Содержание к диссертации
ГЛАВА I. Сопряженная эволюция Puccinia triticina Erikss. с видами семейства Роасеае Bamh. и современное состояние представлений о цитофизиологических основах взаимодействия растений с ржавчинными грибами1.1. Общая характеристика возбудителя бзфой ржавчины пшешщы и его роль в агро- и биоценозах
1.2. Микроэволюция в популяциях ржавчинных грибов
1.3. Проблема сохранения длительной устойчивости культурных растении и представление о способах ее решения
1.4. Использование родственных и дикорастущих видов для расширения генофонда культурных растении
1.5. Современное состояние цитологических и физиологических исследований взаимодействия патогенных грибов с растениями
1.5.1. Основные этапы цитологических исследований взаимодействия ржавчинных грибов с растениями
1.5.2. Клеточные особенности взаимодействия ржавчинных грибов
32 с видами-нехозяевами
1.5.3. Цитологические аспекты взаимодействия
37 ржавчинных грибов с растениями-хозяевами
1.6. Роль активных форм кислорода, фенольных соединений, PR- белков и системной приобретенной устойчивости в защите растений
ГЛАВА II. Объекты и методы исследований
2.1. Организация и общая схема исследований по теме диссертации
2.2. Объекты исследований
2.3. Методы исследований
2.3.1. Изучение устойчивости растений в полевых условиях
2.3.2. Проведение экспериментов в лабораторных условиях
2.3.3. Гистологические исследования
2.3.4. Цитохимические исследования
2.3.5. Люминесцентная микроскопия
2.3.6. Электронно-микроскопические исследования
2.3.7. Физиологические исследования
2.3.8. Объем выборки и статистическая обработка данных
2.3.9. Реактивы, использованные в исследованиях
2.4. Список сокращений
ГЛАВА III. Цитофизиологические основы взаимодействия Puccinia
72 triticina с видами-нехозяевами
3.1. Цитологические проявления устойчивости видов-нехозяев
72 к бурой ржавчине
3.2. Роль окислительного взрыва и синтеза белков в защите видовнехозяев
3.3. Взаимодействие Р. triticina с рожью посевной Secale sereale
3.4. Защитные реакции ржи в ответ на инфицирование Р. triticina
3.5. Механизмы устойчивости пшенично-пырейных гибридов, созданных на основе Agropyron elongaium
3.6. Обсуждение результатов
ГЛАВА IV. Изучение устойчивости образцов пшеницы в полевых условиях
ГЛАВА V. Цитологические особенности
135 взаимодействия Puccinia triticina с Triticum aestivum
5.1. Взаимодействие P. triticina с линиями, гены которых придают
135 устойчивость на стадии проростков
5.2. Взаимодействие Р. triticina с линиями, защищенными генами
143 возрастной устойчивости
5.3. Ультраструктурные особенности взаимоотношений Р. triticina
152 с восприимчивыми и устойчивыми растениями пшеницы
5.3.1. Ультраструктзфная основа биотрофного взаимодействия
152 патогена с восприимчивой линией пшеницы с геном Lrl4b
5.3.2. Ультраструктурные аспекты взаимодействия возбудителя бурой ржавчины с иммунной линией с геном Lrl
5.4. Обсуждение результатов
ГЛАВА VI. Активные реакции пшеницы при взаимодействии с Р. triticina
6.1. Роль окислительного взрыва в защите пшеницы от Р. triticina
6.2. Эволюция цитофизиологических взаимоотношений Р. triticina с Triticum aeslivwn при становлении признака вирулентности
6.2.1. Взаимодействие Р. triticina с линией сорта Тэтчер с геном Lrl
6.2.2. Взаимодействие Р. triticina с линией сорта Тэтчер с геном Lr
6.2.3. Взаимодействие Р. triticina с линией сорта Тэтчер с геном Lr
6.3. Особенности защитных реакций линий сорта Тэтчер с генами возрастной устойчивости
6.4. Обсуждение результатов
ГЛАВА VIL Влияние системной приобретенной устойчивости на развитие бурой ржавчины пшеницы
7.1. Влияние индуцированной устойчивости на взаимодействие Р. triticina с линиями сорта Тэтчер с генами Lrl и Lr
7.2. Модификация возрастной устойчивости индукторам и системной приобретенной устойчивости
7.2.1. Изучение влияния индукторов в полевых и лабораторных условиях
7.2.2. Влияние SAR на цитофизиологические проявления возрастной устойчивости пшеницы
7.3. Обсуждение результатов .%
Введение к работе
Возбудитель бурой ржавчины Puccinia triticina Erikss. — специализированный паразит, поражающий мягкую пшеницу ТгШсит aestivum L. и другие виды злаков. В природных популяциях происходит непрерывный процесс сопряженной эволюции, приводящий к преодолению ржавчинными грибами устойчивости растений. По мере развития сельскохозяйственного производства появились гигантские искусственные фитоценозы (агроценозы), состояпще из посевов основной зерновой культуры — мягкой пшеницы. В агроценозах существенно ускорились микроэволюционные процессы, в результате в популяциях патогенных грибов постоянно возникают вирулентные и высоко агрессивные патотипы, преодолевающие устойчивость растений (Baum, Savile, 1985; Hansen, 1987). Ежегодные потери урожая пшеницы от бурой ржавчины составляют 5—
15%, а во время эпифитотий - до 45-70% (Чумаков, 1964; Санин, 1995; Лебедев, 2000).
Создание и использование устойчивых сортов считается наиболее действенным способом запщты культурных растений от болезней. В связи с преодолением устойчивости культурных растений в результате коэволюции патогенных микроорганизмов, необходимо пополнение их генофонда генами устойчивости. На важность расширения набора генов устойчивости указывал Н. И. Вавилов, который рекомендовал использовать для гибридизации экологически отдаленные образцы и дикорастущие сородичи культурных растений (Вавилов, 1986). Во второй половине XX в. генофонд пшеницы существенно обогатился за счет родственньис видов рода ТгШсит, а также Secale, Aegilops, Agropyron. В настоящее время устойчивость сортов пшеницы поддерживается преимущественно интрогрессированными генами дикорастущих злаков.
По определению Н.И.Вавилова «...видовым называется иммунитет, проявляемый к патогену видом растений в целом». После его преодоления растения могут быть зацщщены от поражения факторами сортовой устойчивости (Вавилов, 1986). Понятия видового и сортового иммунитета, введенные Н.И. Вавиловым, равнозначны понятиям устойчивости видов-нехозяев и хозяев (nonhost и host resistance) (Ellingboe, 1976; Heath, 1981a), используемым в зарубежной литературе. Поскольку видовой иммунитет стабильно защищает растения от поражения подавляюищм числом патогенов, он постоянно привлекает внимание исследователей (Heath, 2000). В настоящее время фзгндаментальные основы видового иммунитета находятся в стадии изучения. Хотя в настоящее время сорта культурных растений преимущественно защищены чужеродными генами, однако практически отсутствует информация о проявлении интрогрессированных генов в геноме культурных растений.
С учетом накопленного отрицательного опыта поражения сортов особое внимание уделяется приданию растениям длительной устойчивости. Доказано, что длительная устойчивость может контролироваться моно-, олиго- и полигенно (Nelson, 1978; Parlevliet, 1993; Михайлова, 2005). В международном центре CIMMYT созданы сорта шпешщы с длительной устойчивостью, на которых, несмотря на восприимчивый тип реакции растений, болезнь развивается медленно. Такой тип устойчивости назвали «замедляющим развитие ржавчины» (slow rusting) (Caldwell, 1968) или «частичной устойчивостью» (partial resistance) ( (Parlevliet, 1975). При создании сортов с частичной устойчивостью к бурой ржавчине широко использовали гены возрастной устойчивости Lrl3 и Lr34, которые в сочетании с 2-3 дополнительными генами обеспечивали стабильную и длительную защиту растений (Kolmer, 1996; Singh, 2003). Следует отметить, что, несмотря на весомые селекционные достижения мало известно о цитофизиологических механизмах, надежно предохраняющих растения от болезней, в частности, особенностях действия высоко эффективных генов, механизмах возрастной устойчивости.
Цитологические исследования вносят весомый вклад в изучение взаимодействия патогенных микроорганизмов с растениями и являются одним из основных направлений фитоиммунологии. Наиболее активно цитологические исследования на различных патосистемах проводили в 60-80-х гг. XX в. Исследования взаимодействия ржавчинных грибов с устойчивыми сортами и линиями в основном проводили на патосистемах: «Р. graminis Pers.f. sp. tritici — мягкая пшеница Т. aestivum» (Ehrlich, 1968; Samborski, 1977; Harder, 1984 и т.д. ); «P. hordei G.H, Otth— ячмень посевной Hordeum sativum jess.» (Niks, 1983, 1986); «Melampsora lini (Ehrenb.) Lev. — лен Linmn usitatisslmum L.» (Littlefield, 1971; Coffey, 1972, 1976 и т.д.); C/rowyces vignae Barclay — вигна Vigna sinensis (Stickm.) (Heath, 1972, 1982 и т.д.), В СССР основные исследования цитофизиологических взаимоотношений возбудителей стеблевой Puccinia graminis f. sp.
tritici и желтой P. striiformis Westend. ржавчины с пшеницей проводились в ГБС АН СССР Ю.М. Плотниковой с сотрудниками и учениками (Г.В.Сережкиной, Л.Г. Зайцевой, В.В. Карпуком и др.).
Хотя бурая ржавчина пшеницы - наиболее широко распространенное заболевание пшеницы в мире, цитологические особенности патогенеза изучены недостаточно. Цитологические исследования взаимодействия Р. triticina с рядом устойчивых сортов пшеницы были проведены в 70-х гг. XX в. под руководством М.П. Лесового в УкрНИИСХ и Б.Г. Рейтера в СибНИИСХ (Рейтер, 1976; Рейтер, Юдкин, 1981 и др.). Позже за рубежом были изучены цитологические проявления некоторых генов возрастной устойчивости (Rubiales, 1996; Martinez, 2001), Начиная с 90-х гг. XX в. цитологические исследования взаимодействия ржавчинных грибов с растениями в мире были существенно сокращены, а в России прекратились. В настоящее время регулярные цитофизиологические исследования в данном направлении проводятся только на примере взаимодействия грибов рода Uromyces с видами растений семейства Бобовые под руководством М, Хис (М. Heath) в университете г, Торонто (Канада).
Следует отметить, что ранее основная часть цитофизиологических исследований была выполнена на образцах культурных растений с генами расоспецифической устойчивости, при этом основное внимание удалялось характерным особенностям протекания реакции СВЧ, Однако в последние десятилетия были сделаны фундаментальные открытия в области фитоиммунологии, касающиеся роли активных форм кислорода, защитных PR-белков, системной приобретенной устойчивости в запщте растений. Цитологические проявления этих механизмов и их роль в запщте растений от ржавчинных грибов практически не изучены. В связи со сложившейся ситуацией цитофизиологические исследования механизмов устойчивости к Puccinia triticina видов-нехозяев, сопряженной эволюции гриба с растениями, функционирования интрогрессированных генов в геноме пшеницы, роли отдельных цитофизиологических факторов в запщте растений от биотрофных ржавчинных грибов высоко актуальны.
Они вносят фундаментальный вклад в развитие теории иммунитета растений, а также имеют большое значение для практической защиты пшеницы от бурой ржавчины.
Диссертационная работа вьшолнена в ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет» (ОмГАУ) в период с 2003 по 2008 гг. в рамках темы «Изучение цитофизиологических механизмов длительной и индуцированной устойчивости пшеницы к бурой ржавчине» (№ Гос. регистрации 0120.0 509874).
Целью работы было выявление фундаментальных основ видового иммунитета растений к Puccinia triticina Erikss. и цитофизиологических аспектов сопряженной эволюции гриба с видами семейства Роасеае Bamh.
В соответствии с поставленной целью были определены задачи — изучить цитологическую основу взаимодействия Р. triticina с растениями видов-нехозяев, принадлежащих к классам Двудольные и Однодольные; — выявить комплекс пассивных и активных факторов, определяющих устойчивость к Р. triticina видов семейства Мятликовые Роасеае: Zea mays L., Panicum miliaceum L., Avena sativa L., Secale cereals L., Agropyron elongatum (Host) Beauv.; — на примере пшенично-пырейных гибридов выявить комплекс цитологических факторов видового иммунитета Ag. elongatum к бурой ржавчине; — изучить гистологические и ультраструктурные особенности взаимодействия Р. triticina с почти изогенными линиями сорта Тэтчер и иммунными аналогами сорта Новосибирская 67; — исследовать цитофизиологические аспекты сопряженной эволюции Р. triticina с Т. aestivum при преодолении генов устойчивости Lrl9, Lr23, Lr24; — выявить цитофизиологическую основу возрастной устойчивости пшеницы к бурой ржавчине; — исследовать цитофизиологические аспекты влияния системной приобретенной устойчивости на развитие бурой ржавчины пшеницы; — внедрить результаты исследований в процесс обучения студентов, а также в программу селекции сортов пшеницы.
Наз^ная новизна исследований определяется тем, что впервые исследовано взаимодействие Р. triticina с видами-нехозяевами различного таксономического положения. Выявлено значение пассивных факторов в форме нарушения стимуляции морфогенеза инфекционных структур гриба, а также активных реакций в защите растений. Установлены комплексы цитологических факторов, обеспечивающих устойчивость к Р. triticina ржи S. cereale и пырея удлиненного Ag. elongatum. На большом наборе изогенных линий пшеницы сортов Тэтчер и Новосибирская 67 показано, что интрогрессированные гены определяют экспрессию отдельных механизмов устойчивости видов-нехозяев в геноме мягкой пшеницы. Продемонстрирована цитофизиологическая основа сопряженной эволюции Р. triticina с пшеницей при преодолении генов устойчивости Lrl9, Lr23 и Lr24. Выявлена цитофизиологическая основа возрастной устойчивости пшеницы к бурой ржавчине. Установлена роль активных форм кислорода, каллозы, фенольных соединений с различными оптическими свойствами, индуцированной устойчивости в запщте растений от бурой ржавчины пшеницы. Продемонстрирован комплекс цитофизиологических механизмов, развивающихся в растениях при обработке химическими индукторами системной приобретенной устойчивости.
Теоретическая значимость работы определяется расширением фундаментальных представлений об иммунитете растений к биотрофным грибам. Выявлен комплекс пассивных и активных факторов, составляющих цитофизиологическую основу устойчивости видов-нехозяев к Р. triticina. Продемонстрирована цитофизиологическая основа сопряженной эволюции ржавчинного гриба с растениями. Доказано, что интрогрессированные в геном пшеницы гены обеспечивают экспрессию отдельных механизмов устойчивости видов-нехозяев. Гены устойчивости, введенные в генофонд пшеницы, классифицированы по цитофизиологическим механизмам. Выявлена цитофизиологическая основа действия генов длительной устойчивости. Сформулирована гипотеза возрастной устойчивости пшеницы к бурой ржавчине. Выявлены новые механизмы устойчивости в форме окислительного взрыва на устьицах растений, разрушения инфекционных струтстур Р. triticina в тканях линий Lr23, Lr24 и Lr37. Продемонстрировано влияние индуцированной устойчивости на развитие бурой ржавчины пшеницы.
Практическая значимость результатов определяется тем, что выявлены характерные проявления генов, доказавших длительную эффективность и установлены цитологические маркеры, которые могут быть использованы при отборе перспективных доноров устойчивости. Разработаны методы изучения развития инфекционных структур в тканях и выявления запщтных реакций растений (А.С. Л.Я. Плотникова «Способ обнаружения возбудителя ржавчинного заболевания в листьях пшеницы» № 16612586. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 8 августа 1990 г.; РИП Л.Я. Плотникова «Технология выявления мицелия ржавчинных грибов и защитных реакций в целых листьях растений». Зарегистрирован ФГУП «ВНТИи>> 07 марта 2008 г.
№ 73200800017). Теоретические результаты исследований использованы при разработке учебника для вз^ов. Результаты работы использованы для разработки программы селекции мягкой пшеницы на устойчивость к бурой ржавчине в лаборатории селекции мягкой пшеницы и тритикале ОмГАУ. Сорт пшеницы ОмГАУ-90 с комплексной устойчивостью к листовым патогенам, созданный с применением результатов работы, передан на Госсортоиспытание в 2008 г.
Практическая значимость работ подтверждена соответствующими документами (приложение).
в диссертации обобщены результаты исследований, проведенных лично автором и под его руководством.
Автор выражает искреннюю благодарность научному консультанту зав.
кафедрой микологии и альгологии МГУ проф., докт. биол. наук Ю.Т. Дьякову за помощь в подготовке диссертации, а также благодарит заведующего лабораторией иммунитета СибНИИСХ канд. биол. наук Л.В. Меппсову, заведующего лабораторией селекции мягкой пшеницы и тритикале ОмГАУ канд. биол. наук Г.М. Серюкова, ведущего сотрудника ИЦиГ СО РАСХН канд. биол. наук Ф. Коваля за предоставление материала для исследований. Автор благодарит сотрудников кафедры селекции, генетики и физиологии растений ОмГАУ за помощь в выполнении диссертационной работы.
