Введение к работе
Актуальность проблемы.
В настоящее время практически все природные среды подвергаются антропогенным воздействиям. Интенсивное развитие химической промышленности привело к тому, что в биосферу постоянно и в возрастающих количествах поступают вещества-загрязнители. Попадая в окружающую среду, они широко распространяются в природных ландшафтах, циркулируют в трофических цепях и накапливаются в организмах животных и человека. Это серьезно угрожает здоровью и даже жизни всех живых существ, включая человека, повреждая клетки и вызывая мутации, ведущие к развитию злокачественных процессов или наследственных заболеваний. Особую опасность для природных экосистем представляют сточные воды коксохимических, нефтеперерабатывающих, фармацевтических и других предприятий химической промышленности. Они содержат токсичные и канцерогенные органические вещества первого и второго классов опасности. Данная группа загрязнителей самая многочисленная, в нее входят до 80% контролируемых веществ, интервал допустимых концентраций которых составляет от 10"4 - 10"7 мг/л. В течение года в природные резервуары поступает до 100 тыс различных химических соединений, 60 млн т синтетических материалов и до 5 млн т пестицидов [Кузнецов, Градова, 2006]. Учитывая распространенность, токсичность и устойчивость ксенобиотиков различных классов, для изучения процессов их деградации были выбраны азотсодержащие ароматические арены, к которым относятся пиридин и его производные [Lettau, 1980; Rogers et al., 1985].
Санитарным законодательством предельно-допустимая концентрация (ПДК) для пиридина в питьевой воде установлена на уровне 0,2 мг/л, пиколинов и лутидинов -0,05мг/л, паров в воздухе - 0,0015 мг/м3 [ГН 2.1.5.2280-07, 2007], а для воды водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение, - 0,01 и 0,001 мг/л, соответственно [Перечень рыбохозяйственных нормативов, 1999]. Такие значения ПДК предполагают глубокую очистку сточных вод. На данный момент предложены различные физико-химические способы очистки: адсорбция [Akita, 1993; Sabah, 2002], озонирование [Stern, 1997], адсорбция с электросорбцией [Niu, 2002], но, ни один из современных методов химической очистки не является экономичным и достаточно эффективным. Биологический метод очистки обладает рядом несомненных достоинств, к числу которых относится его экологичность: в процессе биологической очистки не образуется чуждых природной среде соединений и происходит деструкция органических загрязнений до С02 и Н20 [Лохова, 2009].
Современный уровень развития промышленного производства и экологическое состояние окружающей среды обусловили повышение требований к качеству сточных вод, сбрасываемых в водные объекты, а традиционные технологии биологической очистки в аэротенках уже не позволяют достичь необходимой степени очистки. Одним из наиболее эффективных и очевидных способов увеличения окислительной мощности и улучшения ряда технологических показателей традиционных биологических очистных сооружений является применение иммобилизованной клеточной биомассы на нерастворимых в воде материалах [Демаков и др., 2009].
В связи с этим первостепенное значение приобретают разработка микробиологических способов очистки, предусматривающая поиск эффективных микроорганизмов-деструкторов, всестороннее их изучение, подбор оптимальных способов хранения, обеспечивающих сохранение как жизнеспособности, так и ферментативной активности, исследование путей превращений ксенобиотиков для использования этих микроорганизмов в процессах очистки промышленных сточных вод и биоремедиации почв.
Состояние вопроса.
К началу настоящей работы было известно, что первичной реакцией микробного метаболизма бензольного кольца является его гидроксилирование с образованием диоксисоединений [Арчаков, 1983; Leslie, 1985; Кулинский, 1999; Соляникова, 2007]. Последующее раскрытие кольца может проходить по одному из путей его окислительного расщепления: орто-, мета- и через образование гентизиновий кислоты.
Реакции раскрытия пиридинового кольца, в отличие от бензольного, не имеют однозначной интерпретации. С одной стороны, это обусловлено тем, что пиридин является электронодефицитным соединением, поскольку замена в кольце бензола одного атома углерода более электроотрицательным атомом азота приводит к резкому перераспределению электронной плотности в ядре так, что в положениях 2- и 4-электронная плотность понижена [Гранберг,1973, Пожарский,1986]. В результате, наряду с повышенной основностью пиридина (за счет свободной пары электронов азота), его электрофильность резко подавлена, а нуклеофильные реагенты атакуюта- и у - положения в ядре. Таким образом, нуклеофильная атака, например, введение ОН-группы, становится более легкой по сравнению с электрофильным замещением (Джилкрист, 1996). С другой стороны, до сих пор не удалось получить бактериальные бесклеточные экстракты, способные трансформировать молекулу пиридина: отсюда многие стадии его деградации остаются неизученными.
Немногочисленные данные о метаболизме пиридина и алкилпиридинов свидетельствуют о различающихся путях их разложения в зависимости от используемых микроорганизмов. Такие бактерии как Bacillus sp. шт. 4 [Watson, Cain, 1972]; Nocardia sp. [Watson, Cain, 1975]; Brevibacterium sp. [Shukla, 1973]; Corynebacterium sp. [Shukla, Kaul, 1974]; Micrococcus luteus [Sims et al., 1985, 1986] могут использовать пиридин в качестве единственного источника углерода и азота при его концентрации 1,5-2,0 г/л и времени утилизации от 2 до 5 суток. Первыми идентифицированными интермедиатами оказались насыщенные алифатические кислоты, янтарный и глутаровый полуальдегиды, присутствие которых свидетельствует о восстановлении пиридинового кольца [Shukla, 1973; Watson, Cain, 1975]. Вполне вероятно, что интермедиатом при деградации пиридина является 1,4-дигидропиридин [Watson, Cain, 1972], однако прямых доказательств этого процесса нет, первичные продукты восстановительной реакции не выделены. Более поздние исследования дали другие результаты. Бактерия Nocardia sp. КМ-2 [Коростелева, 1982] утилизировала пиридин в качестве единственного источника углерода и азота при максимально потребляемой концентрации 0,2% за 96 часов. В культуральной жидкости (КЖ) накапливался интермедиат, который был идентифицирован как 3-гидроксипиридин: это предполагает, что окисление кольца пиридина, предшествует его раскрытию. И в этом случае в качестве интермедиата был идентифицирован янтарный полуальдегид.
На данный момент в научной литературе представлены работы по изучению биодеградации небольшого ряда алкилпиридинов, касающихся метил- и этил- производных пиридина. [Bai, 2008; Stobdan, 2008; McCulloch, 2009.] В основном, описаны кинетические зависимости разрушения субстратов ограниченным числом различных видов микроорганизмов, и достаточно скудно представлены материалы по изучению путей метаболизма этих соединений. К настоящему времени нет обоснованных данных о путях деградации пиридина и его производных, а также диагностике штаммов, обладающих высокой деструктивной активностью по отношению к этим сильнейшим токсикантам. Так как до сих пор не удалось получить бесклеточные экстракты, трансформирующие пиридины, не были определены и охарактеризованы ферменты биодеградации пиридинового кольца.
Цель работы:
Исследовать микробную деградацию пиридиновых загрязнителей; включая выделение высокоактивных штаммов-деструкторов пиридина и его производных, изучение их физиологической активности, а также исследование путей разложения пиридинов для использования выявленных закономерностей и выделенных бактерий в биотехнологических процессах очистки промышленных сточных вод и биоремедиации почв.
Основные задачи исследований.
1. Поиск и выделение высокоактивных бактерий-деструкторов пиридиновых
соединений, идентификация выделенных штаммов бактерий.
2. Изучение кинетических параметров и подбор оптимальных условий для утилизации
пиридина и пиридиновых производных выделенными штаммами.
3. Оценка выживаемости и сохранения утилизирующей активности бактерий-
деструкторов по отношению к исследуемым субстратам при длительном хранении
штаммов.
-
Выделение, характеристика и определение структуры индивидуальных продуктов интермедиатов биодеградации пиридинов методами хроматографии и хроматомасс-спектрометрии. Установление путей микробной деградации пиридина и его производных.
-
Масс-спектрометрический анализ белкового профиля бактерий Arthrobacter sp. КМ-Р и Rhodococcus wratislaviensis КМ-Р, утилизирующие пиридин, методом матрично-активированной лазерной десорбции /ионизации (МАЛДИ).
8. Иммобилизация клеток бактерий Arthrobacter sp. КМ-Р, утилизирующих пиридин, в альгинате кальция для применения в биотехнологических процессах деструкции ксенобиотиков этого класса.
Научная новизна работы.
Выделены бактерии-деструкторы пиридинов из почв, отобранных с территорий химико-фармацевтического предприятия «Акрихин» и Авдеевского коксохимического завода, производящего чистые фракции легких пиридинов. Выделенные штаммы, обладающие высокой деградирующей активностью и широкой субстратной специфичностью, были идентифицированы на основании морфологических, культуральных, физиолого-биохимических свойств и результатам секвенирования 16S рРНК как представители родов Arthrobacter и Rhodococcus.
Установлено, что деградация пиридина и его производных выделенными микроорганизмами происходит по окислительному пути через гидроксилирование гетероциклического кольца в С-2 и (или) С-3 положении. Обнаружение в качестве промежуточных продуктов метаболизма пиридина, 2-гидрокси-, 2,3-дигидрокси- и 2,6-дигидроксипроизводных пиридина предполагает происхождение атома кислорода в гидроксильных группах у С-2 и С-б из воды. На основании анализа продуктов раскрытия дигидроксипроизводных установлено, что пиридиновое кольцо подвергается гидролитическому разрыву по C-N связи обоими штаммами бактерий: Arthrobacter sp. КМ-Р и Rhodococcus wratislaviensis КМ-Р. Впервые при изучении метаболизма 2-метилпиридина (2-МП) показано, что раскрытие кольца гидрокси-2-МП между 2-м и 3-м атомами углерода с последующей реакцией конденсации приводит к образованию N-ацетилпиррола. Раскрытие кольца между С-5 и С-6 атомами углерода, аналогично, приводит к образованию М-формил-2-метилпиррола. Таким образом, раскрытие кольца наблюдается и в орто- и в jwema-положении. Обнаружено, что метаболизм 4-МП сопровождается образованием розового и голубого пигментов, являющиеся продуктами конденсации 2,3-дигидрокси-4-МП и 2,3,6-григадрокси-4-МП,
соответственно, а метаболизм 2,4-ДМП - окислением как кольца гетероцикла, так и метальных групп. Раскрытие кольца у 4-МП, 2,4-ДМП и 2,6-ДМП наблюдается только в jwemo-положении.
Практическое значение работы.
Из почв, длительное время подвергавшихся воздействию пиридина и его производных, выделены штаммы бактерий родов Arthrobacter и Rhodococcus, способные разлагать устойчивые азотсодержащие поллютанты - пиридин, 2-метил-, 4-метил-, 2,4-диметил- и 2,6-диметилпиридины. Создана коллекция штаммов бактерий, адаптированных к высоким концентрациям токсикантов и характеризующихся высокой скоростью их разложения. Штамм Arthrobacter sp. КМ-4 за 24 часа утилизировал 2,5 г/л пиридина и 2-МП; 1,5 г/л 4-МП и 3,0 г/л 2,6-ДМП и депонирован в ВКМ (Ас-1098Д). Штамм Rhodococcus wratislaviensis КМ-Р утилизировал за 24 часа 2,5 г/л пиридина; R. erythropolis 2.4DMP - 2,0 г/л 2,4-ДМП за 36 часов.
Проведенные испытания по биодеградации пиридиновых оснований, содержащихся в сточных водах коксохимического производства, с помощью бактерий Arthrobacter sp. КМ-4 показали их высокую деструктивную активность: снижение концентрации пиридинов с 75-90 мг/л до 8-15 мг/л в течение 6 часов.
Штаммы Arthrobacter sp. КМ-4, R. wratislaviensis КМ-Р и R. erythropolis 2.4DMP рекомендованы для очистки промышленных сточных вод коксохимической и химико-фармацевтической отраслей промышленности.
Материалы диссертационной работы используются в лекционной работе профессорско-преподавательским составом ВУЗов КБР.
Апробация результатов и публикации.
Результаты работы представлены и обсуждались на 4-м Европейском конгрессе по биотехнологии (Амстердам, Голландия, 1987); на конференции «Охрана окружающей среды» (Братислава, Чехословакия, 1988); на 8-м Международном симпозиуме по биотехнологии (Париж, Франция, 1988); на 3-м симпозиуме актиномицетологов (Будапешт, Венгрия, 1988); на 5-м Международном конгрессе по коллекциям культур (Вашингтон, США, 1988); на 2-м Международном симпозиуме по микробиологии (Киото, Япония, 1989); на 3-м Съезде ВМСО и всероссийской конференции с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, 2007); на Международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007); на Международной научно-практической конференции «БИОТЕХНОЛОГИЯ» (Москва, 2008); на 56-ом съезде по масс-спектрометрии (Денвер, США, 2008); на 3-м Европейском конгрессе по микробиологии (Ґетеборг, Швеция, 2009); на 18-ой Международной конференции по масс-спектрометрии (Бремен, Германия, 2009), на 3-ей Международной конференции "Химия гетероциклических соединений" (Москва, 2010), на 4-ом научном симпозиуме "Автотрофные микроорганизмы" (Москва, 2010).
Положения, выносимые па защиту.
Представители немицелиальных актинобактерий из родов Arthrobacter и
Rhodococcus обладают высокой утилизирующей способностью в отношении широкого
спектра токсичных пиридиновых соединений.
Широкая субстратная толерантность, свойственная исходному выделенному из
природных образцов штамму, может быть восстановлена после его хранения в виде
спектра диссоциантов, высокоактивных в отношении отдельных субстратов.
Первой стадией разложения пиридина и его производных актинобактериями родов Arthrobacter и Rhodococcus могут быть не только восстановление, но и окисление гетероциклического кольца, аналогично начальному этапу окисления ароматического кольца при биодеградации замещенных фенолов.
Разрыв окисленного кольца пиридина может идти по нескольким путям: орто-, мета-или между C-N, аналогично многочисленным путям разрушения ароматического кольца у замещенных фенолов. Дальнейшие превращения окисленных пиридинов могут осуществляться по нескольким независимым путям.
Публикации. По результатам исследований опубликовано 34 работы, из них 12 экспериментальных статей в изданиях, рекомендуемых ВАК, 1 патент, тезисы 18 докладов.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 216 страницах, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения и выводов, списка цитируемой литературы, который включает 350 источников, содержит 12 таблиц и 40 рисунков.
