Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Фармацевтические вещества - новый класс экополлютантов 12
1.1. Распространенность и частота встречаемости фармацевтических
азотсодержащих гетероциклических соединений в экосистемах 15
1.2. Дротаверина гидрохлорид - фармацевтический экополлютант 30
1.3. Актинобактерии рода Rhodococcus как потенциальные био деструкторы фармполлютантов 34
Экспериментальная часть 43
Глава 2. Материалы и методы исследования 43
2.1. Объекты исследования 43
2.1.1. Рабочая коллекция бактериальных культур 43
2.1.2. Химические реактивы 44
2.2. Микробиологические методы 45
2.2.1. Определение минимальной подавляющей концентрации 45
2.2.2. Условия культивирования актинобактерии 45
2.3. Микроскопические методы 46
2.3.1. Фазово-контрастная микроскопия 46
2.3.2. Атомно-силовая и конфокальная микроскопия 46
2.4. Физико-химические и морфофизиологические методы 47
2.4.1. Определение гидрофобных свойств 47
2.4.2. Определение поверхностного электрокинетического потенциала 47
2.4.3. Определение содержания липидов 48
2.4.4. Определение дыхательной активности 48
2.5. Получение цистоподобных покоящихся клеток 49
2.6. Получение иммобилизованных клеток 49
2.6.1. Иммобилизация клеток на адсорбенте на основе древесных пород 50
2.6.2. Иммобилизация клеток в криогеле на основе поливинилового спирта 51
2.7. Аналитические методы 52
2.7.1. Количественный анализ дротаверина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 52
2.7.2. Качественный анализ продуктов биодеструкции дротаверина методом газовой хроматографии 53
2.8. Определение токсичности продуктов био деструкции дротаверина 54
2.9. Математическое моделирование процесса био деструкции дротаверина 55
2.10. Статистическая обработка результатов 55
Результаты исследований и их обсуждение
Глава 3. Биодеструкция дротаверина: поиск активных штаммов-биодеструкторов, подбор оптимальных условий процесса биодеструкции 56
Глава 4. Определение дротаверина в культуральной жидкости родококков и кинетическое моделирование процесса его биодеструкции 65
Глава 5. Физико-химические и морфофизиологические особенности родококков в присутствии дротаверина 72
Глава 6. Биодеструкция дротаверина иммобилизованными и покоящимися клетками 79
Глава 7. Возможные пути биодеструкции дротаверина. Токсичность продуктов его биодеструкции 89
Заключение 97
Выводы 101
Список сокращений 103
Список литературы
- Дротаверина гидрохлорид - фармацевтический экополлютант
- Определение минимальной подавляющей концентрации
- Иммобилизация клеток в криогеле на основе поливинилового спирта
- Возможные пути биодеструкции дротаверина. Токсичность продуктов его биодеструкции
Дротаверина гидрохлорид - фармацевтический экополлютант
На настоящий момент накоплен значительный экспериментальный материал по биодеструкции водными и почвенными бактериями хинолиновых и изохинолиновых соединений, не являющихся лекарственными препаратами. Известно несколько путей аэробной деградации хинолиновых соединений и их производных. Наиболее часто в литературе упоминаются пути деградации хинолина через 5,6-дигидрокси-2(Н)-изохинолинон, 7,8-дигидрокси-2(Н) изохинолон, антранилат и через 8-гидроксикумарин (Fetzner, 1998). Так, в работе S-n. Zhu с соавт. (2008) показана возможность использования хинолина клетками Rhodococcus sp. QL2 в диапазоне концентраций от 60 до 360 мг/л в качестве единственного источника азота, углерода и энергии, а также в условиях кометаболизма. Более высокие концентрации хинолина ингибировали рост родококков. Продолжительность процесса био деструкции при этом составляла от 5 до 12 ч. Био деструкция хинолина протекала с образованием 2-гидроксихинолина, 2,6-дигидроксихинолина и 8-гидроксикумарина. Биодеградация хинолина, изохинолина и 2-метилхинолина возможна при использовании активного ила. Среди промежуточных продуктов биодеструкции 2-метилхинолина обнаружены 2-метил-4-хинолинол, 1,2,3,4-тетрагидро-2 метилхинолин, 2,6-диэтиланилина, 4-бутиланилина, МДчГ-диэтиланилин и 4-этил бензоламин. Большинство из них к концу эксперимента были преобразованы, однако такое соединение как 1,2,3,4-тетрагидро-2-метилхинолин сохранялось до конца эксперимента (Wang et ah, 2010). Хинолин и изохинолин были преобразованы путем гидроксилирования в 2(Ш)-хинолинон и 1(2Н) изохинолинон, соответственно. К концу эксперимента хинолин был полностью минерализован, в то время как убыль изохинолина из среды не превысила 92 %. 1(2Н)-изохинолинон не претерпевал дальнейших изменений (Li et al., 2010). Биодеградация изохинолина в аэробных условиях с использованием бактерий рода Acinetobacter протекала с образованием 1-гидроксиизохинолина, дальнейшие продукты распада не описаны (Aislabie et al., 1989). В работе P. Roger с соавт. (1995) показана возможность био деструкции изохинолина в качестве единственного источника углерода, азота и энергии штаммом Pseudomonas diminuta 7. Клетки метаболизировали изохинолин до 1-оксо-1,2-дигидро изохинолина, дальнейшая биодеструкция которого в анаэробных условиях даже в присутствии дополнительных источников углерода (ацетата или пропионата) протекала крайне медленно (более 90 сут) (Liu, Kuo, 1996).
Необходимо отметить, что вопросы биодеструкции фармполлютантов изохинолинового ряда изучены незначительно. Наиболее исследованным в этом отношении фармацевтическим соединением является кодеин. Установлена возможность биодеструкции кодеина клетками Pseudomonas putida (Niknam et al., 2010). Однако его биоразложение протекало с образованием еще более токсичных для окружающей среды продуктов ацетилкодеина, оксикодона, норкодеина и морфина. Аналогичная ситуация описана в статьях D.A. Kunz с соавт. (1985) и К.М. Madyastha с соавт. (1998), в которых био деструкцию кодеина проводили с использованием бактерий родов Bacillus и Streptomyces. Среди продуктов биодеструкции идентифицированы 14-гидроксикодеинон и 14-гидроксикодеин.
Ряд научных публикаций посвящен биодеструкции папаверина гидрохлорида (Haase-Aschoff, Lingens, 1979; Hauer et al, 1982; Zhao et al, 2011). Биодеструкцию папаверина в качестве единственного источника углерода и энергии проводили с использованием бактерий рода Nocardia, грибов родов Aspergillus и Cuningamella. В данных работах отсутствуют сведения, подтверждающие факт раскрытия изохинолинового цикла папаверина. Использование грибов рода Phanerochaete позволило в течение 4 сут полностью деструктировать папаверина гидрохлорид в присутствии в среде дополнительного источника азота. Продукты биодеструкции папаверина с использованием клеток Phanerochaete chrysosporium АТСС 34541 не описаны (Zhao et al., 2011). Следует особо отметить, что биологическую деструкцию дротаверина гидрохлорида ранее не исследовали.
Как видно из представленных литературных данных, фармпрепараты изохинолинового ряда являются устойчивыми микрозагрязнителями окружающей среды. В большинстве описанных случаев в результате их биологической деструкции раскрытия изохинолинового кольца не происходит. Это требует проведения дальнейших экспериментов, направленных на разрушение изохинолиновой структуры фармполлютантов с целью детоксикации соединений данной химической группы. Особого внимания требует изучение тех фармацевтических препаратов, которые являются наиболее востребованными на фармацевтическом рынке и неизбежно попадают в окружающую среду.
Дротаверина гидрохлорид - фармацевтический экополлютант Одними из повсеместно используемых фармацевтических соединений изохинолинового ряда в современной медицинской практике в России и странах Восточной Европы представлены лекарственные препараты, действующим веществом которых является дротаверина гидрохлорид (C24H31NO4; CAS (Chemical Abstract Services): 985-12-6; (1-[(3,4-диэтоксифенил)метилен]-6,7-диэтокси-1,2,3,-тетра-гидроизохинолин в форме гидрохлорида). Дротаверина гидрохлорид - синтетический аналог папаверина гидрохлорида, обладающий более сильным и продолжительным анальгезирующим действием. Согласно анатомо-терапевтической классификации дротаверина гидрохлорид относится к группе синтетических спазмолитиков и холиноблокаторов (А 03). Остается стабильным при воздействии света, высокой температуры и влажности, умеренно растворим в воде. Соединение разработано в 1961 г. (Vargay et al., 1980). В торговый оборот препарат запущен в 1963 г. с торговым наименованием Но-шпа. Сегодня Но-шпа зарегистрирована в 56 странах Европы и Азии. По данным корпорации "Sanofi" (2013), основными рынками препарата являются Россия и Польша. Дротаверина гидрохлорид является действующим веществом фармацевтических препаратов с торговыми наименованиями: Беспа, Биошпа, Веро-Дротаверин, Дротаверина гидрохлорид, Дротаверин МС, Дротаверин-АКОС, Дротаверин-КМП, Дротаверин-НС, Дротаверин-УБФ, Дротаверин-ФПО, Дротаверин-форте, Спазмол, Спаковин. На фармацевтическом рынке представлены не только однокомпонентные, но и комплексные препараты дротаверина: Никошпан (никотиновая кислота, дротаверина гидрохлорид), Кварелин (анальгин, кофеин, дротаверина гидрохлорид), Но-шпалгин (парацетамол, кодеин, дротаверина гидрохлорид).
Определение минимальной подавляющей концентрации
Максимальное количество потребления Но-шпы в России приходится на Северо-Западный (28 %) и Южный Федеральные округа (21 %). По данным корпорации "Sanofi" (2013), в остальных регионах потребление Но-шпы не превышает 16-18 %. В последние годы широкомасштабное и повсеместное потребление Но-шпы привело к наиболее частой фальсифицируемости препарата. Партии поддельной Но-шпы изъяты в России (2003 г.) (http://www.ivanovonews.ru/ news/detail. php?id=42027), Израиле (2007 г.) (http://www.remedium.ru/ pda/news/world/detail.php?ID=29503), Украине (2012 г.) (http://www. novostimira. com.ua/ news_34538.html). Непригодные к использованию лекарственные средства требуют обязательной утилизации.
В организме человека полного разложения молекулы дротаверина гидрохлорида не происходит (Данилюк, 2013). Как видно из рисунка 10, в организме человека дротаверин претерпевает гепатобиотрансформацию через (9-дезэтилирование с последующей конъюгацией полученных метаболитов с глюкуроновой кислотой (Vargay et al., 1980). В результате (9-дезэтилирования происходит отщепление этильнои группы с окислением метиленового звена бензильной группы. При этом образуются три основных метаболита: 4 -дезэтилдротаверин, 6-дезэтилдротаверин, 4 -дезэтилдротавералдин (рисунок 10, А-В). В процессе последующей конъюгации метаболитов с глюкуроновой кислотой образуются соединения, среди которых идентифицированы глюкоронид 6-дезэтилдротаверина; глюкоронид 4 -дезэтилдротаверина; глюкоронид 4 -дезэтилдротавералдина (рисунок 10, Г-Е).
Согласно нормативным документам (Закон РФ № 52 от 12.03.1999 "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" и "Методическим указаниям 4.1.1697-03"), дротаверина гидрохлорид имеет второй класс опасности (ПДК 0,2 мг/куб.м, ОБУВ 0,005 мг/куб.м). Установлено эмбриотоксическое и нейротоксическое действие дротаверина в отношении млекопитающих (Демушкин и др., 2011; Endreffy, Boda, 1983). По данным S. Nair с соавт. (2002), дротаверина гидрохлорид в концентрации 38,37 мг/кг, введенный внутримышечно, вызывал летальный исход у белых крыс. При изучении острой токсичности дротаверина в отношении белых мышей концентрации составляли 19; 95; 1000 мг/кг при внутривенном, подкожном и пероральном введении, соответственно.
Следует отметить, что если вопросы терапевтического воздействия дротаверина на организм человека и позвоночных животных изучены достаточно полно, то в отношении прокариотных организмов экологически значимых групп они практически не исследованы. Знания о бактериальных метаболитах дротаверина гидрохлорида необходимы для оценки "поведения" ("экологической судьбы") данного соединения и его структурных аналогов в окружающей среде. Среди экологически значимых групп микроорганизмов, способных чутко реагировать на изменения в среде обитания и инициировать соответствующие адаптивные реакции, особое место занимают актинобактерии рода Rhodococcus.
Актинобактерии рода Rhodococcus - эколого-трофическая группа микроорганизмов, способных окислять природные и антропогенные органические соединения (Коронелли, Юферова, 1990; Ившина, 1997; Oldfield et al, 1998; Chauvaux et al, 2001; Soudi, Kolahchi, 2011; Vesela et al, 2012). Согласно современной классификации, родококки относятся к семейству Nocardiaceae, порядку Actinomycetales, классу Actinobacteria. На настоящий момент род Rhodococcus включает 37 видов, официально признанных и имеющих валидное наименование. Каждый год список пополняется новыми видами, в тоже время совершенствование генетических методов позволяет исключить некоторых представителей, ранее отнесенных к данному роду (Yassin, Schaal, 2005; Gurtler, Seviour, 2010).
Родококки имеют широкое (практически повсеместное) распространение в природе. Они обнаружены в различных климатических зонах - от южных до северных широт (Ившина, 2012). Источниками выделения родококков являются разнообразные водные бассейны, в том числе морские акватории, сточные воды муниципальных очистных сооружений и заводов, почвы различного состава и даже организмы животных (Бабошин и др., 2005; Colquhoun et al, 1998; Whyte et al, 1999; Yassin, 2005; Manage et al, 2009; Gurtler, Seviour, 2010; Tancsics et al, 2014). Среди основных источников выделения отмечены биотопы, загрязненные нефтью и газом или связанные с их месторождением (Коронелли, Нестерова, 1990; Ившина, 2012). Широкое распространение актинобактерий рода Rhodococcus в окружающей среде, в том числе экстремальных местообитаниях, обусловлено их высокой степенью толерантности к экстремальным абиотическим факторам. Актинобактерий рода Rhodococcus - грамположительные, аэробные, неподвижные, не образующие спор бактерии с трехстадийным морфогенетическим циклом развития. Клетки в молодой (6-15 ч) культуре палочковидные, нитевидные или ветвящиеся. Через 16 ч мицелий распадается на палочковидные фрагменты. В возрасте 48-110 ч в культуре преобладают кокковидные клетки (Ившина и др., 2007; Егорова и др., 2010). Одной из важных особенностей бактерий данной группы является способность к синтезу розового и оранжевого пигментов (Ившина и др., 1987; Mayilraj et al., 2006). Известно, что пигментированным актинобактериям свойственна повышенная жизнеспособность при воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды (Костина, 2010). Родококки являются К-стратегами (Коронелли, Нестерова, 1990), по способу питания - олиго-, нитро-, алкано- политрофами (Ившина, 2012). Они способны использовать в качестве источника энергии рассеянные источники питания и низкие концентрации органического субстрата (Ившина, 1997), могут длительное время находиться в почве в условиях голодания (Bell et al., 1998; de Carvalho et al., 2014). Одна из важных биологических особенностей родококков заключается в том, что они способны использовать не только жидкие углеводороды, но и высшие газообразные гомологи метана. Наличие одного только данного свойства уже делает родококков наименее зависимыми от внешней среды и позволяет существовать в условиях, неблагоприятных для других микроорганизмов (Ившина, 1997).
Иммобилизация клеток в криогеле на основе поливинилового спирта
Биодеструкция ДГ покоящимися клетками. Актуальность разработки приемов повышения деструктивной активности родококков обусловлена тем, что в природных системах практически отсутствуют оптимальные ростовые условия (температура, рН, N и пр.). Хотя родококки способны осуществлять катаболические процессы в неоптимальных условиях внешней среды (de Carvalho and da Fonseca 2005; Larkin et al. 2006), скорости деструкции разлагаемых ими соединений при этом весьма низки.
Одним из приемов повышения деструктирующей активности родококков состоит в получении их дормантных форм. В качестве био деструктора использовали штамм R. ruber ИЭГМ 326. Выбор данного штамма обусловлен, с одной стороны, его устойчивостью к ДГ (МІЖ 200 мг/л), с другой - низкой способностью к разложению этого фармполлютанта, по сравнению с другими штаммами-биодеструкторами ДГ. Покоящиеся клетки R. ruber ИЭГМ 326 получали в модели голодания культур по источнику азота (что, по сути, имитировало распространенную экологическую ситуацию) и длительном хранении при температуре окружающей среды. ЦГЖ R. ruber ИЭГМ 326 в данных условиях сохраняли морфологические особенности и целостность клеток. В свою очередь, создание условий азотной лимитации и последующее хранение при комнатной температуре не оказались оптимальными для массового образования ЦПК R. rhodochrous ИЭГМ 647. Клетки утрачивали колониеобразующую способность. Возможно, что в примененных условиях R. rhodochrous ИЭГМ 647 переходили в некультивируемое состояние, аналогично описанному ранее для другого штамма этого вида NCIMB 13805 (Shleeeva et al., 2002). Таким образом, штамм R. ruber ИЭГМ 326 был подходящим объектом для апробации подходов, направленных на повышение его биодеградативного потенциала, в том числе за счет использования покоящихся форм в качестве инокулята, вносимого непосредственно в среду с ДГ ("прямое инокулирование") или через пассаж на плотной среде (LB или МПА) ("непрямое инокулирование"). Особенностями ультраструктурной организации ЦПК R. ruber ИЭГМ 326 (рисунок 36 Б), отличавшими их от вегетативных клеток (рисунок 36 А), были: отсутствие признаков деления; укороченная округлая форма; уплотнение клеточной стенки; наличие наружного капсульного слоя; появление крупных электроннопрозрачных включений, по-видимому, алканатов; электронно-плотная гомогенная цитоплазма.
Об интактности ЦПК и сохранности барьерной функции их мембран у ЦПК свидетельствовало наличие зеленой флюоресценции у 95 % клеток, прокрашенных двухкомпонентным красителем Live/Dead (от общего числа ЦПК клеток в 7-мес культуре, по данным прямых микроскопических наблюдений). Важным физиологическим свойством полученных ЦПК являлось их повышенная устойчивость к нагреванию в течение 10 мин в диапазоне температур 55-90 С. Полученные данные подтверждают возможность формирования устойчивых жизнеспособных ЦПК культурой R. ruber ИЭГМ 326, которое можно рассматривать в качестве конститутивной формы покоя в условиях роста, вызывающих стресс голодания (по источнику азота). Биодеструкция ДГ при "прямом" инокулировании среды. Как видно из таблицы 10, оптимальным приемом увеличения эффективности биодеструкции ДГ при повышенной (35±2 С) температуре оказалось применение в качестве инокулята ЦПК.
Убыль ДГ в среде через 48 ч суспензиями вегетативных (3) и покоящихся (2) клеток R. ruber ИЭГМ 326, а также вегетативными клетками, проросшими после первого пассажа ЦПК на МПА (4) и вегетативными клетками, восстановленными после лиофилизации (5) в различных вариантах осуществления процесса биодеструкции. 1 - абиотический контроль.
Отмечено, что при инокулировании среды с ДГ суспензией ЦГЖ и последующей инкубации при 35 С дыхательная активность возобновлялась через более короткий (4 ч) промежуток времени по сравнению с таковым (11 ч) при 27 С (рисунки 38, 39). A
Скорость дыхательной активности (А) и динамика выделения С02 (Б) в процессе биодеструкции ДГ в качестве единственного источника углерода после инокулирования среды суспензиями вегетативных (3) и покоящихся (2) клеток R. ruber ИЭГМ 326 и инкубации при 27 С. 1 - абиотический контроль.
При этом максимальная скорость (3,9 мкл/мин) и общий объем (16,8 мл/л), (см. таблицу 10) выделенного С02 также были выше, чем в вариантах инокулирования среды вегетативными клетками. Биодеструкция ДГ в присутствии глюкозы. В вариантах "прямого инокулирования" среды RS с ДГ и дополнительно внесенной глюкозой (5 г/л) как суспензиями вегетативных клеток, так и ЦГЖ и последующей инкубации при оптимальной температуре 27 С максимальная скорость выделения С02 и его общее количество были существенно выше, чем без добавления соокисляемого субстрата (таблица 10, рисунок 40).
Биодеструкция ДГ при "непрямом" инокулировании среды. В сравнительных экспериментах в качестве инокулята использовали суспензии вегетативных клеток R. ruber ИЭГМ 326 в виде смыва с поверхностных культур, развившихся в первом пассаже при прорастании ЦГЖ на плотной среде. Соответствующим контролем служил вариант с наименьшей эффективностью утилизации ДГ (до 5 %) с внесением клеток штамма после восстановления из лиофилизированного состояния. В этих экспериментах показано, что использование варианта "непрямого инокулирования" (вегетативных клеток, выросших из ЦГЖ) позволило повысить эффективность деструкции ДГ в 4,4 раза при оптимальной температуре (27 С), по сравнению с контролем. При этом эффективность деструкции ДГ составила 4,4 мг/л, что соответствовало его 22 %-ной убыли (рисунок 37; таблица 10).
Таким образом, ЦГЖ родококков, как форма биологической приспособленности способствует не только их выживанию при комплексных изменениях окружающей среды и воздействии неблагоприятных факторов, но и эффективной деструкции фармполлютантов. По результатам ГХ-МС анализа, в процессе биодеструкции ДГ после инокуляции вегетативными клетками или ЦГЖ через 48 ч образовывались одинаковые продукты бактериальной деструкции ДГ, в частности производные протокатеховой кислоты по установленному нами пути обмена. Информация о возможных путях биодеструкции ДГ и продуктах его биодеструкции представлена в следующей главе данной работы.
Возможные пути биодеструкции дротаверина. Токсичность продуктов его биодеструкции
Полученные экспериментальные данные, по сути, отражают реализацию этих двух стратегий поведения микроорганизмов в среде, загрязненной фармполлютантами и свидетельствуют о гибком адаптивном потенциале экологически значимых видов родококков, что проявилось не только в устойчивости к экотоксиканту - ДГ, но и способности к его разложению с разной степенью эффективности, в том числе в неоптимальных условиях.
В настоящей работе впервые показана способность родококков экологически значимых видов к использованию ДГ в качестве единственного источника азота, углерода и энергии. Выявлено, что выраженную (МПК 200 мг/л) устойчивость к ДГ имеют представители экологически значимых видов R. erythropolis, R. rhodochrous и R. ruber. Наиболее высокая ДГ-деструктирующая активность отмечена у штаммов R. erythropolis ИЭГМ 767, R. rhodochrous ИЭГМ 608, ИЭГМ 647 и R. ruber ИЭГМ 326. Однако скорости этих процессов были низки. Для повышения деструктурирующей активности родококков в отношении ДГ использовались различные приемы - от прединкубации клеток в присутствии низких концентраций токсиканта, введения косубстрата и варьирования условий культивирования до использования в качестве инокулята иммобилизованных и дормантных клеток.
В результате проведенных экспериментов установлено, что оптимальными условиями для культивирования родококков являлись присутствие в среде глюкозы, температура 28 С, рН среды 6,8 и чередование (160 и 60 об/мин) скоростей перемешивания) культуральной жидкости. При этом полное разложение 20 мг/л ДГ с использованием свободных клеток происходило через 15 сут.
Показано, что при воздействии ДГ на родококки происходит увеличение степени гидрофобности их клеточной стенки, что проявлялось в увеличении среднеквадратичной шероховатости клеток, их электрокинетического потенциала и содержания суммарных клеточных липидов. Ранее в работах Е.В. Рубцовой с соавт. (2012), М.К. Серебренниковой с соавт. (2014), de Carvalho с соавт. (2009) также отмечено изменение данных свойств родококков в присутствии других токсичных соединений. Среди прочих ответных реакций родококков на присутствие в среде фармполлютанта отмечены диссоциация клеток, изменение их морфометрических показателей и формирование клеточных агрегатов. Полученные результаты согласуется с данными А.С. Сироткина с соавт. (2007), Ю.А. Николаева и В.К. Плакунова (2007). Вероятно, выявленные физиолого-морфологические изменения родококков можно рассматривать как один из механизмов их адаптации к присутствию токсичного соединения. Немаловажную роль при формировании клеточных агрегатов имеет гидродинамический режим (Волошин, 2006; Линькова, 2011). Так, в проведенных нами экспериментах, агрегирование бактериальных клеток происходило намного быстрее при чередовании показателей скоростного режима от 160 до 60 об/мин, чем в условиях интенсивного или медленного перемешивания, а также при внесении в среду культивирования глюкозы. Согласно данным Ю.Ю. Гущиной с соавт. (2005), внесение дополнительного энергетического субстрата в среду культивирования способствует увеличению адаптивного потенциала бактерий. Показано, что нахождение клеток в иммобилизованном состоянии позволяет им более активно деструктировать субстрат. Полученный результат, вероятно, обусловлен более высокой физиологической устойчивостью иммобилизованных на твердом носителе клеток к действию экотоксиканта (van Loosdrecht et al., 1990; Cassidy et al., 1996). В свою очередь, снижение деструктирующей активности родококков, иммобилизованных в матрицу ПВС, в отношении ДГ может быть вызвано сложностью поступления деструктируемого субстрата к клеткам. Полученные результаты согласуются с данными, приведенными в литературе (Ludwige?a/.,2014). Для длительного выживания в неблагоприятных условиях среды важным является способность родококков к образованию конститутивно покоящихся форм - ЦПК. Такая форма биологической приспособленности способствует не только выживанию бактерий при комплексных изменениях окружающей среды и воздействии неблагоприятных факторов, но и обеспечивает распространение бактерий и освоение ими новых ниш. Следует подчеркнуть, что ЦПК образуются в циклах развития микробных культур (их онтогенезе), являются конститутивными формами покоя микроорганизмов и потому не тождественны клеткам, описанным в качестве "resting cells " в ряде исследований по биодеградации различных токсикантов, например, таким, как: "resting cells стационарной фазы роста" (Nallapan Maniyam et al., 2011) или "resting cells, выживающие при перенесении в голодные буферные среды " (Kim et al., 2007; Marchand et al., 2008). В сравнительных исследованиях каталитической активности вегетативных и дормантных клеток при биодеструкции ДГ 100 установлена возможность повышения ДГ-деструктирующего потенциала родококков с использованием ЦГЖ при неоптимальной (35±2 С) температуре.
Для мониторинга убыли ДГ из среды культивирования родококков нами разработана методика хроматографического определения ДГ, пригодная для использования в лабораторных условиях. Предложена кинетическая модель, позволяющая прогнозировать длительность и оптимальное время окончания процесса биодеструкции ДГ.
Выявлено, что процесс бактериального разложения ДГ происходит с раскрытием изохинолинового цикла и сопровождается образованием простых ароматических соединений - производных протокатеховой кислоты. Ранее в работах по биодеструкции папаверина, близкого по химической структуре к ДГ, отсутствовали сведения, подтверждающие факт раскрытия изохинолинового цикла папаверина (Hauer et ah, 1982). Экспериментально обосновано, что продукты биодеструкции ДГ не обладают выраженной токсичностью по сравнению с таковой исходного препарата. В связи с этим с позиций прикладной микробиологии способность родококков к биодеструкции азотсодержащих гетероциклических фармполлютантов, реализованная на примере ДГ, представляет интерес для разработки биопрепаратов на основе родококков для применения в системах очистки сточных вод и биоремедиации загрязненных объектов от фармацевтических токсикантов.
Похожие диссертации на Биодеструкция дротаверина гидрохлорида актинобактериями рода Rhodococcus
