Введение к работе
Актуальность проблемы. Биотрансформация стеролов растительного и
животного происхождения до андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-
3,17-диона, в результате которой осуществляются реакции окисления
Зр-гидроксильной группы в оксогруппу, окислительного отщепления
алифатической боковой цепи стерола, изомеризации и дегидрогенизации -
основная стадия процесса промышленного получения многих лекарственных
гормональных препаратов Среди оксигенированных метаболитов стеролов
обнаружены вещества с выраженной противовоспалительной,
иммуносупрессивной, гестагенной, диуретической, анаболической,
контрацептивной, антифунгицидной активностью В отличие от химического синтеза, микробиологические методы конверсии органических соединений дают возможность получать целевые продукты с высоким выходом в одну технологическую стадию, при обычных температурах и давлении, в неагрессивной реакции среды и экологически безопасных условиях Ферментативный катализ позволяет осуществлять направленную трансформацию гидрофобных стериновых субстратов с высокой степенью регио- и стереосслективности, что является необходимым требованием для проявления биологической активности образующихся стероидных продуктов
Процесс окислительной биотрансформации стеролов растительного и животного происхождения в андростановые соединения наиболее эффективно катализируется с использованием прокариотных организмов (Донова, 2006, 2007, Mahato, Majumdar, 1993, Mahato, Garai, 1997, Femandes el al, 2003) Одним из наиболее доступных стериновых субстратов для микроорганизмов является Р-ситостерол - растительный стерол, получаемый из отходов деревообрабатывающей промышленности Известно, что в большинстве случаев первый этап биоконверсии Р-ситостерола катализируется бифункциональным ферментом холестеролоксидазой, ответственной за реакции окисления Зр-гидроксильной группы в оксогруппу и изомеризации двойной связи при С-5 в С-4 положение При этом образуется 3-оксосоединение - стигмаст-4-ен-З-он, который может в дальнейшем трансформироваться до андростановых производных
- андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17-диона На следующей схеме представлены возможные пути биотрансформации р-ситостерола
^s* Стигмаст-4-ен-З-он
Р-Ситостерол Андрост-4-ен-3,17-дион
Андроста-1,4-диен-3,17-дион
В настоящее время накапливается все больше сведений о способности к осуществлению селективной деградации боковой цепи стеролов представителями класса Aclinobacteria (Stackebrandt et al, 1997) Среди актинобактерий высокой активностью оксигеназ и способностью ассимилировать гидрофобные субстраты отличаются представители рода Rhodococcus Следует отметить, что типично бактериальный, а не мицелиапьный характер роста родококков, способность их усваивать многие труднодоступные для других микроорганизмов органические субстраты в широком диапазоне концентрации и расти на минимальных средах, специфика многоцелевых оксигеназных ферментных систем и активность в экстремальных условиях внешней среды - все это делает использование этой группы актинобактерий технологически перспективным Однако следует отметить, что сегодня известны пока лишь единичные работы по биоконверсии Р-ситостерола интактными клетками родококков (Iida et al, 1985, Murohisa, hda, 1993, Mahato, Garai, 1997, MacLachlan et al, 2000) В связи с этим актуальным является поиск новых бактериальных культур, катализирующих целевые реакции трансформации соединений с циклопергидропентанофенантреновым остовом С использованием генофонда Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, www iegm ru/iegmcol),
включающего большое собрание чистых идентифицированных непатогенных штаммов родококков, выделенных из разнообразных природных субстратов (Catalogue of strains, 2005), представлялось возможным провести сравнительное исследование проявления стеролтрансформирующей активности в пределах данного рода, подобрать оптимальные условия и, по возможности, выявить новые продукты биоконверсии р-ситостерола
Цель настоящего исследования - оценка возможности использования актинобактерий рода Rhodococcus для биокаталитического окисления Р-ситостерола и его ЗР-ацилпроизводных
Основные задачи исследования
Исследовать биокаталитическую активность коллекционных культур родококков разных видов в отношении Р-ситостерола Отобрать штаммы -наиболее активные биотрансформаторы Р-ситостерола
Разработать оптимальные условия процесса окислительной трансформации Р-ситостерола с использованием алканотрофных родококков
Провести сравнительное исследование холестеролоксидазной активности коллекционных культур родококков
Изучить влияние индукторов и ингибиторов на стеролтрансформирующую активность родококков
Научная новизна. Проведен анализ биокаталитической активности большого массива коллекционных культур актинобактерий рода Rhodococcus в отношении Р-ситостерола и его ЗР-ацилпроизводных Выявлена корреляция между видовой принадлежностью штаммов родококков и стеролтрансформирующей активностью Показано, что представители вида R ruber характеризуются наиболее выраженной холестеролоксидазной активностью в отношении Р-ситостерола Установлено, что родококки активно трансформируют р-ситостерол в стигмаст-4-ен-З-он в соокислительных условиях в процессе роста на к-гексадекане Выявлена зависимость холестеролоксидазной активности родококков от длины ацильного фрагмента в молекуле сложного эфира стерола Экспериментально обосновано, что связанная пальмитиновая кислота, являющаяся структурным аналогом алифатической боковой цепи Р-ситостерола, оказывает индуктивное воздействие на активность холестеролоксидазы родококков Обнаружено, что
родококки в условиях кометаболизма в присутствии ростового субстрата глюкозы и ингибитора 9<х-гидроксилазы 2,2'-дипиридила катализируют реакцию отщепления боковой алифатической цепи 3-ситостерола с образованием андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17-диона Впервые обнаружено, что клетки R ruber катализируют наряду с реакциями окисления 3-ситостерола реакцию ацилирования с образованием ацетата р-ситостерола Экспериментально подтверждена энзиматическая природа данной трансформационной реакции, которая реализуется в присутствии глюкозы в качестве ростового субстрата
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о биокаталическом потенциале актинобактерий рода Rhodococcus В результате проведенных исследований отобраны культуры Rhodococcus spp, трансформирующие 3-ситостерол с образованием целевых продуктов, востребуемых в фармацевтической практике Активные штаммы -биотрансформаторы и полученные экспериментальные сведения могут быть использованы при разработке биотехнологических способов получения целевых соединений - ключевых интермедиатов синтеза лекарственных средств Полученная информация о наиболее активных биотрансформаторах Р-ситостерола включена в компьютеризированную базу данных Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов для широкого использования в каналах сети Интернет (http //www iegm ru/iegmcol)
Основные положения, выносимые на защиту
Актинобактерий рода Rhodococcus проявляют выраженную холестеролоксидазную активность в отношении р-ситостерола в соокислительных условиях в присутствии с н-гексадекана с образованием до 98 % стигмаст-4-ен-З-она
Холсстеролоксидаза представителей R ruber обладает более высокой активностью в отношении р-ситостерола по сравнению с таковой к холестеролу Хопестеролоксидазная активность родококков индуцируется при использовании пальмитата р-ситостерола
3 Клетки R ruber катализируют наряду с реакциями окисления Р-ситостерола
реакцию ацилирования с образованием ацетата Р-ситостерола
4 Предварительно адаптированные к (3-ситостеролу клетки родококков в присутствии глюкозы и ингибиторов 9а-гидроксилазы катализируют образование андростановых производных - андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17-диона
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на III Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ», Саратов, 2004, II Всероссийской конференции «Фундаментальная наука в интересах развития химической и химико-фармацевтической промышленности» Пермь, 2004, I и II Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2005, 2006
По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 16 рисунков Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав экспериментальных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 231 литературный источник, в том числе 49 на русском и 182 на английском языках
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Изучение и сохранение функционального и видового разнообразия алканотрофных родококков in/ex situ, полезного для экоценозов и практической деятельности человека» (индекс приоритетного направления 5 28, номер госрегистрации 01 9 70 005279), а также в рамках ФЦТНП РФ «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения», подпрограмма «Биологическое разнообразие» Исследования поддержаны грантом РФФИ № 04-03-32063
Похожие диссертации на Биокаталитическое окисление Z-ситостерола и его 3Z-ацил производных актинобактериями рода Rhodococcus
