролизном лигнине.
Биопрепарат из активного моноспорового штамма МГ/6, выращенного на гидролизном лигнине, улучшает биологические показатели почв, подавляет развитие возбудителей фузариозов сеянцев лиственницы и может быть рекомендован в практике защиты хвойных пород.
