Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Взаимодействие микроорганизмов с биотическими и абиотическими факторами среды 12
1.1. Лизоцим - как антимикробный фактор природных биоценозов 12
1.2. Антропогенные факторы среды - тяжёлые металлы 15
1.3. Роль микроорганизмов в аккумуляции тяжёлых металлов вбиосфере 19
1.4. Биология актинобактерий рода Rhodococcus sensu stricto 32
1.4.1. Биологические и физиологические особенности ... 32
1.4.2. Систематическое положение 38
ГЛАВА 2. Объект и методы исследования 41
2.1. Рабочая коллекция, бактериальные штаммы, используемые в экспериментальных исследованиях 41
2.2. Определение численности и уровня активности ан-тилизоцимных бактерий 41
2.3. Определение численности и уровня активности ли-зоцимных микроорганизмов 42
2.4. Получение препарата лизоцима моллюска U. pictorum 43
2.5. Определение чувствительности исследуемых штаммов родококков к лизоциму моллюска U. pictorum 45
2.6. Атомно-адсорбционный метод определения содержания токсичных элементов (меди, цинка, кадмия и свинца) 46
2.7. Методика определения содержания металлов в микробной массе 48
2.8. Метод оценки чувствительности родококков к ионам тяжёлых металлов: меди, цинка, кадмия и свинца 48
2.9. Расчёт времени генерации 50
2.10. Способ оценки чувствительности актинобактерий вида R. ruber на воздействие металлов 50
2.11. Статистическая обработка результатов 50
2.11.1. Метод корреляционного и регрессионного анализа 50
2.11.2. Метод факторного анализа 52
ГЛАВА 3. Оценка распространённости лизоцимнои и антилизоцимной активностей у актинобактерий рода rhodococcus 54
ГЛАВА 4. Лизоцим моллюска unio pictorum и типы ответных реакций к нему актинобактерий рода rhodococcus sensustricto 61
4.1. Характеристика типов ответных реакций актино бактерий рода Rhodococcus sensu stricto на воздействия лизоцима моллюска U. pictorum 66
4.2. Оценка степени чувствительности актинобактерий рода Rhodococcus к лизоциму моллюска U. pictorum с использованием математического анализа 84
4.3. Заключительный обзор о типах ответных реакций актинобактерий рода Rhodococcus на воздействия лизоцима моллюска U. pictorum 96
ГЛАВА 5. Оценка степени устойчивости и чувствительности актинобактерий вида r. ruber на воздействие тяжёлых металлов 104
5.1. Ответные реакции актинобактерий вида R. ruber на воздействие абиотических факторов водной среды (тяжёлых металлов) 104
5.2. Способность актинобактерий вида R. ruber к аккумуляции цинка, кадмия, свинца и меди 116
5.3. Методика выращивания Rhodococcus ruber, используемых для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов: цинка, кадмия и свинца 120
Заключение 124
Выводы 139
Список литературы 141
Приложение 155
- Лизоцим - как антимикробный фактор природных биоценозов
- Биологические и физиологические особенности
- Характеристика типов ответных реакций актино бактерий рода Rhodococcus sensu stricto на воздействия лизоцима моллюска U. pictorum
- Ответные реакции актинобактерий вида R. ruber на воздействие абиотических факторов водной среды (тяжёлых металлов)
Введение к работе
Сукцессионные изменения в бактериальных сообществах водных экосистем определяются степенью их экологической толерантности к биотическим и абиотическим факторам среды. Выживание бактерий в условиях водоёма основано на их ответных реакциях во взаимоотношениях с природными и антропогенными факторами водной среды, в основе которых лежат как специфические (через среду обитания), так и неспецифические (проявляющиеся в разной динамике роста и размножения популяций бактерий) механизмы регуляции этих взаимоотношений (Пшеничное Р.А. и др., 1975; Бухарин О.В., Литвин В.Ю., 1997).
Особое место в бактериальных сообществах водоёмов занимают алка-нотрофные родококки, обладающие функциональным разнообразием и характерным комплексом реализуемых стратегических приёмов выживания. Изучение данной группы микроорганизмов приобретает всё большую экологическую значимость на фоне современного кризиса окружающей среды, когда увеличивается число местообитаний, в которых организмы находятся в экстремальных условиях (Ившина И.Б., 1997).
Попадая в условия открытого водоёма или пруды биологической очистки, родококки на разных этапах своего существования встречаются с широко распространённым у гидробионтов ферментом — лизоцимом (Tripp М. R., 1961; Ломакин М.С., 1990; Соловых Г.Н., 1995; Карнаухова И.В., 2001), и хотя накоплено достаточно много данных об антимикробном действии этого фермента (Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1974; Купер Э., 1980; Подборнов В.Е., Бердыев А.Н., 1991), но до сих пор не достаточно полно изучен вопрос об ответных реакциях актинобактерий рода Rhodococcus sensu stricto к действию данного природного фактора.
Исходя из полученных данных о существовании в условиях водного биоценоза взаимодействий „моллюски - бактерии", основанных на способности гидробионтов за счёт антибактериальных факторов воздействовать на микроорганизмы и данных о наличии у моллюсков лизоцима (Карнаухова
И.В., 2000), представлялось логичным оценить воздействие лизоцима моллюсков на актинобактерии рода Rhodococcus sensu с целью оценки их потенциальной способности адаптироваться к биотическим факторам природных водоёмов.
В условиях природного биоценоза актинобактерии испытывают воздействия не только биотических, но и антропогенных факторов среды, в том числе тяжёлых металлов (Илялетдинов А.Н., 1984; 1989), и хотя в процессе эволюции живые организмы приспособились к наличию тяжёлых металлов в окружающей среде и выработали определённые механизмы регуляции к их усвоению, но в условиях растущего техногенного загрязнения остаются некоторые допустимые количества поглощения тяжёлых металлов, выше которых регуляторные механизмы уже не справляются с проявлением негативного воздействия на организм, тем более, что в литературе остаётся до сих пор спорным вопрос о наличии плазмид устойчивости к металлам у представителей рода Rhodococcus sensu stricto вида R. ruber. Всё выше сказанное (недостаточная изученность вопросов адаптации родококков к условиям природных водоёмов, их биологических характеристик, обеспечивающих функционирование актинобактерии в биотопах водоёмов и возможность интродукции родококков в открытые водные экосистемы с целью активизации процессов самоочищения), свидетельствует об актуальности углубленного изучения особенностей ответных реакций бактерий к воздействиям природного фактора гидробиоценоза - лизоцима и антропогенного фактора — тяжёлых металлов, обеспечивающих их адаптацию в условиях водоёма и ещё большую значимость этот вопрос приобретает потому, что актинобактерии этого рода являются наиболее разрабатываемыми в прокариотологии биотехнологически перспективной группой микробов (Finnerti W., 1992; Wahust К., Fewson Т.Е., 1994).
Цель исследования - изучение особенностей ответных реакций бактерий рода Rhodococcus на воздействие природного - лизоцима и антропоген-
ного - тяжёлые металлы факторов водной среды, обеспечивающих их адаптацию в условиях водоёма.
Задачи исследования, 1. Изучить распространённость лизоцимного и антилизоцимного факторов у бактерий рода Rhodococcus, выделенных из природных водных источников.
2. Провести оценку характера ответных реакций актинобактерий рода
Rhodococcus к лизоциму моллюска Unio pictorum и тяжёлым металлам.
3. Оценить роль антилизоцимной активности актинобактерий рода
Rhodococcus в механизмах ответных реакций родококков на воздействие ли-
зоцима моллюска U. pictorum.
4. Обосновать методические подходы к охране водоёмов от антропо
генного загрязнения тяжёлыми металлами.
Научная новизна. Обнаружено наличие лизоцимной и антилизоцимной активностей у штаммов родококков, принадлежащих к 6 видам. Выявлен широкий диапазон толерантности видов R. ruber, R. luteus, R. erythropolis, R. rhodnii, R. rhodochrous и R. egui к природному фактору - лизоциму моллюска U. pictorum: лизоцимчувствительность, лизоцимустойчивость и лизоцим-зависимость. Показано, что в механизмах ответных реакций актинобактерий к воздействиям лизоцима играет роль антилизоцимная активность, то есть выявлена система лизоцим моллюска U. pictorum — антилизоцимная активность актинобактерий рода Rhodococcus. Уровень АЛА определяет степень чувствительности и устойчивости родококков к лизоциму: отсутствие АЛА или её низкий уровень - 2 мкг/мл - определяет чувствительность, а уровень 6 - 8 мкг/мл - устойчивость и зависимость к лизоциму. Установлено, что маркером высокой чувствительности к лизоциму моллюска U. pictorum у родококков является отсутствие АЛА или её низкий уровень (2 мкг/мл).
Выявлен разный характер ответных реакций актинобактерий вида R. ruber к антропогенному воздействию тяжёлых металлов, проявляющийся в изменении динамики роста и последовательности прохождения фаз развития микробной популяции.
Выделены устойчивые к загрязнениям водной среды цинком, кадмием и свинцом штаммы вида R. ruber (ИЭГМ 219, ИЭГМ 220, ИЭГМ 221, ИЭГМ 222, ИЭГМ 338, ИЭГМ 347) и показана их способность к аккумуляции этих металлов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные расширяют знания о биологических свойствах актинобактерий рода Rhodococcus (лизоцимной и антилизоцимной активностей) и представления о характере и механизмах ответных реакций на природные (лизоцим) и антропогенные (тяжёлые металлы) воздействия водной среды, обеспечивающих их сохранение в водных биоценозах, что позволяет использовать научно - обоснованные подходы к формированию микробных сообществ водоёма.
Практическое значение исследования заключается в возможности использования показателя персистенции бактерий - антилизоцимной активности, как маркера в оценке степени чувствительности родококков к природному фактору гидробионтов - лизоциму.
Выявленные штаммы вида R. ruber, устойчивые к действию металлов и способные к их аккумуляции, позволили разработать методические приёмы охраны водоёмов от загрязнения цинком, кадмием и свинцом.
Разработан новый способ микробиологической очистки сточных вод промышленных предприятий от ионов цинка, свинца и кадмия, основанный на использовании штаммов вида R. ruber, аккумуляторов: ИЭГМ 219 - Zn и Cd; ИЭГМ 220 - Cd; ИЭГМ 221 - Zn; ИЭГМ 222 и ИЭГМ 338 РЬ и Cd; ИЭГМ 347 - Zn и РЬ (патент Российской Федерации на изобретение № 2216525 от 20 ноября 2003 г).
Способ позволяет снизить степень антропогенного загрязнения природных водоёмов тяжёлыми металлами.
Внедрение результатов исследования в практику. Способ микробиологической очистки сточных вод промышленных предприятий от ионов тяжёлых металлов: цинка, кадмия и свинца внедрён в работу лаборатории городских очистных сооружений г. Оренбурга (акт внедрения от 08.04.2004г.),
Центров Госсанэпиднадзора (акты внедрения от 05.02.2004г. и 20.04.2004г), научно-производственной фирмы «Экобиос» (акт внедрения от 28.05.2004г.) и комитета по природоохранной деятельности и мониторингу окружающей среды (акт внедрения от 20.03.2004г.),
Данные исследования применяются в системе вузовского образования студентов на кафедрах общей биологии Оренбургского государственного университета (акт внедрения от 15.12.2004г.), экологии Оренбургского государственного аграрного университета (акт внедрения от 29.04.2004г.) и биохимии с курсом физической и коллоидной химии Оренбургской государственной медицинской академии (акт внедрения от 11.03.2004г.) и включены в лекционный курс для студентов биологического и химического факультетов Оренбургского государственного педагогического университета (акт внедрения от 22.04.2004г.).
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на региональных научно-практических конференциях молодых учёных: Оренбург, 1997, 1999; на конференции молодых учёных и студентов „Охрана природы и здоровья человека", Оренбург, 1997; на III межрегиональной конференции памяти Д. Соловых „ Проблемы медицины, биологии, экологии и новые научные технологии в XXI век", Оренбург, 2000; V Международной научной конференции „Проблемы загрязнения окружающей среды", Пермь - Волгоград, 2001; VI Пущинской школе-конференции молодых ученых, Пущино, 2002; I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием „Биоэлементо-логия", Оренбург, 2004.
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 2 журнальные статьи и получен патент на изобретение.
Положения, выносимые на защиту.
1. Ответные реакции бактерий рода Rhodococcus на факторы водной
среды характеризуются изменениями динамики роста бактериальной
11 популяции, которая определяется нарушениями времени её генерации и последовательностью прохождения фаз развития.
2. В механизмах резистентности актинобактерий рода Rhodococcus к
биотическому фактору - лизоциму моллюска U. pictorum участвует ан-
тилизоцимная активность, уровень которой является маркером степени
чувствительности к лизоциму.
3. Предложен новый способ очистки водоёмов от антропогенного за
грязнения тяжёлыми металлами, основанный на использовании штам
мов вида R. ruber, являющихся активными аккумуляторами цинка,
кадмия и свинца.
Объём и структура диссертационной работы.
Диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, главу по материалам и методам исследования, три главы собственных исследований, заключение, выводы, приложение. Указатель литературы содержит 123 отечественных и 51 зарубежный источник литературы. Текст иллюстрирован 10 таблицами и 28 рисунками.
Связь работы с научными программами.
Диссертационное исследование выполнено в Оренбургской Государственной медицинской академии в соответствии с открытым планом научно-исследовательской работы в рамках научного направления „Экология человека и гигиена окружающей среды" (№ госрегистрации 01.9.60 013235 ).
Автор выражает искреннюю благодарность д.м.н., профессору, чл.-корр. РАН И.Б. Ившиной за предоставленную возможность работать со штаммами алканотрофных родококков из Региональной профилированной коллекции Института экологии и генетики микроорганизмов, за консультации при работе с культурами, а также к.м.н. В.П. Коробову за практическую помощь при получении препарата лизоцима моллюска Unio pictorum.
Лизоцим - как антимикробный фактор природных биоценозов
Впервые термин „лизоцим" появился в микробиологии и биохимии в 1922 г., когда Александр Флемминг установил, что действующее антимикробное начало яичного белка представляет собой фермент, который и получил название лизоцим. Это открытие положило начало исследованиям в данном направлении, и вскоре подобный фермент был обнаружен у различных организмов, далеко отстоящих друг от друга в эволюционном плане: у бактерий (Флемминг А., 1922; Meyer J. et al, 1936; Thomson R.s 1940), грибов (Крис Д., 1940), фагов (Koch G., Dreyer W., 1958), простейших (Chung J. С et al, 1969) и растений (Ермольева 3. В., 1938; Smith J., 1955) (цит. по Бухарину О. В., Васильеву Н. В., 1974).
В настоящее время накоплено достаточно много материалов об антимикробном действии ферментов беспозвоночных, позвоночных животных и человека, о литических ферментах микроорганизмов и растений (Бухарин О. В., Васильев Н. В., 1974; Подборнов В. М., Бердыев А., 1991; Купер Э.Д980). Первостепенное значение в ряду этих биологически активных веществ имеет лизоцим. Присутствие данного фермента связывают с проявлением естественной резистентности особенно к грамположительным бактериям (Бухарин О. В., Васильев Н. В., 1974).
В литературе так же имеются данные о продукции лизоцима моллюсками (Ломакин М. С, 1990), отмечено присутствие этого фермента в гемолимфе устриц (Tripp М. R., 1961). Обнаружена продукция лизоцима пресноводными двустворчатыми моллюсками U. pictorum (Карнаухова И. В., 2000).
Механизмы воздействия лизоцима на микробную клетку разнообразны и могут включать: 1) лизис; 2) бактериостаз; 3) бактерицидное действие; 4) морфологические и тинкториальные изменения; 5) влияние на клеточные компоненты и ферментные системы; 6) агглютинацию бактериальных клеток. Лизис обусловлен собственно ферментативной активностью лизоцима, проявляющейся реакцией гидролиза муреина и приводящей к разрушению клеточных стенок бактерий. В этом случае лизоцим действует как типичная p-N-ацетилмурамилгликаногидролаза.
Растворение микробной клетки является следствием расщепления Р 1- 4 гликозидных связей гетерополимера муреина - главного компонента бактериальной стенки (Страйер Л., 1984; Шлегель Г.Д989). Неодинаковая активность лизоцима в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов связана с различиями в химическом составе их клеточных стенок (Каграманова К. А., Ермольева 3. В., 1966; Шлегель Г., 1989; Бухарин О. В., 1999).
Эти отличия состоят в следующем: 1) в клеточных оболочках грамположительных бактерий аминокислотный набор беден, ароматические аминокислоты отсутствуют; 2) содержание липидов у них обычно ниже, чем у грамотрицательных бактерий (1-2.5% против 22% соответственно); 3) клеточные стенки грамположительных микробов содержат больше муреина и небольшое количество коротких пептидов и липидов; 4)у грамотрицательных бактерий пептидные участки длиннее и содержат диаминопимелиновую кислоту, лизин, гистидин, треонин, тирозин, фенилаланин, лейцин. По мнению К. А. Каграмановой и 3. В. Ермольевой (1966) более длинные пептидные участки субстрата лизоцима в клеточных стенках грамотрицательных бактерий могут служить причиной устойчивости большинства из них к мурамидазе, так как после расщепления гликозидных связей муреина, клеточные стенки бактерий полностью всё же не растворяются, за счёт оставшихся поперечных пептидных связей. Кроме того, липопротеины грамотрицательных бактерий обеспечивают их устойчивость к действию лизоцима. Гидролитический эффект лизоцима в отношении клеточных стенок бактерий - это частный случай его антимикробного действия.
Антимикробная активность лизоцима - понятие гораздо более ёмкое, чем ферментативная активность и включает в себя как бактерицидные, так и бактериостатические эффекты. Бактерицидный эффект лизоцима, не связанный с растворением клетки, был описан на сенной палочке, на патогенных стафилококках; бактериостатическое действие описано в отношении S. aureus (Бухарин О. В., Васильев Н. В., 1974). В основе этих явлений лежат нарушения проницаемости мембран и метаболизма, ведущие к дезорганизации структуры клетки, что отражается на её обменных процессах. Таким образом, бактерицидное и бактериостатическое действие лизоцима сопряжено с многообразными изменениями морфологических, тинкториальных и биохимических свойств микробной клетки и, зачастую, не связано с его энзимати-ческой активностью.
Неэнзиматическая антибактериальная активность лизоцима - установленный факт. К. During et ah (1999) описали бактерицидное и фунгистатиче-ское действие денатурированного и, таким образом, лишенного ферментативной активности фагового лизоцима (Т4) за счёт С-терминального участка молекулы. Подобные результаты были получены И. В. Карнауховой (2000) при работе с яичным лизоцимом. Исследователи объясняют антибактериальный эффект лизоцима его катионными свойствами.
С катионными свойствами молекулы мурамидазы связана и лизоцим-ная агглютинация. Известно, что сильные основные белки, например гисто-ны, заведомо лишенные ферментативной активности, вызывают потерю грамположительности у стафилококков (Бухарин О. В., Васильев Н. В., 1974). Антибактериальную активность проявляют низкомолекулярные кати-онные белки (Hultmark D., 1993). Аналогично ведет себя и лизоцим за счёт высокого положительного заряда и низкой молекулярной массы. Следует, однако, иметь в виду, что все перечисленные механизмы действия лизоцима чаще комбинируются друг с другом.
В то же самое время, исследованиями последних лет установлено, что лизоцим гидробионтов является одним из факторов, участвующих в формировании гидробиоценоза (Соловых Г. Н., 1995; Алёхина Г. П., 1996; Немцева Н. В., 1998). Показано, что лизоцим-антилизоцимные взаимоотношения служат универсальным механизмом, обеспечивающим существование сочленов альго-бактериальных и протозойно-бактериальных сообществ (Немцева Н. В., 1998). Таким образом, лизоцим участвует в межпопуляционных взаимодействиях в гидробиоценозе, обеспечивая гидробионтам конкурентоспособность в борьбе за определённую экологическую нишу.
Г. Н. Соловых (1995) отмечает, что в период массового отмирания гид-робионтов лизоцим из эндогенного состояния переходит в экзогенную форму, то есть на каком-то этапе состояния биоценоза в нём может присутствовать в определённой концентрации лизоцим и микрофлора водоёмов, в том числе и алканотрофные микроорганизмы, и на этом этапе будут подвергаться его воздействию. Так как бактериальные сообщества водных экосистем принимают активное участие в процессах самоочищения водоёмов от различных загрязнителей (Малышева А. Г., 1997; Kuyukina М. S. et al., 1996), то несомненно актуален вопрос об изучении чувствительности алканотрофных микроорганизмов, как одного из компонентов биоценоза, к лизоциму гидро-бионтов, а через призму решения этого вопроса его участие в формировании сообщества алканотрофных родококков, как потенциальных деструкторов различного рода поллютантов поступающих в водоём со стоками, в том числе и тяжелых металлов.
Биологические и физиологические особенности
Морфология. Родококки - аэробы, грамположительны, неподвижны, некислотоустойчивы или частично кислотоустойчивы, эндоспор не образуют. Характеризуются окислительным типом метаболизма и хорошо растут на стандартных лабораторных средах при 30С, хотя некоторые штаммы требуют тиамина. Клетки палочковидные толщиной 0.5-0.7 и длиной от 2-5 до 15-50 мкм, прямые или искривленные, нередко ветвящиеся, часто лежащие v-образно или палисадовидно (Нестеренко и др., 1980; Ившиной И.Б., Безматерных Г. И., 1987; Ившиной И.Б. и др., 1995; Goodfellow М., Minnikin D. Т. et al.y 1985).
Главная морфологическая особенность родококков - плеоморфизм и трех стадийный цикл развития, включающий образование первичного мицелия, который фрагментируется на палочки и кокковидные клетки. Стадии и скорость прохождения жизненного цикла, а также степень плеоморфизма клеток зависят от видовой и штаммовой принадлежности, состава питательной среды и условий культивирования (Ившина И. Б., 1982).
В недавнем исследовании М. Briglia et al. (1996) также выявлены различия в морфологии клеток представителей нового вида родококков R. регсо-latus при росте их на углеводных и углеводородных средах. Колонии родококков гладкие, слизистые;, шероховатые, как правило пигментированные (телесные, розовые, красные, желтые, оранжевые) и лишены воздушного мицелия. Размер, форма и окраска колоний зависят от условий выращивания. Так, представители R. ruber на мясопептонном агаре и сусло-агаре формируют колонии от ярко-красного до красно-оранжевого цвета, гладкие, шероховатые или складчатые, с ровным или волнистым краем, тестообразной консистенции, диаметром 0.5-1.0 мм. На минеральном агаре с н-бутаном R. ruber образуют ярко-красные колонии с резко очерченным краем и хорошо выраженным мицелиальным ободком (Ившина И.Б., Безматерных Г.И., 1987).
И.Б. Ившиной (1982) проведены сравнительные электронно-микроскопические исследования клеток газоокисляющих родококков, культивируемых на минеральной среде в присутствии пропана и на мясопептонном агаре. Наряду с общими чертами клеточной ультраструктуры, типичными для прокариот актиномицетнои линии эволюции, выявлены отличительные особенности родококков, выращенных на пропане. Так, в клетках наблюдается инвагинация наружной мембраны, образующейся в результате избыточного синтеза. Для родококков, выращенных в присутствии пропана, характерны крупные электронноплотные включения, окруженные электронно-прозрачной зоной и не ограниченные мембраной. Такие включения не встречаются в клетках, культивируемых на мясопептонном агаре, и, возможно, соответствуют местам локализации окислительных ферментов, которые необходимы для утилизации пропана (Глазачева Л. Е. и др., 1990). Выявленные включения напоминают внутриклеточные структуры, описанные В.И. Ари-старховой (1989) у Rhodococcus sp. (Nocardia corallina), окисляющей фенол. Они также очень близки цитоплазматическим структурам - оксисомам, выявленным у Arthrobacter sp. и Candida utilis, растущих на средах с н-бутаном и бутанолом- І. Выращенные на среде с пропаном родококки характеризуются развитой внутриклеточной мембранной системой, представленной у одних штаммов концентрическими или крупными трубчато-везикулярными структурами, у других - плотно уложенными везикулами, занимающими значительное пространство цитоплазмы вблизи клеточной стенки.
Химический состав клеток родококков исследован разными авторами (Нестеренко О. А. и др., 1980; Козырева Г. И., Ившина И. Б., 1992; Minnikin D. Е., 1982; Lechevalier М. P., Lechevalier Н., 1985). На основании структурной композиции клеточной стенки представители рода Rhodococcus отличаются от других нокардиоформных актиномицетов по следующим характеристикам: 1) основные составляющие пептидогликана - N-ацетилглюкозамин, N-гликолил; 2) мурамовая кислота, D- и L-аланин, D-глутаминовая кислота и мезодиамино пимелиновая кислота; преобладающие углеводы клеточной стенки - арабиноза и галактоза; преобладающие фосфолипиды - кардиоли-пин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозит и фосфатидилинозитманно-зиды; наличие туберкулостеариновой кислоты; миколовые кислоты; в углеводородной цепи менахинонов, как правило, восемь гидроизопреновых звеньев (Goodfellow М., Minnikin D. Е., 1985).
Среди структурных и функциональных компонентов клеток алканотрофных родококков особое место принадлежит клеточным липидам, составляющим от 6-8 до 25% сухой биомассы и представленным огромным разнообразием, которые помимо структурной и резервной функции играют важную роль на всех этапах потребления гидрофобного углеводородного субстрата. Изучение липидного состава родококков из арктических вод и почв, культивируемых в среде с н-гексадеканом, выявило своеобразный жирно-кислотный спектр, характеризующийся преобладанием ненасыщенных и нечетных жирных кислот, обусловленный, по-видимому, существованием этих бактерий в среде с постоянно низкой температурой (Коронелли Т. В., 1993).
В клетках родококков содержатся фосфолипиды, составляющие 10-50% от клеточных липидов и локализованные преимущественно в цито-плазматической мембране и клеточной стенке. Важная особенность поверхностно-активных фосфо- и гликолипидов родококков - способность образовывать в клетках гидратированные реверс-ные мицеллы сурфактанта в органическом растворителе. Заключенные в такие мицеллы клеточные ферменты не только демонстрируют повышенную активность, но даже могут менять свою субстратную специфичность в зависимости от локализации гидрофобных-гидрофильных участков, вступающих в контакт с субстратом (Lechewalier М. P., Lechewalier Н., 1985).
Кроме перечисленных типов липидных веществ в клетках алканотроф-ных родококков присутствуют белоксодержащие соединения, представленные пептидолипидами и пептидогликолипидами. Так, из выращенного на н-гексадекане М. parafimicum (R.erythropolis) выделены семь пептидолипидов, пять из которых содержат эфирносвязанные миколовые кислоты; три полярных пептидолипида содержат остаток глюкозы. Предполагают, что эти пеп-тидолипиды содержатся в клеточной стенке родококков и способствуют проникновению в клетку гидрофобного субстрата (Батраков С. Г., 1981).
Характеристика типов ответных реакций актино бактерий рода Rhodococcus sensu stricto на воздействия лизоцима моллюска U. pictorum
Однако, знание только химии липидов клеточной стенки совершенно недостаточно для понимания ее барьерных свойств, поскольку эти свойства во многом обусловлены физической организацией липидов. Еще 15 лет назад Д.Минникин (Minnikin D., 1982) предложил модель физической организации микобактериальной клеточной стенки, согласно которой цепочки миколовых кислот упакованы друг с другом боковыми сторонами в направлении, перпендикулярном клеточной поверхности. Этот, состоящий из миколовых кислот внутренний слой, покрыт наружным слоем, представленным экстрактабельными липидами, и вся структура образует асимметричный липидный бислой, целиком покрывающий поверхность клетки.
В последующие годы предложенная модель пополнилась выяснением физической структуры арабиногалактана (Jarlier V., Nikaido Н., 1994). В молекуле этого полисахарида основная галактановая цепь и боковые арабина-новые ветви расположены таким образом, что обеспечивают максимальную свободу движения углеводных остатков. Поскольку все сахара находятся в фурановой форме, остатки арабинозы и галактозы соединяются соответственно через 1-5 и 1-6 позиции. В свою очередь, остатки миколовых кислот ковалентно присоединяются к окончаниям боковых ветвей полисахарида.
Таким образом, параллельная укладка цепочек миколовых кислот в липидном бислое достигается за счет эластичных колебаний макромолекулы арабиногалактана. Из вышесказанного следует, что, благодаря присутствию и особому расположению миколовых кислот, липидный слой клеточной оболочки микобактерий имеет очень низкую текучесть и образует почти кристаллическую структуру, напоминающую таковую липополисахаридной клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Поскольку диффузия большинства липидных растворов (в том числе гидрофобных антибиотических веществ) через липидный бислой требует жидкой внутренней среды, данная кристаллическая структура создает эффективный барьер проникновению ли-пофильных антибиотиков в бактериальную клетку (Liu J. et ah, 1995). Сведения об участии жирно-кислотного компонента бактериальных клеточных мембран в развитии антибиотикорезистентности представлены в обзоре В.В.Смирнова с соавт. 1981). Авторы приводят многочисленные факты качественных и количественных модификаций жирно-кислотной структуры нейтральных липидов, гликолипидов и фосфолипидов под действием антибиотиков. Несмотря на то, что жирные кислоты редко сами служат мишенью действия антибиотических соединений, они часто вовлекаются в фено-типические изменения, наблюдающиеся при приобретении бактериями антибиотикорезистентности. Существует мнение, что именно перестройка жирно-кислотного компонента клеточных липидов является основой так называемой "фенотипической" устойчивости бактерий к антимикробным агентам, развивающейся при культивировании чувствительных в обычных условиях микроорганизмов на синтетических средах с определенными источниками углерода (Плакунов В.К., Лопатик М.Д., 1970).
Таким образом, из приведенных литературных данных видно, что явление возникновения антибиотикорезистентности у бактерий - сложный и многоплановый процесс, определяемый совокупностью генетических, биохимических и физиологических факторов, действующих как на организменном, так и на популяцию в целом. Не оставляет сомнений зависимость приобретения бактериальной клеткой устойчивости к антибиотическому веществу от состояния ее генома, особенностей первичного и вторичного клеточного метаболизма, физико-химического строения мембран.
Исследованиями О.В. Бухарина с соавт. (1997), О.В. Бухарина (1999), Г.Н. Соловых (1994), Н.В. Немцевой, Г.П. Алёхиной (1996), показано широкое распространение лизоцимной активности у гидробионтов, а также обосновано её участие во взаимоотношениях гидробионтов с бактериями в гидробиоценозах. И.В. Карнауховой (2000) выделен и изучен препарат лизоцима гидробионта (двустворчатого моллюска Unio pictorum). Г.Н. Соловых (1995) показано, что в период массового цветения водорослей и их отмирания, в биоту водоёма поступают эндогенные вещества и лизоцим в том числе, который переходит в экзогенное состояние.
В литературе также имеются и другие данные о продукции лизоцима моллюсками. М.С. Ломакин (1990), MR. Tripp (1961) отмечают присутствие этого фермента в гемолимфе устриц, а открытие ингибирующего эффекта действия лизоцима на микробные клетки, свидетельствует о возможном его участии в формировании микробных сообществ (Бухарин О.В., 1994). Было замечено, что по мере длительного воздействия лизоцима часто наблюдается повышение устойчивости первоначально чувствительных к его действию микроорганизмов. Устойчивыми в этом случае считаются штаммы микроорганизмов, изначально восприимчивые к данному антибиотику, если они не подавляются минимальной концентрацией антибиотического препарата, определённой для этого вида. Бактериальные виды, которые изначально не подавляются антибиотиком (например, из-за отсутствия структуры - мишени действия), называются невосприимчивыми или обладающими врожденной устойчивостью (Ланчини Д., Паренти Ф., 1985). Следовательно, в микросообществах наблюдается не только гетерогенность чувствительности микробных популяций к лизоциму, но и динамика чувствительности к нему, что отражается на составе микробного сообщества и как следствие на его функционировании в биоценозе.
В последнее десятилетие отмечается значительное повышение интереса исследователей к представителям рода Rhodococcus, Это обусловлено биологическими особенностями данных микроорганизмов - способностью использовать в качестве единственного источника углеродного питания газообразные и жидкие углеводороды и их широким распространением в разных природных субстратах: почве, подземных и поверхностных водах, воздухе, донных отложениях и глубинных породах (Зверева Л.В. и др., 1995; Goodfel-low М, Minnikin D.E., 1985).
Ответные реакции актинобактерий вида R. ruber на воздействие абиотических факторов водной среды (тяжёлых металлов)
Загрязнение окружающей среды антропогенными химическими соединениями представляет в настоящее время реальную и все более усиливающуюся угрозу благополучию населения планеты. Деятельность человека по масштабам своего влияния на распространённость химических элементов в окружающей среде возрастает настолько, что становится в ряд с природными геохимическими факторами (Онищенко Г.Г., 1999).
По загрязнению окружающей среды Оренбургская область среди регионов России является регионом с наибольшими выбросами вредных веществ (более 500 тыс. т) (Боев В. М., 1998; Быстрых В.В., 2000; Боев ВМ. и др., 2001; Боев В. М. и др., 2002).
Установление факта загрязнения бассейна реки Урал тяжёлыми металлами, содержание которых в воде превышает их предельно допустимые концентрации (свинец, цинк, медь и кадмий), обусловило следующий этап исследования: оценить степень устойчивости и характер ответных реакций ак-тинобактерий вида R. ruber на воздействие этих токсикантов.
Известно, что каждый из токсикантов обладает определённым механизмом действия и обуславливает специфический механизм реагирования (ответные реакции) водных организмов в ответ на эти воздействия (Строганов Н.С.„ 1975), поэтому гидробионты, их популяции и гидробиоценозы в целом, обнаруживают разную чувствительность и устойчивость к действию токсикантов.
Во многих случаях структурные и функциональные особенности организма рассчитаны на то, чтобы повышать его шансы на успех в соответствующем местообитании. Такие особенности организма называют„адаптацией". Адаптация к среде отмечена на всех уровнях биологической организации: изменении динамики роста, скорости размножения популяций этих организмов, а также на уровне биохимических реакций в клетках организма. Поскольку все клеточные реакции катализируются ферментами, регуляция жизнедеятельности организмов сводится к регуляции интенсивности ферментных функций. Интенсивность катализа может регулироваться только двумя основными способами: либо могут изменяться количества ферментов, либо может регулироваться их активность, то есть степень использования их каталитического потенциала (Хочачка П., Сомеро Дж., 1977). Характер взаимодействия организма с любым химическим соединением определяется различными факторами, среди которых ведущее место принадлежит особенностям метаболизма данной биосистемы, что проявляется в конкретных адаптационных биохимических реакциях (Челомин М.С., 1998).
При действии токсических веществ гибель организмов наступает, как правило, не мгновенно. Это означает, что организм обладает некоторой приспособленностью к внезапным резким изменениям условий внешней среды. С разной приспособленностью мы встречаемся в случае различий индивидуальной и видовой устойчивости, экологической толерантностью гидробио-нтов, в том числе и бактерий к токсическим воздействиям.
Естественно, что различия в приспособленности (или устойчивости) гидробионтов в природных условиях играют важную роль в сохранении биоценозов и экосистем в целом и способности экосистемы к самоочищению (Строганов Н.С., 1979).
Углублённые исследования и анализ биологического значения наблюдаемых изменений в экосистемах и её организмов способствовали установлению Н.С. Строгановым универсального закона действия токсического фактора на любой организм, в котором он фактически описал закономерности реагирования организма как целого на токсический фактор (Строганов, Н.С, 1940).
Известно, что каждый из токсикантов обладает определённым механизмом действия и обуславливает специфический механизм реагирования (ответные реакции) водных организмов в ответ на антропогенное загрязнение среды (Строганов Н.С., 1975), поэтому гидробионты, их популяции и гидробиоценозы обнаруживают, по-видимому разную чувствительность и устойчивость к действию тяжёлых металлов (цинка, кадмия, свинца и меди) и проявляют разные „механизмы" ответных реакций.
Знание возможных ответов в механизмах приспособленности (устойчивости) гидробионтов к антропогенным факторам среды, играет важную роль в сохранении гомеостаза биоценозов и экосистем в целом и должны учитываться для прогнозирования изменений в экосистемах и вопросах охраны водоёмов от антропогенного прессинга (Строганов Н.С., 1979).
Исходя из того, что тяжёлые металлы относятся к группе химических токсикантов оценка их воздействия на живые организмы и бактерии в том числе, должна проводиться через анализ их толерантности к этим воздействиям, о которой можно говорить на основе исследования характера ответных реакций в рамках „универсального закона действия токсического фактора" на любой организм. Поэтому на следующем этапе исследования была определена задача: оценить степень чувствительности и устойчивости алкано-трофных родококков к действию кадмия, цинка, меди, свинца, как токсикантов, концентрации, которых в воде р. Урал превышают предельно допустимые.
Для оценки чувствительности к данным металлам (антропогенному фактору водной среды) были взяты 12 штаммов вида R. ruber (ИЭГМ 71, ИЭГМ 83, ИЭГМ 90, ИЭГМ 92, ИЭГМ 219, ИЭГМ 220, ИЭГМ 221, ИЭГМ 222, ИЭГМ 325, ИЭГМ 338, ИЭГМ 347, ИЭГМ 376), у которых в условиях эксперимента оценивался характер ответных реакций на воздействие данных металлов, через призму универсального закона действия токсического фактора на развитие микропопуляций родококков (Строганов Н.С., 1940; 1979). Штаммы сокультивировались с тяжелыми металлами на минеральной Киевской среде (Малашенко Ю.П. и др., 1973) в течение 72 часов. Контроль за состоянием микробной популяции в присутствии определенного металла проводили в начале опыта (0 часов), а также через 18 часов, 24 часа, 48 часов и 72 часа по численности бактерий выращенных на МПА. По ингибированию или стимуляции роста микробной популяции на данном этапе её развития, судили о степени токсического воздействия металлов на данный штамм микроорганизмов, а следовательно опосредованно и о характере ответных реакций микробной популяции, что позволяло судить об устойчивости или неустойчивости штамма к изученным тяжелым металлам.
