Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
ГЛАВА 1. ИММОБИЛИЗАЦИЯ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ 12
-
Микробная конверсия нитрилов карбоновых кислот 12
-
Преимущества иммобилизации 14
-
Классификация методов иммобилизации 15
-
Иммобилизация на поверхности материала носителя 16
-
Углеродные сорбенты как носители для иммобилизации микроорганизмов 23
-
Иммобилизация клеток в массе носителя 25
1.7. Иммобилизация клеток с использованием мембранной технологии 32
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 38
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 38
-
Бактериальные штаммы 38
-
Среды культивирования 39
-
Носители для адсорбционной иммобилизации 39
-
Условия культивирования бактерий и определение
ростовых характеристик 42
-
Определение активности нитрилгидратазы 42
-
Определение сорбционной емкости носителей по отношению
к субстрату и продукту нитрилгидратазной реакции 43
2.7. Определение операционной стабильности
иммобилизованных клеток и клеток в суспензии 44
-
Адсорбционная иммобилизация клеток бактерий 45
-
Иммобилизация бактериальных клеток включением в гель 45
-
Ковалентная иммобилизация бактериальных клеток 46
-
Микроскопия 47
2.12. Статистическая обработка 47
ГЛАВА 3. ИММОБИЛИЗАЦИЯ КЛЕТОК АКТИНОВАКТЕРИЙ
РОДА RHODOCOCCUS НА УГЛЕРОДНЫХ СОРБЕНТАХ 48
3.1. Морфология клеток родококков, выращенных на минимальной
и полноценной средах 48
3.2. Сорбционная емкость углеродных сорбентов по отношению
к клеткам бактерий 54
3.3. Сорбционная емкость углеродных сорбентов по отношению
к субстрату и продукту нитрилгидратазной реакции 56
-
Электронно-микроскопическое изучение адсорбции клеток родококков на углеродных носителях 59
-
Нитрилгидратазная активность адсорбированных клеток родококков 64
-
Рост штамма R. ruber gtl на углеродных сорбентах
и образование акриламида иммобилизованными клетками 66
-
Операционная стабильность биокатализатора, иммобилизованного на углеродных сорбентах 69
-
Влияние повышенной температуры на нитрилгидратазную активность клеток R. ruber gtl, иммобилизованных на БАУ 73
ГЛАВА 4. ИММОБИЛИЗАЦИЯ КЛЕТОК АКТИНОБАКТЕРИЙ
РОДА RHODOCOCCUS НА НОВЫХ УГЛЕРОДСОДЕРЖАЩИХ
НОСИТЕЛЯХ 78
4.1. Сорбционная емкость новых углеродсодержащих носителей
по отношению к клеткам родококков и акриламиду 78
-
Нитрилгидратазная активность и операционная стабильность клеток родококков, адсорбированных на новых углеродсодержащих носителях 79
-
Рост клеток штамма R. ruber gtl на новых углеродсодержащих носителях 83
-
Электронно-микроскопическое изучение клеток родококков, адсорбированных на новых углеродсодержащих носителях 85
ГЛАВА 5. ИММОБИЛИЗАЦИЯ КЛЕТОК АКТИНОБАКТЕРИИ РОДА
RHODOCOCCUS МЕТОДАМИ: ВКЛЮЧЕНИЯ В ГЕЛЬ,
МЕТАЛЛОХЕЛАТНЫМ И КОВАЛЕНТНОГО СВЯЗЫВАНИЯ
С НОСИТЕЛЕМ 88
-
Скорость нитрилгидратазной реакции и операционная стабильность клеток родококков, включенных в гели альгината бария и кальция 88
-
Сохранение нитрилгидратазной активности клеток родококков, иммобилизованных включением в гели к-каррагинана и агара 90
-
Иммобилизация клеток родококков включением
в ковалентно сшитый ПААГ 91
-
Связывание клеток родококков с силикагелем, активированным хлоридом хрома 111) 92
-
Хелатирование клеток родококков гидрооксидом титана (IV) 94
-
Иммобилизация клеток родококков на полиамиде, активированном глутаральдегидом 95
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 99
ВЫВОДЫ 107
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 109
Введение к работе
В естественной среде, особенно в почве, илах и на поверхности растений, микроорганизмы существуют в основном в иммобилизованном состоянии [28]. Способность прикрепляться к поверхности твердых веществ является естественным свойством бактериальных клеток, которое может быть использовано в технологиях, реализующих их биосинтетические и биокаталитические свойства. Известно, что адсорбция микроорганизмов на поверхности носителя ведет к изменениям некоторых физиологических процессов, протекающих в клетках, в частности, ферментативных реакций. Однако это влияние в настоящее время недостаточно исследовано [15].
Использование ферментов и клеток, обладающих определенной ферментативной активностью, в качестве биокатализаторов в органическом синтезе является быстро развивающимся направлением биотехнологии. По сравнению с традиционными химическими катализаторами, ферменты обладают значительным преимуществом, позволяя проводить синтез в мягких условиях, не требующих повышенной температуры, давления, агрессивных сред. Вследствие этого биокаталитические способы синтеза и конверсии органических соединений представляют собой малоотходные, высокоспецифичные, экологически безопасные, энергосберегающие процессы [33].
Эффективность биокаталитических процессов может быть увеличена путем иммобилизации используемых ферментов или клеток и перехода к гетерогенному катализу. В отличие от гомогенного, проходящего в коллоидных системах, гетерогенный катализ позволяет легко отделять биокатализатор от продуктов реакции, использовать проточные системы, а в ряде случаев стабилизировать активность фермента и использовать его повторно [18]. Применение ферментов в качестве биокатализаторов ограничено вследствие их низкой стабильности и высокой стоимости чистых препаратов [15, 18]. Иммобилизация клеток микроорганизмов дает ряд преимуществ, как перед свободными клетками, так и перед иммобилизованными ферментами. Живая клетка представляет собой готовый биохимический реактор, в котором реализуются не только процессы, приводящие к образованию конечного продукта, но и ряд других реакций, способствующих поддержанию каталитической активности системы на высоком уровне [18,35].
В последние десятилетия ведущим направлением исследований в области микробного биокатализа является трансформация нитрилов [44, 52, 87]. Это вызвано успешным опытом использования нитрилгидролизующих бактерий в крупнотоннажном производстве акриламида, а также связано с перспективой их применения для промышленного синтеза ряда других амидосоединений, востребованных во многих сферах народного хозяйства [40, 55, 98, 118]. Применение иммобилизованных клеток является наиболее перспективным путем совершенствования этих процессов [84, 87,98,118].
Состояние вопроса. В технологическом процессе иммобилизация была впервые использована более 150 лет назад. Однако бурное развитие методов иммобилизации началось с 70-х гг. XX века, что связано с потребностями фундаментальных исследований в области биохимии, молекулярной биологии, физиологии микроорганизмов и клеток эукариот, а также с разработкой современных биотехнологических производств. Исследования в данной области науки дали разнообразные способы сохранения активности биологических объектов, возможность изменять кинетические параметры, специфичность и стабильность ферментативных систем [16, 33].
Иммобилизация клеток и биополимеров позволяет решить широкий круг аналитических и препаративных задач. Области применения иммобилизации в фундаментальных исследованиях разнообразны - аффинная и циторецепторная хроматография, секвенирование ДНК и белков, синтез олигонуклеотидов, биосинтез ферментов и метаболитов, биосенсоры и др. Наиболее обширной сферой применения методов иммобилизации является
7 биотехнология, в некоторых областях которой их развитие стало лимитирующей стадией [18].
В последние десятилетия продолжается поиск подходящих носителей и методов для иммобилизации промышленно важных штаммов. Разрабатываются технологические процессы производства этанола иммобилизованными клетками [50, 79,91, 96,110]. Перспективно использование иммобилизованных клеток в молочной промышленности [133]. Иммобилизованные клетки находят применение для получения ферментов: Aspergillus niger - пектиназы [127]; A. oryzae - L-аминоацилазы [155], Bacillus sabtilis ~ щелочной протеазы [104, 146], Rhodococcus equi -холестерол-оксидазы [57]; дрожжи - пептидазы, инвертазы; В. megaterium -Р-амилазы; Е. coli - ct-амилазы; щелочной фосфатази, пенициллин ацилазы; Rhizopus chinensis, A. niger, Candida rugosa - липазы и т.д. [134]. Органические кислоты микробного происхождения, необходимые в медицине и пищевой промышленности, также могут быть получены с использованием иммобилизованных микроорганизмов. Имеются данные о применении иммобилизованных клеток A. niger и Yarrowia lipolitica с целью получения лимонной кислоты, Acetobacter sp. - уксусной кислоты, Lactobacillus helvetkus, L. delbrueckii, L. casei, Rhizopus oryzae, Pedioccus halophilus, Streptococcus salivarius - молочной кислоты [134]. При иммобилизации клеток может возрастать эффективность процессов биосинтеза антибиотиков. Проводятся работы по получению неомицина иммобилизованными клетками Streptomyces marinensis и S. fradiae [43], патулина - PenicUlium urticae [47], окситетрациклина - S. rimosus, также имеются данные по синтезу иммобилизованными клетками бацитрацина, никкомицина, кандицидина, цефалоспорина, эритромицина, циклоспорина [134]. В биокаталитических процессах, альтернативных химическим, преимущество использования иммобилизованных клеток отмечается во многих случаях. Так, возрастает выход гидроксилированных углеводородов с сохранением высокой энантиоселективности при использовании в качестве биокатализатора
8 иммобилизованных клеток В. megaterium [39]. Ферментативное восстановление органических нитросоединений с целью получения аминов, широко используемых в фармакологическом и химическом производстве, с более высоким выходом может производиться иммобилизованным биокатализатором на основе клеток Е. coli [12].
Успешным опытом применения биокатализа в области крупнотоннажного химического синтеза является производство амидов, в частности, акриламида, биомассой нитрилгидролизующих микроорганизмов [4, 5,44, 52, 87, 98, 118, 131]. Для улучшения характеристик биокатализатора, наряду с подбором высокоактивных штаммов, необходим поиск подходящего носителя для иммобилизации бактерий, используемых в промышленном производстве. Главным образом, в качестве метода иммобилизации использовали метод включения в массу носителя, а в качестве носителя - гель альгината кальция либо бария [66, 81, 84], к-каррагинан [65], гель поливинилового спирта [46] и полиакриламидный гель [87, 98, 151]. В то же время, недостаточно внимания уделяется адсорбционной иммобилизации, в частности, иммобилизации на активированных углеродных носителях, отличающихся инертностью, невысокой стоимостью, химической и биологической стойкостью. Несмотря на то, что первые работы по иммобилизации на углях были выполнены в 1898 году, длительное время эти носители не использовались [11].
О методах, подходящих для иммобилизации очищенных нитрилгидратаз, известно немного. Очищенный фермент из R. equi был иммобилизован на целлюлозе и Эупергите С, но стабильность этих препаратов при повторном использовании была низкой [118].
Цель настоящего исследования - изучение влияния иммобилизации клеток и свойств носителей на ферментативную активность и физиологические характеристики актинобактерий рода Rhodococcus, обладающих нитрилгидратазной активностью.
9 Основные задачи исследования:
Изучить воздействие различных способов иммобилизации на нитрилгидратазную активность штаммов R. ruber gtl и R. erythropolis 84.
Определить сорбционную емкость исследуемых носителей по отношению к микроорганизмам, субстрату и продукту ферментативной реакции.
Оценить возможность многократного использования иммобилизованных клеток в биокаталитическом процессе.
Сравнить возможность роста клеток штамма R. ruber gtl на активных углях различных видов и новых углеродсодержащих носителях.
Научная новизна. На основе сравнительного анализа выявлены преимущества адсорбционного метода иммобилизации клеток промышленно значимых штаммов, обладающих высокой нитрилгидратазной активностью, перед методами включения в гель и ковалентного присоединения. Установлено, что адсорбционная иммобилизация не приводит к потере нитрилгидратазной активности, в отличие от других изученных методов. Обнаружено, что адсорбция на активных углях стабилизирует нитрилгидратазную активность клеток при воздействии повышенной температуры и высоких концентраций токсичного субстрата, а также обеспечивает возможность многократного использования биокатализатора. Впервые показано влияние пористой структуры, дисперсионного состояния ряда углеродсодержащих адсорбентов, свойств поверхности композиционных материалов на адсорбцию клеток, субстрата и продукта маркерной ферментативной реакции.
Теоретическое и практическое значение работы. Выполненные исследования расширяют представления о воздействии различных способов иммобилизации на ферментативную активность микробных клеток. Выявлен наиболее эффективный метод иммобилизации промышленно значимых нитрилгидролизующих бактерий. Полученные результаты могут быть использованы при разработке технологического процесса синтеза акриламида
10 иммобилизованным биокатализатором в непрерывных условиях, а также при разработке технологии очистки стоков от акрилонитрила и оптимизации технологических режимов очистки растворов акриламида. Основные положения, выносимые на защиту.
Наиболее перспективными носителями для адсорбционной иммобилизации клеток родококков являются адсорбенты, обладающие следующими характеристиками: (1) развитая система макропор, (2) мелкодисперсность, (3) шероховатый поверхностный слой.
Адсорбционная иммобилизация стабилизирует нитрилгидратазную активность в условиях повышенной температуры и воздействия высоких концентраций токсичного субстрата, обеспечивая многократное использование биокатализатора.
Включение клеток в ионотропные, термотропные и ковалентносвязанные гели приводит к значительному снижению скорости нитрил гидратазной реакции.
Ковалентное связывание в ряде случаев обеспечивает более высокую клеточную нагрузку носителя, чем адсорбция, но приводит к снижению нитрил гидратазной активности.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены на 7-й и 8-й Международной Пущинскои школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2003, 2004; Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биотехнология микробов», Москва, 2004; Третьем Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2005; 2-й Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал», Пермь - Казань - Пермь, 2005, Международной научной конференции «Микробные биотехнологии», Одесса, 2006.
По теме диссертации опубликовано 30 научных работ, в т. ч. статья в журнале «Прикладная биохимия и микробиология», 2003, №1, с. 63-68.
Получен патент Российской Федерации № 2196822 «Штамм бактерий Rhodococcus erythropoHs - продуцент нитрилгидратазы», дата приоритета 25.07.2001.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Биохимические и генетические системы трансформации органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологий» (номер государственной регистрации 0120.0 406511). Исследования выполнены при поддержке гранта РФФИ № 04-04-97514, 2005-2006 гг., программы интеграционных исследований Уральского и Сибирского отделений РАН, 2004-2006 гг., молодежного гранта по УрО РАН №35,2004 г.
Список принятых сокращений: ГХ - газовая хроматография, ОП -оптическая плотность, НАК - нитрил акриловой кислоты, АА - акриламид, LB - среда Луриа-Бертани, КВУ - каталитический волокнистый углерод, ПААГ - полиакриламидный гель, ПВС - поливиниловый спирт, МИК -минимальная ингибирующая концентрация.
Благодарности. Автор выражает благодарность проф., д.т.н. В.Ф. Олонцеву за предоставленные образцы активных углей; к.х.н., с.н.с. Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН Г.А. Коваленко за предоставленные образцы углеродсодержащих носителей и помощь в проведении сканирующей электронной микроскопии образцов.
Похожие диссертации на Биотрансформация акрилонитрила иммобилизованными клетками актинобактерий рода Rhodococcus
