Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Francisella tularensis - грамотрицательная факультативно внутриклеточная неподвижная мелкая плеоморфная бактерия, вызывающая заболевание у людей и животных, ареал распространения которой охватывает в основном зону умеренного климатического пояса Северного полушария. Различают 4 подвида F. tularensis: subsp. nearctica (встречается только в Северной Америке), subsp. holarctica (Северное полушарие), subsp. mediasiatica (только в Средней Азии) и subsp. novicida (Северная Америка и тропическая Австралия) [Олсуфьев Н.Г., 1975; Oyston P.C.F. et al., 2003; Whipp M. J, 2003; Splettstoesser W.D. et al., 2005], для которых характерна относительная генетическая однородность (до 90%) [Домарадский И.В., 2005]. Несмотря на достигнутые успехи в исследовании особенностей строения и биологии туляремийного микроба, факторы патогенности этого возбудителя, состав капсулы и протективные антигены окончательно не установлены [Havlasova J. et al., 2002; Sjostedt A., 2003; Eyles J.E., 2007; Oyston P.C.F., 2008; Santic M., 2010]. Эндемичные очаги туляремии характеризуются стабильностью проявления и широко распространены, в том числе на территории России и соседних стран [Tarnvik A. et al., 2004; Топорков В.П. и др., 2007, Безсмертный В.Е. и др., 2008]. Кроме того, возбудитель туляремии включен в высшую категорию А как потенциальный агент биотерроризма [Dennis D. et al., 2001; Gallagher-Smith M. et al, 2004].
Лабораторная диагностика туляремии в настоящее время основывается на иммунологических (сероаллергологическая диагностика) и бактериологических методах [Лаб. диагност. ООИ, 2009]. В области разработки новых способов детекции туляремийного микроба ведутся активные исследования [Splettstoesser W. D. et al., 2005; Hotta A. et al., 2007]. Тест-системы на основе молекулярно-генетических методов интенсивно разрабатываются и в настоящее время включены в схему лабораторной диагностики туляремии [Лаб. диагност. ООИ, 2009]. У возбудителя туляремии ли-пополисахарид (ЛПС) и белки внешней мембраны (ВМ) влияют на специфичность иммунного ответа макроорганизма, обладают уникальной полиэпитопной антигенной структурой и рассматриваются как перспективные антигены для создания профилактических и диагностических препаратов [Родионова И.В., Захаренко В.И., 1990; Хлебников B.C. и др., 1992, 1993; Ellis J. et al., 2002; Conlan J.W. 2004; Oyston P.C.F., 2008]. Оценка эффективности тест-систем для иммуноферментного анализа (ИФА) показала, что диагностикумы на основе препаратов ЛПС F. tularensis или от-
дельных белков ВМ (43 и 17 кДа) обладают более низкой чувствительностью (96,5-99,0%) и специфичностью (96-97%), чем на основе комплекса белков ВМ - 100% специфичность и чувствительность [Bevanger L. et al., 1988, 1989; Schmitt P. et al., 2005; Splettstoesser W. D. et al., 2005].
К антигенным структурам сложной химической природы относится поверхностный С-комплекс, обладающий выраженными иммуномодулирующими свойствами [Родионова И.В., 1989; Юров СВ. и др., 1991; Хлебников B.C. и др., 1994; Жемчугов В.Е., 2004]. В составе данного антигена, полученного из клеток вакцинного штамма F. tularensis 15 линии НИИЭГ (С-15), были определены белки, липиды и углеводы, установлена его протективная активность для белых мышей при экспериментальной туляремии, а также отсутствие токсичности и повреждающего действия на иммунокомпетентные клетки [Шепелев И.А., 2005; Волох О.А. и др., 2007]. В то же время недостаточно изучены особенности строения и состава С-комплекса туля-ремийного микроба разных подвидов и его антигенные, биохимические и иммунобиологические свойства. Полученные данные позволят оценить возможность применения С-комплекса для разработки новых экспериментальных иммунодиагности-ческих препаратов.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - определение особенностей структуры и свойств антигенного С-комплекса туляремийного микроба разных подвидов, оценка возможности использования в иммунодиагностике туляремии.
-
Получить препараты антигенного С-комплекса туляремийного микроба разных подвидов, провести их сравнительный анализ.
-
Разработать методические подходы для выделения и очистки компонентов С-комплекса туляремийного микроба.
-
Определить оптимальную схему иммунизации животных-продуцентов для получения туляремийных поликлональных антител.
-
Разработать методические подходы для выявления и количественного определения С-комплекса туляремийного микроба и его компонентов с применением различных вариантов иммуноанализа.
-
Разработать на основе антигенного С-комплекса туляремийного микроба экспериментальные иммунодиагностические препараты для детекции возбудителя туляремии и противотуляремийных антител.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. На основе сравнительного анализа структуры и свойств полученных препаратов С-комплекса из штаммов туляремийного микроба подвидов holarctica, nearctica, mediasiatica установлено, что их молекулярная масса в натив-ных условиях составляет около 280 кДа, все препараты сходны по химическому (содержат белки 62±5%, липиды 27±6% и углеводы 15±3%) и субъединичному составам (содержат иммунохимически активные субъединицы: 81-85, 57-60, 43, 23-27 и 14-17 кДа). В составе препарата С-15 с помощью протеомного анализа подтверждено наличие указанных выше субъединиц, среди которых впервые идентифицированы биологически активные молекулы - белки-шапероны (GroES и GroEL), три фермента, три белка ВМ и регуляторный белок (фактор элонгации EF-Tu).
Препараты С-комплекса основных подвидов обладают протективными свойствами для лабораторных животных при экспериментальной инфекции, вызванной вирулентными штаммами голарктического, неарктического и среднеазиатского подвидов и индуцируют в организме лабораторных животных образование антител в ранние сроки. С-комплекс из F. tularensis subsp. novicida отличается от аналогичных антигенов других подвидов большим содержанием углеводной части (26,5±1,2%), наличием субъединиц с молекулярной массой более 110 кДа и отсутствием иммуно-реактивных белков в области 57-85 кДа. Установлено снижение иммунохимической (в 5 раз) и протективной активностей этого препарата.
Усовершенствованы отдельные этапы получения компонентов С-комплекса туляремийного микроба, разработаны иммунохимические методы (ИФА, иммунодот -ДИА, иммуноблоттинг) их выявления и количественного определения. Установлено, что компоненты С-комплекса с молекулярными массами более 23 кДа имеют белковую природу, а субъединицы 14-17 кДа - липопротеидную. Впервые было показано, что С-комплекс регистрируется у туляремийного микроба независимо от формы ЛПС и наличия капсулы.
Чувствительность экспериментальных препаратов на основе антител к С-комплексу туляремийного микроба для детекции возбудителя туляремии разных подвидов иммунодиагностическими методами (ИФА, ДИА) составляет 10 -105 м.к./мл. Иммуносуспензионный метод на основе реакции латекс агглютинации позволяет выявлять как Сар+, так и Сар" штаммы туляремийного микроба, в отличие от коммерческого диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РИГА). Использование С-15 в качестве маркерного антигена в иммуноблоттинге и ИФА
(ДИА) позволяет определять туляремийные антитела у лабораторных животных (вакцинированных и экспериментально зараженных).
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Разработаны методы выделения компонентов С-комплекса туляремийного микроба с помощью ферментативного и химического гидролиза с последующей хроматографической очисткой, позволяющие с наименьшими затратами получать эти препараты в лабораторных условиях. Полученные препараты С-комплекса разных подвидов используются при выполнении научно-экспериментальных работ в лабораториях вакцинологии и иммунопрофилактики, иммунодиагностики и молекулярной диагностики РосНИПЧИ «Микроб». Полученные в результате работы научные данные об особенностях антигенного строения туляремийного микроба используются на курсах первичной специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования по специальности «бактериология» в институте «Микроб» при чтении лекций цикла «Микробиология и лабораторная диагностика туляремии».
По результатам проведенных научных исследований разработаны методические рекомендации «Применение антител к С-комплексу туляремийного микроба для детекции возбудителя туляремии методами иммуноанализа», одобренные Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 2 от 17.04.2008 г.) и утвержденные директором института.
Похожие диссертации на Структурная и функциональная характеристика антигенного C-комплекса туляремийного микроба разных подвидов
