Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава I. М о рфол ого-биологические особенности рода Cryptococcus 13
Род Cryptococcus 13
Ультраструктура клеток С. neoformans 23
Молекулярно-генетическая характеристика
Cryptococcus neoformans 25
Глава II. Патогенность криптококков 29
Базовые характеристики патогенных свойств криптококков 29
Ассоциативные взаимодействия С. neoformans с другими микроорганизмами 31
і* 2.3. Современные представления о патогенезе криптококкоза 33
2.4. Факторы патогенности криптококков 39
Капсула 39
Уреаза 50
Лакказа и меланиногенез 53
Фосфолипаза 61
Типы спаривания 65
Рост при повышенных температурах 69
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава III. Объекты и методы исследования 72
3.1. Объекты исследования 72
^ 3.2. Методы исследования 76
3.2.1. Морфологические характеристики изолятов
С. neoformans 76
Изучение патогенности криптококков в опытах на лабораторных животных 76
Сравнительная ультраструктура клеток криптококков........ 78
Способность клеток С. neoformans расти при повышенных температурах 80
Ассимиляция источников углерода и азота тест-культурами криптококков 80
Ферментативная активность криптококков (фосфолипазная, уреазная, фенолоксидазная) 81
Исследование чувствительности криптококков
к флуконазолу и вориконазолу 83
3.2.8. Молекулярно-генетическая характеристика
С. neoformans 84
3.2.9. Особенности патоморфогенеза криптококкоза 84
Патоморфогенез криптококкоза у человека 85
Патоморфогенез экспериментального криптококкоза головного мозга и легких у белых мышей, вызванного различными
по патогенности штаммами криптококков 85
3.2.10. Иммуногистохимическое изучение локализации
капсульного гетерогликана в тканях головного
мозга мышей при криптококкозе 86
Получение экзогликанов, образуемых Cryptococcus neoformans С. РКПГ 719 и humicolus ИБФМ 984 87
Изучение влияния крипто кокковых экзогликанов на выживаемость зараженных мышей 87
Ассоциативные взаимодействия С. neoformans сдругими микромицетами и бактериями in vitro 88
Ассоциативные взаимодействия С. neoformans с другими грибами in vitro 88
Ассоциативные взаимодействия С. neoformans с бактериями in vitro 89
3.3. Статистические методы 90
IV. Морфолого-биологические свойства клинических изолятов
криптококков 93
Происхождение изучаемых штаммов криптококков 93
Морфология штаммов С. neoformans, выращенных на
питательных средах in vitro 93
Определение.патогенности криптококков при внутривенном введении мышам 108
Ассимиляция различных источников углерода и азота 112
Ультраструктура клеток штаммов С. neoformans, выращенных in vitro 116
Генетическая характеристика 17 штаммов С. neoformans, выделенных от больных в России 141
Глава V. Морфо-биологические особенности С, neoformans in vivo 145
Патоморфология криптококкоза у человека 145
Экспериментальный криптококкоз 159
Экспериментальный криптококкоз, вызванный различными по патогенности штаммами Cryptococcus spp 159
Экспериментальный криптококкоз головного мозга при внутривенном заражении мышей высоко патогенным штаммом С. neoformans 1166 174
Экспериментальный криптококкоз головного мозга при внутривенном заражении мышей менее патогенным штаммом С. neoformans 1067 183
5.3. Экспериментальный криптококкоз. Ультраструктура
клеток С. neoformans г .-189
5.3.1. Ультраструктура клеточных стенок и капсул штаммов
С. neoformans в легких и мозге белых мышей
через 7 дней после внутривенного заражения 189
5.3.2. Ультраструктура клеточной стенки и капсулы зрелых
клеток С. neoformans штаммов 1166 и 1067 в мозге
белых мышей через 14 дней после их заражения 204
5.4. Выявление антигена криптококка в головном мозге мышей,
внутривенно зараженных различными штаммами 207
Глава VI. Сравнительное изучение гомологичных экзогликанов в
экспериментах in vivo '212
Влияние криптококковыхэкзогликанов из патогенных и непатогенных криптококков на выживаемость мышей при экспериментальном криптококкозе 212
Патоморфологическое и иммуногистохимическое исследование головного мозга мышей после введения полисахаридов из патогенного и непатогенного криптококков 214
Влияние криптококкового экзогликана, продуцируемого патогенным криптококком, на выживаемость мышей при экспериментальном криптококкозе 215
Глава VII. Факторы патогенности С. neoformans 218
Рост и развитие С. neoformans при повышенных температурах 218
Определение меланинообразующей способности криптококков 220
Определение уреазной активности 224
7.4. Определение фосфолипазной активности криптококков 228
Глава УШ.Ассоциативные взаимодействия Cryptococcus neoformans с
другими грибами и бактериями in vitro 232
Ассоциативные взаимодействия Cryptococcus neoformans с другими грибами in vitro 232
Ассоциативные взаимодействия Cryptococcus neoformans с некоторыми бактериями in vitro 233
Глава IX. Чувствительность изолятов криптококков к флуконазолу и
вориконазолу 241
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 246
ВЫВОДЫ 283
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 285
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 286
ПРИЛОЖЕНИЯ '. 313
СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.... 340
Введение к работе
Cryptococcus neoformans - один из наиболее важных патогенных для человека микромицетов, встречающихся в клинической практике; он вызывает тяжелый менингоэнцефалит и диссеминированные инфекции преимущественно у больных СПИД и иммунодефицитами другого генеза.
Частота криптококкоза в развитых странах мира после введения высоко эффективной анти ретро вирусной терапии составляет 0,3-0,5/100.000 населения. Однако, в развивающихся странах ситуация остается по-прежнему тревожной; по данным конференции по инвазивным микозам в 2002 г среди ВИЧ-инфицированных лиц от криптококкоза умерло 200 000 человек. Сведения о заболеваемости криптококкозом в России в целом отсутствуют, равно как и информация о молекулярных типах, серотипах, вариантах и вирулентности изолятов криптококков.
В настоящее время Россия по темпам прироста числа ВИЧ-инфицированных лиц занимает одно из первых мест в мире и ухудшение данной ситуации в ближайшие годы вполне очевидно [22, 24, 26, 27]. Поскольку криптококкоз является маркерной инфекцией при СПИД, частота его также будет возрастать.
Род Cryptococcus включает 38 видов и только два из них (С. neoformans и С. gattii) являются патогенными. Вместе с тем, биологические особенности этих двух видов изучены недостаточно, включая и факторы патогенности. Наиболее явные из них (рост патогенов при 37 С, продукция меланинов, типы спаривания, активность фосфолипазы и уреазы, капсулообразование), стали известными в последние годы, но простое их перечисление не обеспечивает возможности дифференцировать патогенные криптококки по вирулентности, что могло бы иметь прогностическое значение. Очень мало информации имеется в отношении морфологии тканевых форм возбудителя в процессе инфекции, а также реакции организма больного на различные изопяты С. neoformans, которые могут заметно варьировать по вирулентности.
Несмотря на актуальность проблемы о правомочности отнесения капсульного полисахарида различных серотипов и вариантов С. neoformans в
разряд факторов агрессии, до сих пор нет четкости в понимании разграничения роли капсулы криптококка и ее главного компонента-глюкуроноксиломаннана, в результате чего и капсульный полисахарид и капсулу обычно относят к факторам патогенности.
В последнее время усилился интерес к проблеме ассоциативных взаимодействий грибов с другими микроорганизмами. Однако данные о криптокок-ке - ассоцианте немногочисленны и противоречивы и, как правило, эти данные получены при аутопсиях с констатацией лишь факта наличия микст-инфекций.
В этой связи давно возникла необходимость более глубокого исследования биологии криптококков, в том числе их «поведенческих» характеристик в ассоциациях.
С учетом недостаточной изученности криптококков, как возбудителей угрожающих жизни инфекций, проблема всестороннего исследования биологии названных микроорганизмов является весьма актуальной. Цель исследования
Изучение биологических особенностей патогенных криптококков - изолятов от пациентов в России. Задачи исследования
Провести генотипирование криптококков - изолятов в России.
Идентифицировать криптококки, выделенные от больных, по основным морфо-физиологическим характеристикам для определения их соответствия типовым культурам.
Изучить цитологическую вариабельность патогенных криптококков, полученных в культурах in vitro и от экспериментальных животных, зараженных тест-организмами, с использованием современной световой и электронной микроскопии.
Изучить вирулентность и факторы патогенности изолятов криптококков от больных и некоторых коллекционных штаммов.
Провести сравнительное изучение морфологии возбудителя и патоморфо-логических изменений в аутопсийном материале и при экспериментальном криптококкозе, обусловленном штаммами различной вирулентности.
Изучить влияние капсульного полисахарида на течение экспериментального криптококкоза.
Определить «поведенческие» . реакции криптококков в ассоциациях с другими микроорганизмами.
8. Исследовать чувствительность криптококков к антимикотикам.
Научная новизна исследования
Впервые:
проведен молекулярный анализ российских изолятов криптококков, собранных и изученных в ходе исследования, получена первая информация о различных субпопуляциях С. neoformans;
экспериментально обнаружены штаммовые различия российских изолятов криптококков по морфо-физиологическим свойствам, в том числе - на ультраструктурном уровне;
установлена возможность формирования оригинальных фенотипов крип-тококка у одного и того же больного в процессе инфекции на фоне лечения;
обоснована опосредованная роль капсульного экзогликана как возможного фактора агрессии патогена;
оценены ассоциативные взаимоотношения криптококков с бактериями, дрожжевыми и нитчатыми грибами;
выявлена корреляция между чувствительностью криптококков к антимикотикам азолового ряда (флуконазолу, вориконазолу) и вирулентностью.
выявлена и определена архитектоника типов капсул у криптококков in vitro и in vivo, наряду с пластичностью нативного капсульного материала;
оценены и изучены тканевые формы криптококка в зависимости от вирулентности.
Практическая значимость и внедрение в практику
Полученные данные о внутривидовых штаммных различиях по чувствительности к антимикотикам, вирулентности, особенностям тканевых форм, ферментативной активности С. neoformans, выделяемых из патологического материала, необходимо учитывать в клинической практике постановки диагноза и выбора средств лечения соответствующих больных.
Результаты патоморфологических и электронно-микроскопических исследований являются основой для постановки диагноза криптококкоза в ходе инфекции с учетом дифференциации клеток криптококков на инкапсулированные, бескапсульные и дегенеративные формы.
Результаты изучения взаимоотношения криптококков в ассоциациях с другими микроорганизмами следует экстраполировать на оценку микст-инфекций in vivo и в природных ассоциациях, в которых участником является С. neoformans.
Установлена необходимость определения чувствительности С. neoformans к флуконазолу и вориконазолу in vitro, а также мониторирования чувствительности в ходе лечения.
Основные руководства и пособия, в которых в порядке внедрения использованы результаты исследования:
Руководство для врачей «Перечень основных методов и критериев диагностики микозов», 2001. Рекомендовано к использованию ученым советом НИИ медицинской микологии СПб МАПО.
Учебное пособие «Диагностика микозов», 2004. Рекомендовано Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для системы послевузовского профессионального образования врачей.
Типовая программа и учебные планы послевузовской подготовки в клинической ординатуре по специальности «Лабораторная микология», 2004.
Типовая программа повышения квалификации по специальности «Лабораторная микология», 2004.
Типовая программа профессиональной переподготовки по специальности «Лабораторная микология», 2004.
Типовая программа и учебные планы послевузовской подготовки в интернатуре по специальности «Лабораторная микология», 2004.
Типовая программа и учебные планы послевузовской подготовки в клинической ординатуре по специальности «Клиническая микология», 2004.
Типовая программа повышения квалификации по специальности «Клиническая микология», 2004.
9. Типовая программа профессиональной переподготовки по специальности
«Клиническая микология», 2004.
10. Типовая программа и учебные планы послевузовской подготовки в интер
натуре по специальности «Клиническая микология», 2004.
Материалы диссертации внедрены в работу микологической клиники, лаборатории диагностики микозов, микологического мониторинга и биологии грибов, «Российской коллекции патогенных грибов», лаборатории патомор-фологии НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СПб МАПО, НИИ детских инфекций, Городского патологоанатомического бюро, инфекционной больницы № 30 им. С.П.Боткина г. Санкт-Петербурга; Республиканской клинической инфекционной больницы (Научно-практический центр профилактики и лечения ВИЧ-инфекции у беременных женщин и детей); Центра по профилактике и борьбе со СПИД г.Санкт-Петербурга.
Материалы диссертации внедрены в педагогический процесс ряда кафедр Санкт-Петербургской Медицинской академии последипломного образования (клинической микологии, аллергологии и иммунологии, курса лабораторной микологии, педиатрии с курсом неонатологии, патологической анатомии с курсом цитологии), Положения, выносимые на защиту
Возбудители криптококкоза гетерогенны по биологическим свойствам.
Важнейшими в дифференциации штаммов криптококков по вирулентности являются фосфолипаза, уреаза и фенолоксидаза.
При криптококкозе морфология клеток С. neoformans в тканях взаимосвязана с вирулентностью.
Штаммы патогенных криптококков формируют разные по архитектонике капсулы.
Полисахариды криптококков проявляют защитное действие применительно к клеткам-продуцентам и не.являются непосредственным фактором агрессии или патогенности для макроорганизма.
Установленные различные типы взаимоотношений криптококков в ассоциациях с бактериями, дрожжевыми и нитчатыми грибами имеют важное
клиническое значение при экстраполяции результатов на микробиоту in vivo. 7. Чувствительность криптококков к флуконазолу и вориконазолу необходимо определять неоднократно в ходе лечения, учитывая возможность возникновения их новых фенотипов. Апробация работы
Материалы диссертации доложены на ежегодных научно-практических конференциях по медицинской микологии «Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, Россия, 1999, 2000, 2001, 2002, 2003, 2004 и 2005), на 6-м Российском съезде врачей-инфекционистов (СПб, 2003), на расширенном заседании Российского Общества патологоанатомов с участием инфекционистов и микологов (СПб, 2003), на Втором Всероссийском Конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2004), на 13 и 14-м Конгрессах Международного Общества медицинских и ветеринарных микологов (Италия, 1997 , Аргентина, 2000), на 6,7-м и 9-м Конгрессах Европейской Конфедерации по медицинской микологии (Испания, 2000, Греция, 2001, Нидерланды, 2003), на 3, 4-й и 5-й Международных конференциях «Криптококк и криптококкоз» (Париж, 1996, Лондон, 1999, Аделаида, 2000, Бостон, 2005). Публикации по материалам исследования
По теме диссертации опубликовано 52 работы в научных журналах и сборниках, в том числе 20 из них в изданиях, рекомендованных ВАК. Личный вклад автора
Автор планировал, выполнял и руководил исполнением основных экспериментальных исследований по проблеме. В выборе главного направления исследований, в постановке и решении конкретных задач, организации и выполнении экспериментальных исследований автору принадлежит ведущая роль.
Доля участия автора в сборе изолятов патогена и аутопсий - 50%; в разработке и исполнении программ разделов исследований - 90%; доля участия в обработке данных - 90%; в анализе и обобщении экспериментального материала-100%.
Объем и структура работы
Диссертация состоит из введения, 9 глав, выводов, списка цитируемой литературы (280 наименований) и приложения. Полный объем работы составляет 340 страниц, включая 94 рисунка и 45 таблиц.
