Введение к работе
Актуальность проблемы. Биотрансформация стеролов растительного и
животного происхождения до андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-
3,17-диона, в результате которой осуществляются реакции окисления
Зр-гидроксильной группы в оксогруппу, окислительного отщепления
алифатической боковой цепи стерола, изомеризации и дегидрогенизации -
основная стадия процесса промышленного получения многих лекарственных
гормональных препаратов. Среди оксигенированных метаболитов стеролов
обнаружены вещества с выраженной противовоспалительной,
иммуносупрессивной, гестагенной, диуретической, анаболической,
контрацептивной, антифунгицидной активностью. В отличие от химического синтеза, микробиологические методы конверсии органических соединений дают возможность получать целевые продукты с высоким выходом в одну технологическую стадию, при обычных температурах и давлении, в неагрессивной реакции среды и экологически безопасных условиях. Ферментативный катализ позволяет осуществлять направленную трансформацию гидрофобных стериновых субстратов с высокой степенью регио- и стереоселективности, что является необходимым требованием для проявления биологической активности образующихся стероидных продуктов.
Процесс окислительной биотрансформации стеролов растительного и животного происхождения в андростановые соединения наиболее эффективно катализируется с использованием прокариотных организмов (Донова, 2006, 2007; Mahato, Majumdar, 1993; Mahato, Garai, 1997; Fernandes et ah, 2003). Одним из наиболее доступных стериновых субстратов для микроорганизмов является Р-ситостерол - растительный стерол, получаемый из отходов деревообрабатывающей промышленности. Известно, что в большинстве случаев первый этап биоконверсии Р-ситостерола катализируется бифункциональным ферментом холестеролоксидазой, ответственной за реакции окисления Зр-гидроксильной группы в оксогруппу и изомеризации двойной связи при С-5 в С-4 положение. При этом образуется 3-оксосоединение - стигмаст-4-ен-З-он, который может в дальнейшем трансформироваться до андростановых производных
- андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17-диона. На следующей схеме представлены возможные пути биотрансформации Р-ситостерола:
но
Р-Ситостерол
Андрост-4-ен-ЗД7-дион о
Андроста-1,4-диен-ЗД7-дион
В настоящее время накапливается все больше сведений о способности к осуществлению селективной деградации боковой цепи стеролов представителями класса Actinobacteria (Stackebrandt et al, 1997). Среди актино бактерий высокой активностью оксигеназ и способностью ассимилировать гидрофобные субстраты отличаются представители рода Rhodococcus. Следует отметить, что типично бактериальный, а не мицелиальный характер роста родококков, способность их усваивать многие труднодоступные для других микроорганизмов органические субстраты в широком диапазоне концентрации и расти на минимальных средах, специфика многоцелевых оксигеназных ферментных систем и активность в экстремальных условиях внешней среды - все это делает использование этой группы актинобактерий технологически перспективным. Однако следует отметить, что сегодня известны пока лишь единичные работы по биоконверсии Р-ситостерола интактными клетками родококков (Iida et al, 1985; Murohisa, Iida, 1993; Mahato, Garai, 1997; MacLachlan et al, 2000). В связи с этим актуальным является поиск новых бактериальных культур, катализирующих целевые реакции трансформации соединений с циклопентанопергидрофенантреновым остовом. С использованием генофонда Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, ), включающего большое
5 собрание чистых идентифицированных непатогенных штаммов родококков, выделенных из разнообразных природных субстратов (Catalogue of strains, 2005), представлялось возможным провести сравнительное исследование проявления стеролтрансформирующей активности в пределах данного рода, подобрать оптимальные условия и, по возможности, выявить новые продукты биоконверсии (3-ситостерола.
Цель настоящего исследования - оценка возможности использования актино бактерий рода Rhodococcus для биокаталитического окисления (3-ситостерола и его Зр-ацилпроизводных.
Основные задачи исследования
Исследовать биокаталитическую активность коллекционных культур родококков разных видов в отношении (3-ситостерола. Отобрать штаммы -наиболее активные биотрансформаторы (3-ситостерола.
Разработать оптимальные условия процесса окислительной трансформации (3-ситостерола с использованием алканотрофных родококков.
Провести сравнительное исследование холестеролоксидазнои активности коллекционных культур родококков.
Изучить влияние индукторов и ингибиторов на стеролтрансформирующую активность родококков.
Научная новизна. Проведен анализ биокаталитической активности большого массива коллекционных культур актинобактерий рода Rhodococcus в отношении (3-ситостерола и его Зр-ацилпроизводных. Выявлена корреляция между видовой принадлежностью штаммов родококков и стеролтрансформирующей активностью. Показано, что представители вида i?. ruber характеризуются наиболее выраженной холестеролоксидазнои активностью в отношении Р-ситостерола. Установлено, что родококки активно трансформируют |3-ситостерол в стигмаст-4-ен-З-он в соокислительных условиях в процессе роста на н-гексадекане. Выявлена зависимость холестеролоксидазнои активности родококков от длины ацильного фрагмента в молекуле сложного эфира стерола. Экспериментально обосновано, что связанная пальмитиновая кислота, являющаяся структурным аналогом алифатической боковой цепи Р-ситостерола, оказывает индуктивное воздействие на активность холестеролоксидазы родококков. Обнаружено, что
родококки в условиях кометаболизма в присутствии ростового субстрата глюкозы и ингибитора 9а-гидроксилазы 2,2'-дипиридила катализируют реакцию отщепления боковой алифатической цепи (3-ситостерола с образованием андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17-диона. Впервые обнаружено, что клетки R. ruber катализируют наряду с реакциями окисления (3-ситостерола реакцию ацилирования с образованием ацетата (3-ситостерола. Экспериментально подтверждена энзиматическая природа данной трансформационной реакции, которая реализуется в присутствии глюкозы в качестве ростового субстрата.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о биокаталическом потенциале актинобактерий рода Rhodococcus. В результате проведенных исследований отобраны культуры Rhodococcus spp., трансформирующие (3-ситостерол с образованием целевых продуктов, востребуемых в фармацевтической практике. Активные штаммы биотрансформаторы и полученные экспериментальные сведения могут быть использованы при разработке биотехнологических способов получения целевых соединений - ключевых интермедиатов синтеза лекарственных средств. Полученная информация о наиболее активных биотрансформаторах (3-ситостерола включена в компьютеризированную базу данных Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов для широкого использования в каналах сети Интернет ().
Основные положения, выносимые на защиту
Актинобактерии рода Rhodococcus проявляют выраженную холестеролоксидазную активность в отношении Р-ситостерола в соокислительных условиях в присутствии с н-гексадекана с образованием до 98 % стигмаст-4-ен-З-она.
Холестеролоксидаза представителей R. ruber обладает более высокой активностью в отношении Р-ситостерола по сравнению с таковой к холестеролу. Холестеролоксидазная активность родококков индуцируется при использовании пальмитата Р-ситостерола.
3. Клетки R. ruber катализируют наряду с реакциями окисления Р-ситостерола
реакцию ацилирования с образованием ацетата Р-ситостерола.
7 4. Предварительно адаптированные к Р-ситостеролу клетки родококков в присутствии глюкозы и ингибиторов 9а-гидроксилазы катализируют образование андростановых производных - андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17-диона.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на III Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ», Саратов, 2004; II Всероссийской конференции «Фундаментальная наука в интересах развития химической и химико-фармацевтической промышленности» Пермь, 2004; I и II Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2005, 2006.
По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 16 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав экспериментальных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 231 литературный источник, в том числе 49 на русском и 182 на английском языках.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Изучение и сохранение функционального и видового разнообразия алканотрофных родококков in/ex situ, полезного для экоценозов и практической деятельности человека» (индекс приоритетного направления 5.28, номер госрегистрации 01.9.70 005279), а также в рамках ФЦТНП РФ «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения», подпрограмма «Биологическое разнообразие». Исследования поддержаны грантом РФФИ № 04-03-32063.
Похожие диссертации на Биокаталитическое окисление b-ситостерола и его 3b-ацил производных актинобактериями рода Rhodococcus
