Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Биотрансформация пентациклических тритерпеноидов 12
1.1. Биотрансформация пентациклических тритерпеноидов олеананового, урсанового и лупанового типа
1.2. Использование актинобактерий рода Rhodococcus для направленной биоконверсии терпеноидных соединений
Экспериментальная часть
Глава 2. Материалы и методы исследования 57
2.1. Рабочая коллекция бактериальных культур 57
2.2. Условия культивирования 57
2.3. Контрольные эксперименты 58
2.4. Иммобилизация бактериальных клеток в полимерном носителе
2.5. Подготовка суспензий нерастущих клеток 59
2.6. Получение клеточных фракций из родококков 61
2.7. Определение дыхательной активности 61
2.8. Определение жизнеспособности нерастущих клеток родококков
2.9. Количественный и качественный анализ продуктов биотрансформации бетулина
2.10. Препаративное получение бетулона 63
2.11. Химическая модификация бетулона, полученного в результате бактериального окисления бетулина
2.12. Атомно-силовая микроскопия 66
2.13. Математическое моделирование процесса биотрансформации бетулина
2.14. Статистическая обработка результатов 67
Глава 3. Исследование бетулинтрансформирующей активности коллекционных культур родококков, поиск активных биотрансформаторов бетулина
Глава 4. Подбор оптимальных условий процесса биотрансформации бетулина
Глава 5. Математическое моделирование процесса биотрансформации бетулина
Глава 6. Химико-ферментативный синтез фармакологически перспективных секопроизводных бетулина
Заключение 112
Выводы 115
Список литературы 116
- Использование актинобактерий рода Rhodococcus для направленной биоконверсии терпеноидных соединений
- Контрольные эксперименты
- Получение клеточных фракций из родококков
- Химическая модификация бетулона, полученного в результате бактериального окисления бетулина
Введение к работе
Актуальность проблемы. Полициклические тритерпеноиды растительного происхождения представляют интерес в качестве исходных соединений в синтезе новых фармакологически активных веществ. Бетулин (луп-20(29)-ен-3,28-диол, C30H50O2, CAS: 473-98-3) – пентациклический тритерпеноид лупанового ряда, содержание которого во внешнем слое коры березы достигает 20-35%, активно используется для получения противовоспалительных, гепапротекторных, противоопухолевых, противовирусных, антималярийных, антибактериальных соединений (Tolstikov et al., 2005; Alakurtti et al., 2006; Santos et al., 2009). Помимо химических модификаций предпринимаются попытки биологической трансформации бетулина с помощью микроорганизмов, так как биокатализ открывает возможность получать целевые продукты с высокой степенью регио- и стереоселективности в одну технологическую стадию при обычных температурах и давлении, в неагрессивной реакции среды и экологически безопасных условиях. Примеры биотрансформации бетулина пока немногочисленны (Parra et al., 2009; Muffler et al., 2011) и связаны преимущественно с использованием эукариотов, в частности представителей грибов Armillaria, Aspergillus, Chaetomium, Dothideomycetes, Rhodotorula. Описаны процессы окислительного расщепления бетулина до 4,28-дигидрокси-3,4-секолуп-20(29)-ен-3-овой кислоты при участии Chaetomium longirostre IFO 9873 (Akihisa et al., 2002) и окисления бетулина до бетулиновой кислоты с участием Armillaria luteo-virens Sacc QH, Aspergillus foetidus Zu-G1, Aspergillus oryzae Sacc QH (Chen et al., 2009; Liu et al., 2010). Недавно появились сведения о региоселективном окислении бетулина до бетулона с использованием Rhodotorula mucilaginosa F10 (Mao et al., 2012) и Dothideomycete sp. HQ 316564 (Liu et al., 2013).
В качестве одного из перспективных интермедиатов в синтезе биологически активных соединений особый интерес представляет 3-оксопроизводное бетулина – бетулон (Koohang et al., 2009; Mar et al., 2009; Mar et al., 2010; Orlov et al., 2011). Описаны процессы химического синтеза цитотоксичных циано- и азапроизводных бетулина на основе бетулона (Koohang et al., 2009; Mar et al., 2009; Mar et al., 2010). В отличие от трехстадийного химического синтеза бетулона использование микроорганизмов позволяет осуществлять одностадийное окисление вторичной гидроксильной группы бетулина в оксогруппу при сохранении нативной С(28)
гидроксильной группы. Однако описанные процессы биотрансформации бетулина до бетулона с использованием условно-патогенных дрожжей R. mucilaginosa F10 (Mao et al., 2012) и грибов Dothideomycete sp. HQ 316564 (Liu et al., 2013) имеют значительные недостатки, поскольку осуществляются в условиях использования сложных питательных сред, характеризуются высокой продолжительностью, невысоким уровнем биоконверсии субстрата при внесении низких концентраций исходного соединения. Кроме того, использование грибов в качестве биокатализаторов потенциально опасно вследствие характера их посевного материала (споры) и способности к синтезу микотоксинов, обладающих мутагенным и канцерогенным действием. В связи с этим актуальным является поиск непатогенных микроорганизмов, способных эффективно катализировать окислительные трансформации бетулина.
Одной из активно используемых групп микроорганизмов в промышленной биотехнологии являются непатогенные актинобактерии рода Rhodococcus. Не мицелиальный характер роста, политрофность и лабильность метаболических систем, синтез биосурфактантов, способность расти на минимальных средах, высокая каталитическая активность и отсутствие выраженных патогенных свойств (Ившина и др., 1987; Ivshina et al., 1998; Larkin et al., 2006; Martnkov et al., 2009; Kuyukina, Ivshina, 2010) обусловливают перспективность реализации уникальных метаболических систем родококков для окислительной биотрансформации бетулина.
Цель настоящей работы - исследование возможности использования актинобактерий рода Rhodococcus для селективной биотрансформации пентациклического тритерпеноида лупанового ряда бетулина.
Основные задачи исследования
-
Исследовать каталитическую активность коллекционных культур родококков разных видов в отношении бетулина. Отобрать штаммы - наиболее активные биотрансформаторы бетулина и определить условия его эффективной биоконверсии.
-
Сравнить бетулинтрансформирующую активность нерастущих и иммобилизованных актинобактериальных клеток. Изучить механизм взаимодействия актинобактериальных клеток с тритерпеновым субстратом и возможные пути его трансформации.
-
Разработать прогнозную модель процесса биотрансформации бетулина в высоких концентрациях с использованием методов математического моделирования.
-
Оценить возможность использования продуктов бактериального окисления бетулина для последующего синтеза биологически активных соединений химическими методами.
Научная новизна. Впервые показана способность актинобактерий рода
Rhodococcus к биотрансформации пентациклического тритерпеноида лупанового ряда
бетулина. В качестве основного метаболита биоконверсии бетулина
идентифицирован бетулон - продукт региоселективного окисления вторичной
гидроксильной группы бетулина. Установлено, что уровень
бетулинтрансформирующей активности родококков зависит от концентрации н-гексадекана в среде культивирования. Подобраны оптимальные условия биоконверсии бетулина с использованием суспензий нерастущих клеток. Биотрансформация бетулина протекает за счет адгезии бактериальных клеток к тритерпеновому субстрату. Экспериментально подтверждено, что нерастущие клетки характеризуются высоким уровнем каталитической активности в отношении бетулина в повышенных (до 3,0 г/л) концентрациях. Определены основные кинетические закономерности процесса биотранформации бетулина нерастущими клетками, предложена математическая модель, адекватно описывающая процесс биотрансформации. В результате сравнительного анализа трансформирующей активности родококков разных видов установлено, что наиболее высокая степень биоконверсии бетулина до бетулона достигается при использовании нерастущих клеток R. rhodochrous и R. erythropolis. На основе бетулона, полученного в результате бактериальной трансформации бетулина, путем последующей химической модификации синтезирован 3,4-секобетулин, перспективный в качестве противоопухолевого агента.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о биотрансформирующих свойствах родококков. Экспериментально обоснована способность родококков разных видов к региоселективному окислению пентациклического тритерпеноида растительного происхождения бетулина в бетулон. Сравнительный анализ каталитической активности растущих и нерастущих клеток выявил высокий биотехнологический
потенциал нерастущих клеток, применение которых позволяет существенно сократить (с 240 до 24 ч) продолжительность процесса биотрансформации и получить целевой продукт с высоким (60%) выходом. Использование простых (буферных) растворов в качестве трансформационной среды способствует упрощению выделения бетулона как исходного соединения для синтеза биологически активных соединений. На способ получения бетулона путем бактериальной трансформации бетулина нерастущими клетками R. rhodochrous ИЭГМ 66, депонированного во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ АС-1898, составлена Заявка № 2013137269 от 08.08.2013 на выдачу патента на изобретение РФ. Полученные данные могут быть использованы для разработки технологии эффективного получения бетулона с использованием родококков. Результаты диссертационных исследований используются в лекционных курсах “Биоразнообразие и систематика микроорганизмов” для магистрантов Пермского государственного национального исследовательского университета. Информация о наиболее активных штаммах-биотрансформаторах бетулина включена в компьютеризированную базу данных Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов для использования в сети Интернет ().
Основные положения, выносимые на защиту
-
Актинобактерии рода Rhodococcus в присутствии ростовых субстратов н-гексадекана, глюкозы, глицерина катализируют региоселективное окисление бетулина с образованием бетулона. При использовании растущей культуры родококков максимальный выход целевого продукта (72,2%) достигается в присутствии 3,0 об.% н-гексадекана через 240 ч.
-
Использование суспензий нерастущих клеток родококков позволяет сократить продолжительность процесса биотрансформации бетулина (0,5 г/л) до 24 ч. При этом нерастущие клетки наиболее активно трансформируют бетулин при слабощелочных условиях среды (рН 8,0-9,0) и оптимуме клеточной биомассы в количестве 10 г/л. Биотрансформация бетулина протекает за счет адгезии бактериальных клеток к тритерпеновому субстрату.
-
В условиях использования повышенных концентраций бетулина (от 1,0 до 3,0 г/л) нерастущие клетки в течение 24 ч катализируют образование бетулона с
выходом от 40 до 57% соответственно. Наиболее высокой бетулинтрансформирующей активностью характеризуются представители R. erythropolis и R. rhodochrous.
4. На основе бетулона, полученного в результате актинобактериальной трансформации бетулина, путем химической модификации синтезирован 3,4-секобетулин, перспективный в качестве противоопухолевого агента.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на IV Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов “Симбиоз Россия 2011”, Воронеж, 2011; VII Молодежной школе-конференции с международным участием “Актуальные аспекты современной микробиологии”, Москва, 2011; 4th Annual Russian-Korean Conference “Current Issues of Natural Products Chemistry and Biotechnology”, Новосибирск, 2012; XVII Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых “Биология – наука XXI века”, Пущино, 2013; Региональной конференции “Конкурс РФФИ – Пермский край. 10 лет: итоги и перспективы”, Пермь, 2013; 5th Congress of European Microbiologists (FEMS), Leipzig, 2013.
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе в изданиях, входящих в утвержденный ВАК перечень рецензируемых научных изданий (“Вестник Уральской медицинской академической науки”, “Российский журнал биомеханики”) и изданиях, входящих в международную систему научного цитирования Scopus (“Process Biochemistry”). Подана заявка № 2013137269 “Способ получения бетулона” от 08.08.2013 на выдачу патента на изобретение РФ.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 28 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав экспериментальных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 208 наименований работ, в том числе 18 отечественных и 190 зарубежных авторов.
Использование актинобактерий рода Rhodococcus для направленной биоконверсии терпеноидных соединений
Биотрансформация олеанановых тритерпеноидов. Анализ литературных данных свидетельствует о том, что наиболее исследованным субстратом среди тритерпеновых кислот является глицирретовая кислота (7). Глицирретовая кислота (7) и ее гликозид (глицирризин) (8) обнаружены в различных видах Glycyrrhza (Солодка). Данные соединения, как и их многочисленные производные, обладают выраженной фармакологической активностью, в том числе противоязвенной, противовоспалительной (Tolstikov et al., 1997; Tolstikov et al., 1998; Chung et al., 2001) и противоопухолевой (Ryu et al., 1994; Luo et al., 2004). Показано (Mahato et al., 1992), что глицирретовая кислота индуцирует выработку интерферона и обладает противовирусным действием в отношении вируса гепатита, ее активно используют при лечении больных с острым и хроническим гепатитом для предотвращения злокачественного перерождения гепацитов и возникновения гепатоцеллюлярной карциномы (Arase et al., 1997; van Rossum et al., 1998). Установлено, что глицерретовая кислота способствует снижению множественной лекарственной резистентности раковых клеток при совместном использовании с хемотерапевтическими агентами (Nabekura et al., 2008).
Описаны многочисленные примеры биоконверсии глицирретовой кислоты (7) с использованием культур грибов. Как правило, первым этапом биотрансформации соединения 7 является гидроксилирование, при этом гидроксильные группы могут вводиться в различные положения молекулы. Так, показана способность культур Curvularia lunata ATCC 13432 (Canonica et al., 1966), Curvularia lunata KA-91 (He et al., 2011), Mucor spinosus AS 3.3450 (Ma et al., 2008), Cunninghamella elegans TSY-0865 (Choudhary et al., 2009) к селективному 7-гидроксилированию кислоты 7 с образованием соединения 13. При использовании представителей аскомицетов Trichotecium roseum ATCC 8685 (Canonica et al., 1967) и Absidia pseudocylinderospora ATCC 24169 (Maatooq et al., 2010) достигается возможность гидроксилирования в положения С(7) и/или С(15) с образованием соответствующих моногидрокси- (13, 14) и дигидроксипроизводных (15). При этом показано, что 7,15-глицирретовая кислота (15) проявляет выраженные гепатопротекторные свойства (Maatooq et al., 2010). Среди основных продуктов биотрансформации с использованием бактерий Streptomyces sp. G-20 зарегистрированы 22-гидроксиглицирретовая кислота (16), а также минорные метаболиты – 22,23-дигидрокси- (17) и 22,24-дигидроксиглицирретовая (18) кислоты (Sakano, Ohshima, 1986a). Наряду с реакциями гидроксилирования многие микроорганизмы катализируют реакцию окисления 3-гидроксигруппы. Так, среди продуктов биотрансформации кислоты 7 грибами Mucor polymorphosporus AS 3.3443 наряду с основными (7-гидрокси-(13) и 15-гидрокси- (14)) и минорными (7-, 6- и 24-гидроксипроизводные (19-21)) метаболитами зарегистрированы 3-оксо-7-гидрокси- (1,1%) (22) и 3-оксо-15-гидроксиглицерретовая (0,9%) (23) кислоты (Xin et al., 2006). Позже показана способность Mucor polymorphosporus AS 3.3443 к гидроксилированию глицирретовой кислоты (7) в 6,7- (26) и 27-положения (27) (Xin et al., 2010). В процессе биотрансформации глицирретовой кислоты (7, 0,3 г/л) культурой грибов Cunninghamella blakesleeana AS 3.970 регистрируется образование двух основных кислот – 3-оксо-7-гидрокси- (22, 30%) и 7 -гидроксиглицерретовой (13, 25%), а также минорных метаболитов (3-оксо-7-гидрокси- (24), 7-гидрокси- (19) и предположительно 3-оксо-7,15-дигидроксипроизводное (25)). При этом начальный этап трансформации кислоты 7 при использовании штамма Cunninghamella blakesleeana AS 3.970 – гидроксилирование в положение С(7) (в течение первых 24 ч) и через 48 ч окисление 3-гидроксигруппы до карбонильной (Qin et al., 2010). Культура Cunninghamella echinulata ATCC 8688a трансформирует кислоту 7 с образованием уникальных 1-гидрокси- (28), 15 18 гидрокси-18Н- (29) и 13-гидрокси-7,27-окси-12,13-дигидроглицирретовой кислот (30) (последний метаболит является перспективным гепапротектором). Следует особо отметить, что Cunninghamella echinulata ATCC 8688a – первый из описанных микроорганизмов, изменяющий стереохимию глицирретовой кислоты. Предполагается, что стереоинверсия атома Н в положении С(18) происходит за счет образования и последующего восстановления двойной связи С(18)-С(19). Промежуточными продуктами в процессе образования кислоты 30, вероятнее всего, являются С(7) и С(27) гидроксипроизводные, однако в среде ферментации они не были обнаружены (Maatooq et al., 2010). Способность к селективному окислению гидроксильной группы кислоты 7 с образованием соответствующего 3-оксопроизводного (31) обнаружена у представителей аскомицетов Gliocladium viride ATCC 10097 (Maatooq et al., 2010) и Fusarium lini (Fusarium oxysporum) NRRL-68751 (Choudhary et al., 2009). Показано, что 3-оксоглицирретовая кислота (31) оказывает ингибирующее действие на липоксигеназу, что может быть использовано при лечении бронхиальной астмы, воспаления, рака и аутоиммунных заболеваний.
Высказано предположение (Para et al., 2009), что окисление 3-гидроксильной группы – начальный этап окислительного расщепления кольца А (аналогично химической реакции Байера-Виллигера) и образования тритерпеновых секопроизводных. Способность к трансформации кислоты 7 с образованием секопроизводных обнаружена у некоторых представителей микроорганизмов. Так, бактерии Chainia antibiotica (Streptomyces sclerotialus) IFO 12246 катализируют реакцию окислительного расщепления кольца А глицирретовой кислоты (7) с образованием 4-гидрокси-11-оксо-3,4-секо-18-олеан-12-ен-3,30-диовой (32) и 4,7-дигидрокси-11-оксо-3,4-секо-18-олеан-12-ен-3,30-диовой кислот (33).
Контрольные эксперименты
Показано, что нерастущие клетки Bacillus megaterium АТСС 14581, индуцированные фенобарбиталом, катализируют реакцию окисления 3-гидроксильной группы кислоты 2 а также реакцию гидроксилирования в положениях С(7) или С(6)/С(7) с образованием минорных (0,44; 0,085 и 0,45%) количеств соединений 3, 148 и 149 в течение 6 сут. В процессе биотрансформации кислоты 2 с использованием растущей культуры грибов Mucor mucedo UI-4506 также регистрируется 1,3% 7-гидроксипроизводное (148), в то время как грибы Cunninghamella elegans АТСС 9244 катализируют 1,7-дигидроксилирование с образованием 0,37% кислоты 150. Продолжительность процесса биотрансформации с участием растущих культур грибов в комплексной питательной среде составляла- 1152 сут. Исследования антимеланомной активности (в отношении двух клеточных линий меланомы человека) полученных метаболитов показали, что 1,7-, 7- и 6,7-гидроксипроизводные кислоты 2 обладают меньшей активностью по сравнению с исходным соединением.
Р. Chatterjee с соавт. (2000) использован бактериальный штамм Bacillus megaterium АТСС 13368 в качестве модельного организма для изучения и прогнозирования потенциальных метаболических путей кислоты 2 (0,2 г/л). Известно, что Bacillus megaterium АТСС 13368 синтезирует стероид-15-монооксигеназу цитохром Р450мег, которая может рассматриваться как микробная модельная система для изучения Р450-зависимых реакций гидроксилирования. Показано, что нерастущие клетки Bacillus megaterium АТСС 13368 в течение 6 сут катализируют образование кислоты 3 с выходом 4,2% и на ее основе производных, гидроксилированных в положения С(11) (152, 0,19%) и С(1) (153, 0,13%), а также продукта окисления исходной кислоты 2 в положения С(7),С(15) (154, 0,54%). При этом первым метаболитом, зарегистрированным в среде биотрансформации, является бетулоновая кислота (3). В дальнейшем происходит 11- или 1-гидроксилирование кислоты 3 с образованием кислот 152, 153. Авторы отмечают, что использование нерастущих клеток Bacillus megaterium АТСС 13368 в процессе биотрансформации бетулиновой кислоты (2) позволяет исключить образование дополнительных метаболитов, которые препятствуют экстракции и хроматографическому анализу целевых продуктов. При исследовании цитотоксичности полученных производных в отношении клеток меланомы линий Mel-1 (лимфоузла) и Mel-2 (плевральной жидкости) установлено, что введение заместителей напрямую влияет на анимеланомную активность полученных продуктов. Так, гидроксилирование бетулиновой кислоты (2) в положения, близкие к 3-гидроксигруппе, С(7) и С(15) в частности, приводит к утрате биологической активности полученных производных. Окисление 3-гидроксильной группы наряду с ведением гидроксильных групп в положения С(1), С(11) способствует значительному повышению антимеланомной активности в отношении Mel-2, но при этом наблюдается существенное снижение цитотоксичности в отношении Mel-1.
Способность к селективному окислению 3-гидроксильной группы бетулиновой кислоты (2) обнаружена у грибов Chaetophoma DPB125 и Dematium DPB157, при этом выход бетулоновой кислоты (3) составлял 0,94% и 0,62% соответственно. В процессе биотрансформации кислоты 2 с использованием Colletotrichum DPB136 регистрируется до 2,34% 3-оксо-15-гидрокси-луп-20(29) ен-28-овой кислоты (155) – продукта последовательного окисления 3 гидроксильной группы и 15-гидроксилирования. Образование гидроксипроизводных наблюдается в процессе биоконверсии кислоты 3 с использованием представителей аскомицетов Arthrobotrys DPB134, катализирующий введение гидроксильных групп в С(7), С(7)/С(15) или С(7)/С(30) с образованием кислот 156 (1,6%), 154 (0,6%) и 163 (1,3%). Сходной реакционной активностью в отношении бетулоновой кислоты обладает культура грибов
Colletotrichum DPB136, катализирующая образование 15-гидрокси- (155) и 7,15-дигидроксипроизводных (154). Обнаружена способность грибов Chaetophoma DPB125 вводить гидроксильную группу в положение С(25) бетулоновой кислоты (3) с образованием соединения 164 (4,22%) (Bastos et al., 2007).
Описан процесс биотрансформации бетулоновой кислоты (3) культурой грибов Chaetomium longirostre IFO 9873, при этом в качестве метаболитов зарегистрированы 7,15 -дигидроксипроизводное (154, 4%) и продукты окислительного расщепления кольца А - 4-гидрокси-3,4-секо-луп-20(29)-ен-3,28-диовая (157, 6%) и 4,7,17-тригидрокси-3,4-секо-28-норлуп-20(29)-ен-3-овая (158, 12%) кислоты, которые обладают выраженным цитотоксичным действием в отношении клеточной линии Raji (Akihisa et al., 2002).
По данным J. Zhang с соавт. (2005), применение культуры Nocardia sp. NRRL 5646 в процессе биоконверсии бетулиновой (2) и 23-гидроксибетулиновой (159) кислот позволяет получить соответствующие метиловые эфиры (160, 161). L-W. Qian с соавт. (2009) в процессе биотрансформации кислоты (3) Nocardia sp. NRRL 5646 наряду с метиловым эфиром (165, 49,8%) идентифицирован новый продукт - метил -2-ацетокси-3-оксо-луп-20(29)-ен-28-oат (166, 6,42%), который образуется в результате двух последовательных реакций – введения ассиметричной 2-гидроксильной группы и ее последующего ацетилирования.
Получение клеточных фракций из родококков
Биотрансформация бетулина с использованием полученных клеточных фракций. По данным отдельных авторов, в реакциях микробного окисления вторичной гидроксильной группы тритерпеновых спиртов и кислот (с использованием мицелиальных грибов, бацилл или нокардий) принимает участие холестеролоксидаза (Bastos et al., 2007) или 3-гидроксистероид дегидрогеназа (Leipold et al., 2010). Оба фермента локализуются преимущественно в цитоплазме или связаны с клеточной мембраной и катализируют реакцию окисления 3-гидроксильной группы стеролов (холестерола, -ситостерола) и стероидов с образованием соответствующих кетонов. Как видно из табл. 5, полученный нами супернатант с мембраносвязанными ферментами родококков катализирует реакцию окисления 3-гидроксигруппы холестерола и -ситостерола с образованием 4-ен-3-оновых производных, в то время как в отношении бетулина данный супернатант не активен. Незначительный (10,6%) уровень конверсии бетулина в бетулон наблюдается при использовании супернатанта с внутриклеточными ферментами родококков. Увеличение (до 22,4%) выхода бетулона регистрируется в процессе биотрансформации бетулина ресуспендированными соникатами родококков, содержащими компоненты клеточных стенок, и возможно, элементы бактериальных мембран с интегральными белками, имеющими гидрофобный якорь и связанными с мембранной за счет более прочных гидрофобных взаимодействий. Полученные данные свидетельствует о прочной связи катализирующего окисление бетулина фермента с клеточной мембраной родококков. Следует отметить, что для Rhodococcus sp. показано наличие каналов, состоящих из стероидсвязывающих или стероидтрансформирующих белков и соединяющих цитоплазму с клеточной поверхностью (Atrat et al., 1991; Wagner et al., 1992). Суммарная (33%) активность внутриклеточных ферментов и ферментов, прочно связанных с клеточной мембранной родококков, практически сопоставима с бетулинтрансформирующей активностью (40%) целых клеток.
Известно, что значительное влияние на активность ферментов оказывает уровень водородного показателя (рН среды), который определяет степень ионизации функциональных групп и конформацию каталитического центра фермента. При исследовании влияния рН буферного раствора на процесс биотрансформации бетулина (0,5 г/л) нами выявлено, что наиболее высокая степень образования бетулона достигается в условиях слабощелочной реакции среды. При рН 8,0 и 9,0 выход целевого продукта составляет 45%. Полученные результаты согласуются с данными X. Yang с соавт. (2007) о максимальной активности 3 -гидроксистероид дегидрогеназы актинобактерий рода Mycobacterium при рН 8,5-9,5, в то время как холестеролоксидаза актинобактерий рода Rhodococcus проявляет наибольшую активность при рН 7,0–7,5 (Yazdi et al., 2008; Lashkarian et al., 2010), что может свидетельствовать об участии дегидрогеназы в окислении бетулина.
Дальнейшие исследования по биотрансформации бетулина нерастущими клетками были направлены на поиск условий, обеспечивающих повышение количественного уровня образования бетулона.
По нашим данным, внесение в буферный раствор энергетических субстратов (1,0% глюкозы или 1,0% этилового спирта) не приводит к повышению эффективности процесса биотрансформации бетулина нерастущими клетками, при этом выход целевого продукта снижается и составляет 35%.
Влияние количества используемой клеточной биомассы. Для многих биотрансформационных процессов с использованием нерастущих клеток выявлена зависимость между количеством используемой клеточной биомассы и выходом целевого продукта (Wang et al., 2006; Chen et al., 2008; Cotter et al., 2009). Нами установлена характерная зависимость между количеством биомассы нерастущих клеток и выходом целевого продукта. Как видно из рис. 15, максимальный (65%) выход бетулона регистрируется при использовании 10 г/л (ОП600 2,6) клеточной биомассы. Дальнейшее повышение (до 25 г/л) количества используемой биомассы приводит к резкому снижению степени биоконверсии бетулина. Наблюдаемый эффект, по-видимому, обусловлен ограничениями процессов массопереноса при увеличении (более 10 г/л) клеточной биомассы.
Исследование процесса биотрансформации бетулина в условиях внесения высоких концентраций бетулина. Серия последующих экспериментов посвящена изучению возможности биотрансформации бетулина в условиях использования повышенных (в 2-6 раз) концентраций нерастущих клеток R. rhodochrous ИЭГМ 66. Результаты проведенных исследований свидетельствуют (рис. 16) о том, что для родококков характерна тенденция к агрегации клеток с частицами тритерпенового субстрата и образованию агрегатов размером 12-15 мкм (рис. 16б). При этом повышение концентрации вносимого бетулина приводит к увеличению размера агломератов до 25 мкм (рис. 16в).
Химическая модификация бетулона, полученного в результате бактериального окисления бетулина
Химический синтез 3,4-секобетулина на основе бетулона, полученного в результате бактериального окисления бетулина. В связи с неспособностью родококков катализировать образование секопроизводных бетулина реакцию окислительного расщепления кольца бетулона проводили с помощью химических агентов. Полученный при максимальной (3,0 г/л) нагрузке бетулина экстракт продуктов биотрансформации, содержащий бетулон (171), вводили в дальнейшие химические превращения без предварительной очистки бетулона (171). Химический синтез 3,4-секобетулина (192) включал реакции оксимирования и фрагментации по Бекману (рис. 4). Так, обработкой смеси продуктов биотрансформации солянокислым гидроксиламином в смеси этанола и пиридина с выходом 61% получен оксим бетулона (189). Для исключения возможной изомеризации с участием свободной С(28) гидроксильной группы оксима (189) под действием кислотных агентов в процессе расщепления кольца А использовали бензильную защиту (выход 28-бензоилоксипроизводного 190 составил 65%). Следует отметить, что полученный во второй стадии оксим (189) напрямую может быть использован в синтезе гетероциклических и функционализированных тритерпеновых производных. В реакции Бекмана с участием тионилхлорида использовали бензоилоксипроизводное (191), расщеплением кольца А которого с выходом 74% получено соответствующее 3,4-секопроизводное (191). Последующим щелочным гидролизом соединения (191) синтезирован целевой 3,4-секобетулин (192) (выход 81%).
Таким образом, нами предложен новый метод синтеза 3,4-секопроизводного бетулина, сочетающий в себе стадию предварительного бактериального окисления бетулина и последующей химической модификации полученного бетулона. При этом бетулон вводится в химический синтез без предварительной очистки смеси продуктов биотрансформации, что позволяет оптимизировать и сделать более технологичным синтез целевого продукта.
В качестве стартового соединения для получения фармакологически активных соединений широко используется доступный растительный тритерпеноид бетулин, окисленные производные которого проявляют противовоспалительную, гепапротекторную, противоопухолевую, противовирусную активность (Tolstikov et al., 2005; Alakurtti et al., 2006; Santos et al., 2009). В настоящее время предпринимаются попытки биологической трансформации бетулина с помощью микроорганизмов. Примеры по биотрансформации бетулина пока немногочисленны и связаны преимущественно с использованием эукариотных организмов, в частности представителей грибов, принадлежащих к родам Armillaria, Aspergillus, Chaetomium, Cunninghamella, Dothideomycete, Microsporum, Rhodotorula, Trichophyton. При этом большинство исследованных культур катализируют окисление первичной гидроксильной группы бетулина с образованием бетулиновой кислоты (Chen et al., 2009; Liu et al., 2010; Fu et al., 2011; Feng et al., 2013; Qazi et al., 2013). Лишь недавно появились сведения о региоселективном окислении бетулина до бетулона с использованием Rhodotorula mucilaginosa F10 (Mao et al., 2012) и Dothideomycete sp. HQ 316564 (Liu et al., 2013). Однако описанные процессы биотрансформации бетулина в бетулон растущими клетками грибов и дрожжей характеризуются значительными недостатками, как то: использованием бетулина в низких (0,1 и 0,057 г/л) концентрациях, высокой продолжительностью (до 144 ч) процесса биотрансформации, образованием побочных метаболитов.
Одной из активно разрабатываемых групп прокариотных микроорганизмов в промышленной биотехнологии являются непатогенные актинобактерии рода Rhodococcus, обладающие явными технологическими преимуществами и уникальным биокаталитическим потенциалом. Показана способность родокококков к направленному окислению органических соединений различной структуры, в том числе нитрилов, арилалкильных сульфидов, азотсодержащих гетероциклических соединений, растительных стеролов, стероидов, ациклических и полициклических терпеноидов (Warhurst, Fewson, 1994; Bunch, 1998; de
На основе биоресурсов Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов впервые показана способность актинобактерий рода Rhodococcus к биотрансформации растительного пентациклического тритерпеноида лупанового ряда бетулина. С целью повышения эффективности процесса биотрансформации бетулина были апробированы различные приемы: (1) периодическое аэробное культивирование бактерий, (2) введение в среду ферментации дополнительных энергетических субстратов (глюкозы, глицерина, н-гексадекана), (3) иммобилизация бактериальных клеток в матрицу криогеля на основе ПВС, (4) применение суспензий нерастущих клеток, описанных в литературе как: “resting cells, выживающих при перенесении в голодные буферные среды” (Kim et al. 2007; Marchand et al. 2008).
В результате оценки бетулинтрансформирующей активности 104 коллекционных культур родококков разных видов отобран штамм R. rhodochrous ИЭГМ 66, эффективно катализирующий образование бетулона. Максимальный (свыше 70%) уровень биоконверсии бетулина (0,5 г/л) регистрируется в присутствии 3,0 об.% н-гексадекана в течение 240 ч. Существенное сокращение (до 24 ч) длительности процесса биотрансформации бетулина достигается при использовании нерастущих клеток. Оптимальными условиями трансформации бетулина нерастущими клетками являются предварительное выращивание родококков в богатой питательной среде (МПБ), слабощелочная реакция среды (рН 8,0–9,0) и использование клеточной биомассы в количестве 10 г/л. При этом уровень конверсии бетулина составляет 60%.
Похожие диссертации на «Биотрансформация бетулина актинобактериями рода Rhodococcus»
