Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Таксономия прокариот, современное состояние и основные методы исследования . 12
Глава 2. Таксономическая структура класса "Gammaproteobacteria" тип Proteobacteria 23
2.1. Семейство Alteromonadaceae 24
2.2. Семейство Moraxellaceae .30
2.3. Семейство Hatomonadaceae , 32
2.4. Бактерии группы Oceanospirillum (семейство "Oceanospirillaceae") 35
Глава 3. Бактерии рода Pseudoalteromonas и родственные бактерии - продуценты вторичных метаболитов 37
Экспериментальная часть.
Глава 4. Объекты и методы исследования 50
4.1. Источники выделения бактерий , 50
4.2. Состав сред и условия культивирования микроорганизмов 51
4.3. Физиолого-биохимические тесты 51
4.4. Методы изучения морфологии 52
4.5. Получение экстрактов клеток 52
4.6. Исследование липидного состава н полисахаридов 53
4.7. Изучение геномных характеристик 53
4.7.1. Выделение ДНК, определение нуклеотидного состава и ДНК-ДНК гибридизации 53
4.7.2. Риботипирование 54
4.8. Секвенирование 16S рибосомных ДНК генов 55
4.9. Филогенетический анализ 55
4.10. Методы определения активности ферментов
4.10.1. Определение нуклеазной активности 55
4.10.2. Определение тирозиназной активности ...57
4.11. Определение антагонистических свойств 57
Результаты и обсуждение.
Глава 5. Род Pseudoalteromonas и родственные бактерии семейства A Iteromonadaceae 58
5.1. Характеристика новых видов агаролитических бактерий Pseudoalteromonas agarivorans и Pseudoalteromonas mariniglutinosa 58
5.2. Меланин-синтезирующие бактерии рода Pseudoalteromonas и их особенности
5.2.1. Реклассификация Alteromonas distincta как Pseudoalteromonas distincta 73
5.2.2. Таксономические особенности вида "Alteromonasfuliginea" 75
5.3. Уровни ДНК-ДНК сходства и филогенетические связи непигментированных видов рода Pseudoalteromonas. Реклассификация Pseudoalteromonas haloplanktis subsp. tetraodonis как Pseudoalteromonas tetraodonis 78
5.4. Бактерии рода Pseudoalteromonas — продуценты ферментов 83
5.4.1. Бактерии рода Pseudoalteromonas - продуценты нуклеаз 83
5.4.2. Таксономические особенности глубоководной бактерии "Alteromonas haloplanktis'* КММ 223 - продуцента полиуридил-специфической эндорибонуклеазы 88
5.4.3. Тирозиназная активность бактерий рода Pseudoalteromonas 92
5.4.4. Биологическая активность бактерий рода Pseudoalteromonas, ассоциированных с асцидией Halocynthia aurantium 97
5.5. Психрофильные бактерии рода Glaciecola и особенности нового вида Glaciecola mesophila 106
5.6. Глубоководные бактерии рода Idiomarina 114
5.7. Характеристика полисахаридов штаммов бактерий рода Pseudoalteromonas и Idiomarina zobellli 120
Глава 6. Биологические особенности нового вида бактерий Haiomonas halocynthiae - ассоцианта асцидии Halocynthia aurantium 126
Глава 7. Психротолерантные бактерии рода Psychrobacter из морской среды и их особенности 135
7.1. Psychrobacter submarinus и Psychrobacter marincola — новые галофильные бактерии рода Psychrobacter 135
7.2. Видовое разнообразие и таксономическая характеристика бактерий рода Psychrobacter изолированных из образцов морского льда и донных осадков Японского моря 146
Глава 8. Новые таксоны бактерий группы OceanospirUlum 158
8.1. Marinomonasprimoryensis - новый внд психрофильных бактерий рода Marinomonas... 158
8.2. Oceanisphaera litoralis gen. nov., sp. nov., галофильная гаммапротеобактерна из морских донных осадков 165
Глава 9. Новые таксоны морских гаммапротеобактерий, не входящие в состав каких-либо известных семейств 171
9.1. Новый род гамма-протеобактерий Reinekea sedimentorum gen. nov., sp. nov 171
9.2. Новый вид глубоководных галотолерантных бактерий Rheinheimera pacifica sp. nov. 179
Заключение 188
Выводы 190
Список литературы 200
- Семейство Alteromonadaceae
- Определение нуклеазной активности
- Таксономические особенности вида "Alteromonasfuliginea"
- Psychrobacter submarinus и Psychrobacter marincola — новые галофильные бактерии рода Psychrobacter
Введение к работе
Состояние вопроса и актуальность проблемы. Морские аэробные гетеротрофные протеобактерии являются важным компонентом и играют существенную роль в биологических процессах экосистем Мирового океана. Следует отметить, что бактерии, обитающие в морской среде, в целом являются менее изученной группой по сравнению с наземными микроорганизмами. Несмотря на проводимые исследования, изучено менее 1% бактерий, изолированных из морской среды (Amann et ai, 1995; Fenical, 1993). Наши знания в области биологии и экологии даже культурабельных морских микроорганизмов остаются весьма ограниченными. Изучение биологического разнообразия морских гетеротрофных протеобактерии на основе анализа фено- и генотипических признаков и филогенетических связей с целью определения их систематического положения в системе микробного мира, а также исследования в области таксономии и систематики морских гаммапротеобактерий являются фундаментальными и имеют важное прикладное значение. Гаммапротеобактерий составляют один из пяти подклассов класса Proteobacteria, который был предложен Stackebrandt et al. (1988) для грамотрицательных микроорганизмов на основании данных сравнительного анализа сиквенса 16S рРНК, и представляет собой одну из основных филогенетических групп протеобактерии. В настоящее время предлагается повысить таксономический ранг класса Proteobacteria до статуса тип "Proteobacteria" и подклассы Proteobacteria рассматривать как классы: "Alphaproteobacteria", "Betaproteobacteria", "Gammaproteobacteria", "Deltaproteobacteria", "Epsilonproteobacteria", соответственно (Ludwig, Klenk, 2001). Результаты филогенетических исследований показали, что класс "Gammaproteobacteria" не является монофилетической группой, как считалось ранее, и включает "Betaproteobacteria" как одну из линий (Ludwig, Klenk, 2001).
Класс "Gammaproteobacteria" представлен разнообразными по физиологическим, метаболическим и экологическим характеристикам микроорганизмами и включает представителей 13 порядков и 20 семейств, которые в свою очередь содержат большое количество родов и видов бактерий.
Морские аэробные гетеротрофные гаммапротеобактерий, составляющие объект настоящего исследования, в значительной мере представлены родами и видами семейств Alteromonadaceae, Moraxellaceae, Halomonadaceae, и группы Oceanospirdlum в составе класса "Gammaproteobacteria". Многие представители этих семейств, в том числе, родов Alteromonas, Pseudoalteromonas, Glaciecola, Idiomanna, Colwellia, Marinomonas являются облигатными морскими прокариотами и составляют важный компонент биоценозов морской среды. Галофильные/галотолерантные и психрофильные или психротолерантные
рос национальна* І
свойства являются характерными для бактерий этих родов, особенно морских представителей родов Halomonas ж Psychrobacter, и их изучение представляет интерес как в плане фундаментальных биологических исследований, так и в экологическом и практическом аспектах. Рутинная идентификация бактерий морской среды, в том числе представителей "Gammaproteobacteria", представляет трудности в связи с многообразием и изменчивостью их, морфологических и биохимических свойств, необходимостью подбора сред и условий культивирования, некоторых штаммов. В последние два десятилетия исследования в области систематики морских "Gammaproteobacteria" интенсивно развиваются благодаря широкому использованию молекулярных методов анализа и разработке полифазной таксономии бактерий (Colwell et al, 1970; Vandamme et al., 1996), о чем свидетельствуют описание новых или реклассификация уже известных родов и видов семейств Alteromonadaceae, Moraxellaceae, Halomonadaceae, и группы Oceanospinllum, в связи с чем дальнейшее совершенствование систематики гаммапротеобактерий остается весьма актуальной задачей. Исследования показывают, что морские аэробные гетеротрофные микроорганизмы имеют значительный биотехнологический, потенциал, поскольку способны синтезировать разнообразные биологически активные вещества (БАВ) и могут служить продуцентами ферментов, деградирующих полисахариды, белки, нуклеиновые кислоты (Austin, 1988; 1989; Tsujibo et al, 1998; Михайлов и др., 1999; Holmstrom, Kjelleberg, 1999). Сохранение микробного разнообразия в коллекциях культур является базисом, который необходим для развития морской микробиологии, биотехнологии, химии морских соединений. Фундаментальное изучение биологии и таксономии морских микробных сообществ является важным для оценки и понимания экологической роли аэробных гетеротрофных гаммапротеобактерий в морских экосистемах.
Целью настоящей работы явилось выделение морских аэробных гетеротрофных
гаммапротеобактерий и изучение их фенотипических свойств, геномных и
филогенетических характеристик; изучение филогенетических взаимосвязей и
установление таксономического статуса выделенных бактерий на основе метода полифазной таксономии; изучение физиологических свойств и биотехнологического потенциала морских бактерий, скрининг штаммов-продуцентов ферментов и других биологически активных веществ; создание и поддержание коллекции морских аэробных гетеротрофных гаммапротеобактерий в рамках Коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН как основы для фундаментального изучения микробного биоразнообразия и биотехнологического использования морских бактерий.
Задачи исследования. В данной работе проведено таксономическое изучение вновь выделенных аэробных гетеротрофных гаммапротеобактерий, изолированных из различных источников морской среды: открытых океанических вод, прибрежных донных осадков и образцов морского льда, ассоциаций с беспозвоночными, преимущественно асцидиями и губками. Проведены исследования по поиску бактериальных продуцентов гидролаз итирозиназ, перспективных для биотехнологии.
Основные задачи:
1. Выделение культур новых аэробных гетеротрофных гаммапротеобактерий из
морских источников различных биотопов морской среды, включая не исследуемые ранее
и малоизученные источники выделения микроорганизмов.
2. Изучение выделенных бактерий на основе полифазной таксономии с
использованием фенотипических, хемотаксономических, генетических и
филогенетических методов.
Изучение физиологических свойств и биотехнологического потенциала морских бактерий, скрининг штаммов-продуцентов ферментов и других биологически активных веществ.
Анализ полученных результатов, выявление и описание новых таксонов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Морские аэробные гетеротрофные гаммапротеобактерий, входящие в состав
семейств Alteromonadaceae, Moraxellaceae, Halomonadaceae и группы Oceanospirillum,
широко распространены в морских экосистемах и были изолированы из разнообразных
биотопов Тихого и Индийского океанов, включая открытые океанические воды,
прибрежные донные осадки и морской лед и микробные сообщества, ассоциированные с
беспозвоночными животными.
Морские аэробные гетеротрофные гаммапротеобактерий характеризуются таксономическим разнообразием. На основе метода полифазной таксономии среди выделеных бактерий идентифированы и описаны новые представители известных родов Pseudolateromonas, Glaciecola, Marinomonas, Halomonas, Psychrobacter, Rheinheimera, и новых родов Idiomarina, Oceanisphaera ж Reinekea в структуре гаммапротеобактерий.
Морские бактерии рода Pseudoalteromonas проявляют высокий уровень гидролитической и тирозиназной активностей; являются продуцентами ферментов эндонуклеаз рестрикции и специфических рибонуклеаз.
Научная новизна работы. Выявлено биологическое разнообразие исследуемых бактерий, получены новые знания в области биологии и таксономической структуры морских гаммапротеобактерий. Показано, что изученные бактерии принадлежат к родам
Pseudoalteromonas, Glaciecola, Alteromonas, Idiomarina, Halomonas, Psychrobacter, Marinomonas - представителям класса "Gammaproteobacteria", среди которых описано 13 новых видов и 3 новых рода в составе гаммапротеобактерий, что составляет вклад в таксономическую структуру этого класса. В составе семейства Alteromonadaceae описан новый род глубоководных бактерий Idiomarina, и два вида, /. zobellii и 1. abyssahs. В составе рода Pseudoalteromonas описаны новые виды P. agarivorans, и P. manniglutinosa. Описан вид "Alteromonas distinctd" yl реклассифицирован как Pseudoalteromonas distincta. Показано, что штамм P. distincta КММ 63 8Т проявляет высокий уровень тирозиназной активности и может быть, использован как продуцент фермента тирозиназы. Вид Pseudoalteromonas haloplanktis subsp. tetraodoms (Alteromonas tetraodonis Simidu et al. 1990) реклассифицирован как Pseudoalteromonas tetraodonis. Впервые выделена глубоководная бактерия "Alteromonas haloplanktis" КММ 223-продуцент фермента эндорибонуклеазы, специфически расщепляющей полиуридиловую кислоту. Впервые обнаружены психротолерантные штаммы бактерий рода Glaciecola КММ 241Т и КММ 642, которые были описаны как новый вид, Glaciecola mesophila. Впервые исследованы бактерии, ассоциированные с асцидией Halocynthia aurantium, в числе которых впервые была обнаружена уникальная по морфологическим и молекулярным характеристикам галофильная бактерия, которая описана как новый вид бактерий рода Halomonas, Н. halocynthiae. В составе рода Psychrobacter впервые описано два новых вида галофильных бактерий, способных расти при 15% хлористого натрия, P. submannus и P. marincola. Исследования видового разнообразия и таксономии бактерий рода Psychrobacter, изолированных из образцов морского льда и грунта прибрежной зоны Японского моря, показали, что новые штаммы составляют филогенетически и генетически гетерогенную группу, которая включает бактерии, относящиеся к известным антарктическим видам, и отличные между собой и от других валидных видов геномовиды, представляющие, по-видимому, новые виды рода Psychrobacter. В составе бактерий группы Oceanospirdlum обнаружены и описаны новые таксоны: новый вид психрофильных бактерий рода Marinomonas и новый род и вид морских галофильных бактерий Oceanisphaera litorahs gen. nov., sp. nov. Новая бактерия описана как новый род и вид морских гаммапротеобактерий, Reinekea sedtmentorum, который не входит в состав какого-либо известного семейства. Глубоководная галотолерантная бактерия КММ 1406т описана как новый вид рода Rheinheimera, R. paciflca.
Практическое значение. Создана и поддерживается коллекция детально охарактеризованных морских гаммапротеобактерий в рамках Коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН как фундаментальная база для изучения микробного
5 разнообразия и биотехнологического использования гаммапротеобактерий в качестве продуцентов физиологически активных соединений. Показано, что бактерии рода Pseudoalteromonas проявляют высокий уровень гидролитической и тирозиназной активностей; выделены и поддерживаются в рамках Коллекции Морских Микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН штаммы-продуценты ферментов эндонуклеаз рестрикции и специфических рибонуклеаз. Штамм Pseudoalteromonas sp. ("Alteromonas haloplanktis ") KMM 223 запатентован в качестве продуцента полиуридил-специфической эндорибонуклеазы, действие и свойства фермента изучены.
Место проведения работы. Работа выполнялась в лаборатории микробиологии ТИБОХ ДВО РАН.
Благодарности. Исследования были поддержаны грантами РФФИ 02-04-49058 и Минпромнауки РФ 03-19 и 2-2.16. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю ТИБОХ ДВО РАН академику Г. Б. Елякову, директору ТИБОХ ДВО РАН академику В. А. Стонику, д.б.н., проф. В. В. Михайлову за всестороннюю поддержку в работе, искреннюю признательность Prof Dr. Е. Stackebrandt, Dr. P. Schumann, Dr. M. Uchino, Prof Dr. T. Uchimura и другим коллегам за помощь в работе. Автор благодарит своих соавторов - сотрудников лабораторий микробиологии, химии пептидов, морской биохимии, химии углеводов, химии микробных метаболитов ТИБОХ ДВО РАН, Института микробиологии РАН им. С. Н. Виноградского, лаборатории сравнительной биохимии Института биологии моря ДВО РАН за сотрудничество.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на Всесоюзном совещании "Биологически активные вещества при комплексной утилизации гидробионтов", ТИНРО, Владивосток, (1988); International Science Conference "Bridges of Sience between North America and the Russian Far East", Anchorage -Vladivostok, (1994); 9-th European Carbohydrate Symposium, Utrecht, Netherlands, (1997); Conference Oceanology International 97 Pacific Rim., Singapore, (1997); Научной конференции ТИБОХ ДВО РАН "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии", Владивосток, (1998); 8-th International Symposium on Microbial Ecology (ISME-8), Canada, (1998); 2-ом Международном симпозиуме "Химия и химическое образование", Владивосток, (2000); Научной конференции ТИБОХ ДВО РАН "Биоактивные вещества из морских макро- и микроорганизмов и наземных растений Дальнего Востока", Владивосток, (2001).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 33 статьи, 17 тезисов докладов, 1 патент, 1 монография, Глава в электронной версии международного микробиологического руководства "The Prokaryotes" (Springer-Verlag).
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (Главы 1-3), экспериментальной части: объектов и методов исследования (Глава 4), результатов и обсуждения (Главы 5-9), заключения и выводов. Материалы диссертации изложены на 221 странице машинописного текста и иллюстрированы 27 рисунками и 27 таблицами. Список цитируемой литературы включает 263 источника.
Семейство Alteromonadaceae
Семейство Alteromonadaceae предложено для объединения четырех родов облигатных морских бактерий, образующих по данным филогенетического анализа бактерий данных родов, монофилетическую генеалогическую линию (Иванова, Михайлов, 2001). Семейство входит в состав гамма подкласса Proteobacteria и включает четыре рода Alteromonas, Pseudoalteromonas, Idiomarina и Colwellia, Типовым родом был предложен род Alteromonas Baumann, Baumann, Mandel, Allen 1972, emend. Gauthier, Gauthier, Christen 1995 как первый описанный род предложенного семейства Alteromonadaceae. Представители этого семейства характеризуются основными общими фенотипическими признаками, будучи грамотрицательньгми бактериями, подвижными с помощью одного полярного жгутика, иногда очехленного, либо латеральных жгутиков, некоторые виды имеют фимбрии, филаменты или другие структуры. Бактерии слабо или умеренно галофильные и требуют для роста ионы натрия. Отдельные виды способны расти на средах с содержанием 15% хлористого натрия. Хемоорганотрофы. Используют кислород как акцептор электронов. Аэробы или факультативные анаэробы. Некоторые виды способны к денитрификации. Не имеют аргинин дигидролазы. Большинство видов утилизируют глюкозу. Убихиноны Qg. Основные жирные кислоты 15:0i, 16:0, \6:\аЛс. Содержание Г+Ц в ДНК составляет 37-50 моль% (Иванова, Михайлов, 2001). В настоящее время предложено расширить семейство Alteromonadaceae с включением в него, кроме Alteromonas, Pseudoalteromonas, Idiomarina и Colwellia, родов Ferrimonas, Glaciecola, Marinobacter, Marinobacterium, Microbulbifer, Moritella, Psychromonas, Shewanella (Taxonomic Outline of the Archaea and Bacteria Bergey s Manual of Systematic Bacteriology, 2n Edition). Род Alteromonas. В 1972 году Л. Бауманн и соавторы описали новый род Alteromonas (Baumann et al., 1972). Бактерии нового рода Alteromonas образовали 4 фенотипически различных кластера, каждый из которых соответствовал новому виду бактерий: A. communis, A. vaga, A. macleodii и A. marinopraesens, который позже был переименован A. haloplanktis (Reichelt, Вашпагщ, 1973). Дальнейшие молекулярно-генетические исследования подтвердили гетерогенность рода Alteromonas и показали генетическую удаленность вида A. macleodii от других альтеромонад, также как и видов A. communis и A. vaga, которые были исключены из рода Alteromonas и образовали новый род морских бактерий Marinomonas (Van Landschoot, DeLey, 1983). Использование филогенетических методов исследований позволило завершить ревизию гетерогенного рода Alteromonas с образованием родов: Alteromonas с единственным видом A. macleodii и Pseudoalteromonas, включающим 11 видов бактерий, принадлежащих ранее к роду Alteromonas (Gauthier et al., 1995). В дальнейшем к роду Alteromonas были отнесены новые глубоководные бактерии, выделенные из образцов воды морских гидротермальных выходов, "Л. macleodii subsp, fijiensis"1 (Raguenes et al., 1996) и "A. in/emus" (Raguenes et at., 1997), но таксономический статус этого вида и подвида пока не узаконен. Новый вид Alteromonas marina, изолированный из морской воды Японского моря, описан недавно (Yoon et al., 2003). Род Pseudoalteromonas Результаты филогенетического анализа SSU (small subunits) 16S рРНК бактерий родов Alteromonas, Shewanella, Vibrio и Pseudomonas показали, что Alteromonas macleodii филогенетически удалена от других видов альтеромонад и род Alteromonas следует разделить на два рода: род Alteromonas с единственным видом A. macleodii и новый род Pseudoalteromonas, включающий 11 видов ранее описанных альтеромонад с типовым штаммом P. haloplanktis АТСС 14393 и Pseudomonas piscicida (Gauthier et al., 1995). Таким образом, в результате ревизии следующие виды альтеромонад были реклассифицированы как виды рода Pseudoalteromonas: Pseudoalteromonas atlantica (Akagawa-Matsushita et al., 1992b), Pseudoalteromonas aurantia (Gauthier, Breittmayer, 1979), Pseudoalteromonas carrageenovora (Akagawa-Matsushita et aL, 1992b), Pseudoalteromonas citrea (Gauthier, 1977), Pseudoalteromonas denitrificans (Enger et aL, 1987), Pseudoalteromonas espejiana (Chan et aL, 1978), Pseudoalteromonas luteoviolacea m (Gauthier, 1976b; 1982), Pseudoalteromonas nigrifaciens (White, 1940; Baumann et aL, 1984b), Pseudoalteromonas piscicida (Bein, 1954; Buck et aL, 1963), Pseudoalteromonas rubra (Gauthier, 1976a), Pseudoalteromonas undina (Chan et a!., 1978) (Gauthier et aL, 1995). В последующие годы род Pseudoalteromonas был пополнен новыми видами: Р. antarctica (Bozal et aL, 1997), P. prydzensis (Bowman, 1998), P. bacteriolytica (Sawabe et aL, щ 1998), P. tunicata (Holmstrom et aL, 1998), P. peptidolytica (Venkateswaran, Dohmoto, 2000), P. ulvae (Egan et aL, 2001), а также ранее описанными как альтеромонады видами Р. distincta (Ivanova et aL, 2000), P. tetraodonis (Ivanova et aL, 2001), P. elyakovii (Sawabe et aL, 2000). Род Pseudoalteromonas (Gauthier et aL, 1995; emend, Ivanova et aL, 2002d) является наиболее многочисленным среди семейства Alteromonadaceae по количеству видов и включает около 30 видов, в том числе, описанные недавно P. issachenkonii, P. ruthenica, Р. maricaloris, P. flaviputchra, P. translucida, P. paragorgicola (Ivanova et at., 2002a, 2002b, 2002c, 2002d), P. phenolica (Isnansetyo, Kamei, 2003), и P. sagamiensis (Kobayashi et a!, 2003). Род Colwellia На основании изучения представителей микробных популяций, обитающих на ультраабиссальных глубинах (1000-6000 метров), было предложено создать новый род Colwellia, объединяющий глубоководный барофильный штамм BNL-1 как новый вид Colwellia hadaliensis и Vibrio psychroerythrus, реклассифицированный как Colwellia psychroerythrus comb. nov. (Deming et aL, 1988). Типовой вид Colwellia psychroerythrus представляет пигментированные морские психрофильные бактерии ранее идентифицированные как Vibrio psychroerythrus (D Aoust, Kushner, 1972). Видовой эпитет С. psychroerythrus был изменен в 1998 году как psychrerythraea (от латинского erythraeus, а, -ит - красный) (Euzeby, 1998).
Из скоплений диатомовых водорослей, собранных в образцах антарктического льда, Д. Боумен и соавторы изолировали группу психрофильных, факультативно-анаэробных, непигментированных, галофильных бактерий, способных синтезировать полиненасыщенную жирную кислоту, докозагексаеновую кислоту (ДГК). В результате исследований было показано, что антарктические штаммы бактерий, продуцирующие ДГК, представляли собой пять видов: Colwellia psychrerythraea, и новые виды Colwellia demingiae, Colwellia psychrotrophka, Colwellia rossensis, Colwellia hornerae (Bowman et at, 1998a).
Определение нуклеазной активности
Бактериальные клетки осаждали центрифугированием при 2000 g в течение 30 мин. Осадок промывали 0, 01 М трис-HCL буфером, рН 8, 0, содержащим 0, 005 М MgC и 0, 01 % NaNj, и центрифугировали. Промытый осадок суспендировали в 70 мл того же буфера и обрабатывали ультразвуком с частотой 22 кГц пятикратно по 30 секунд в ледяной бане с последующим центрифугированием при 5000 g в течение 20 мин. Полученную надосадочную жидкость использовали для изучения нуклеазной активности. Нуклеазную активность определяли в стандартных условиях по количеству кислоторастворимых продуктов гидролиза субстратов: высокополимерной ДНК из селезенки крупного рогатого скота (НПО "Вектор", Россия); денатурированной ДНК, полученной из нативной ДНК кипячением в течение 30 минут с последующим быстрым охлаждением; высокополимерной дрожжевой РНК и синтетических одноцепочечных гомополирибонуклеотидов: Поли(У) (полиуридиловая кислота), Поли(А) (полиадениловая кислота), Поли(Ц) (полицитидиловая кислота) (НПО "Вектор", Россия). Инкубационная смесь общим объемом I мл содержала 0, 1 М трис-НС1 буфер с 0, 005 М MgCb, рН 8, 0; субстрат 10 оптических единиц (А ) и 10 мкл супернатанта. Инкубацию проводили при 37 С в течение 20 мин. Реакцию останавливали добавлением 2 мл охлажденного раствора 0, 5 М HCIO4, содержащей 0, 1% La(NOj)j. После центрифугирования при 12000 g в течение 15 мин. в надосадочной жидкости определяли концентрацию продуктов гидролиза субстрата по поглощению при 260 нм на спектрофотометре "Gilford" (США). Операцию центрифугирования проводили при температуре 0-4 С. Опыты проводили в трех повторностях. За единицу активности принимали количество фермента, приводящее к образованию 1 оптической единицы (Агбо) низкомолекулярных продуктов гидролиза соответствующего субстрата при длине оптического пути 1 см за 20 мин. инкубации при 37 "С. Удельную активность выражали в единицах активности на 1 мг белка. Концентрацию белка в растворе определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976).
Эндонуклеазы рестрикции определяли в организации "Сибэнзим", г. Новосибирск, по известным методам (Дедков и др., 1990). Для определения использовали культуры, выращенные на модифицированной агаровой среде Y-K. Продукты гидролиза ДНК анализировали электрофоретически в горизонтальном 1 % агарозном геле ("Sigma"). Для определения уровня тирозиназной активности бактерии культивировали на средах различного состава: среда с тирозином (среда Т) и среда с аргинином (среда А) как описано (Pomerantz, Murthy, 1974); модифицированную среду Youshimizu-Kimura, (среда Y-K), и также среду Y-K с добавлением 1 мл/литр среды 1 % раствора сернокислой меди (среда Y-K. + Сц2+). Все используемые среды содержали 750 мл морской воды на один литр среды. Активность тирозиназ в супернатанте разрушенных клеток и культуральной жидкости определяли спектрофотометрическим методом по образованию дофахрома из L-тирозина (Pomerantz, Murthy, 1974). Определение проводили в трех повторностях. За единицу активности принимали количество фермента, необходимое для образования дофахрома из L-тирозина со скоростью 1 микромоль в минуту. Коэффициент молярной абсорбции дофахрома при 475 нм - 3700.
Антагонистические свойства бактерий исследовали методом штрихов, а также агаровых блоков. В качестве тестовых микроорганизмов использовали следующие культуры: Escherichia coli К.-13, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853T, Proteus vulgaris CIP 104989T, Staphylococcus aureus ATCC 21027T, Candida albicans KMM 455T, Bacillus subtilis CIP 52.62T. Антимикробная активность учитывалась как положительная, если зона угнетения роста тест-микроба была более 10 мм.
Род Pseudoalteromonas образован Gauthier et aL (1995) в результате ревизии рода Alteromonas, проведенной на основании филогенетического анализа сиквенса рРНК генов штаммов, относящихся к родам Alteromonas, Shewanella, Vibrio\ и Pseudomonas. В настоящее время род Pseudoalteromonas является самым многочисленным по числу видов (более 30) в составе семейства Alteromonadaceae (Mikhailov et aL, 2002). Бактерии этого рода наряду с представителями родов Alteromonas, Glaciecola, Idiomarina и Colwellia семейства Alteromonadaceae широко распространены в морской среде и могут считаться облигатно морскими гаммапротеобактериями. Род Pseudoalteromonas включает известные виды P. carrageenovora и P. atlantica (Akagawa-Matsushita et aL, 1992b; Gauthier et aL, 1995), обладающие способностью разлагать сложные полисахариды водорослей. Первоначально эти бактерии были выделены и идентифицированы как Pseudomonas atlantica и Pseudomonas carrageenovora (Yaphe, 1962), в дальнейшем отнесены к роду Alteromonas (De Vos et aL, 1989), и описаны как виды Alteromonas carrageenovora и Alteromonas atlantica Akagawa-Matsushita et aL (1992b). В связи с ревизией рода Alteromonas в 1995 году эти виды были реклассифицированы как виды рода Pseudoalteromonas, P. carrageenovora и P. atlantica (Gauthier et aL, 1995). P. atlantica деградирует агар и является источником промышленного получения ферментов агараз. Бактерии P. carrageenovora и 10% штаммов P. atlantica гидролизуют каррагинаны -сложные полисахариды, входящие в состав клеточных стенок водорослей Rhodophyta, а также альгинаты (Akagawa-Matsushita et aL, 1992b).
Таксономические особенности вида "Alteromonasfuliginea"
Результаты ДНК-ДНК гибридизации среди непигментированных видов показали, что межвидовой уровень геномного родства бактерий рода Pseudoalteromonas находится в среднем в пределах 20-40%. Отдельные виды имеют более высокий уровень ДНК-ДНК гомологии, например, P. haloplanktis и P. undina — 54%, P. espejiana и P. atlantica — 54%, Р. tetraodonis и P. carrageenovora - 58%, P. distincta и P. elyakovii 54% {Табл. 5). Данные ДНК-ДНК гибридизации согласуются с результатами филогенетических анализов, поскольку отдельные пары из перечисленных непигментированных видов являются филогенетически близкими и некоторые из них почти неразличимыми видами. Анализ филогенетических связей бактерий рода Pseudoalteromonas показал, что основной кластер составляют непигментированные виды, P. antarctica, P. nigrifaciens, P. undina, P. atlantica, P. carrageenovora, P. elyakovii, P. distincta, включая типовой штамм P. haloplanktis, которые являются филогенетически близкими с высоким уровнем сходства 16S рРНК 99,4-99,9% (Рис. 7, 9), Исследования уровней ДНК-ДНК гибридизации филогенетически близких бактерий рода Pseudoalteromonas (Mikhailov et al. 2002) свидетельствуют о том, что величины ДНК- сходства между этими видами не превышают 70% величины, которая принята как пограничная для разделения видов бактерий одного рода (Wayne et al., 1987). Штамм P. mariniglutinosa NCIMB 1770т выявил самый высокий уровень сходства 16S рРНК 99,3% по отношению к P. prydzensis АСАМ 620т и только 35% ДНК-ДНК гибридизации (Табл. 4). P. prydzensis показал более низкий уровень ДНК-сходства 10 28% с непигментированными видами по данным Bowman (1998), и филогенетически этот вид несколько удален от других непигментированных видов и образует отдельный подкластер (Рис, 7). Таким образом, представленные данные свидетельствует о том, что величина 97,5% сходства 16S рРНК, предложенная для разграничения бактерий на уровне вида (Stackebrandt, Goebel, 1994), может быть поднята до величины 99,0% для видов рода Pseudoalteromonas, а также, что ДНК-ДНК гибридизация является ведущим методом при установлении видового статуса и описании новых видов псевдоальтеромонад. Среди пигментированных видов P. citrea и Р. аигапйа являются филогенетически близкими видами, образующими отдельную ветвь внутри рода, которые удалены от Р. haloplanktis и других непигментированных видов (97,5-97,6% сходства 16S рРНК). Недавно описанный вид темно-пурпурных бактерий P. ulvae показал 97% сходства 16S рРНК генов с видами Pseudoalteromonas (Egan et al., 2001). Виды P. peptidolytica и P. piscicida (99,1% сходства 16S рРНК генов) вместе с бактериями видов P. luteoviolacea и Р. rubra формируют отдельную подгруппу среди пигментированных видов Pseudoalteromonas. Виды P. denitrificans, P. tunicata и P. bacteriolytica образуют глубокие индивидуальные линии внутри рода Pseudoalteromonas, и среди них наиболее удален вид P. bacteriolytica (величины сходства 16S рРНК с другими видами Pseudoalteromonas составляют 90,6-91,0%). В 1990 году группой японских исследователей был описан новый вид Alteromonas tetraodoms (Simidu et at., 1990). Бактерия A. tetraodonis была изолирована из слизи кожных покровов рыбы Fugu poecilonotus - известного продуцента тетродотоксина, синтезировала тетродотоксин и отличалась рядом фенотипических признаков от других ранее описанных видов (Simidu et al., 1990). В 1993 году вид A, tetraodonis был реклассифицирован как А. haloplanktis subsp. tetraodonis (Akagawa-Matsushita et al., 1993), а после ревизии рода Alteromonas был включен в род Pseudoalteromonas как P. haloplanktis subsp. tetraodonis. Типовой вид P. haloplanktis был реклассифицирован соответственно как P. haloplanktis subsp. haloplanktis (Gauthier et al., 1995). Результаты исследования уровней ДНК-ДНК сходства среди непигментированных типовых штаммов псевдоальтеромонад (альтеромонад), проведенные в 1993 году и в последующие годы, не подтвердили результаты, полученные Akagawa-Matsushita et al. (1993). Уровень ДНК-ДНК сходства типовых штаммов Р. haloplanktis и A. tetraodoms составил 48%, что свидетельствовало о том, что A. tetraodonis является самостоятельным видом рода Pseudoalteromonas и его таксономический статус должен быть восстановлен. Результаты были подтверждены повторными молекулярно-генетическими экспериментами (Рис. 9) и изучением физиолого-биохимических свойств штаммов P. haloplanktis subsp. tetraodoms [Alteromonas] tetraodonis IAM 14160 (A-M) и IAM 14160т, что позволило восстановить статус вида как Pseudoalteromonas tetraodonis comb. nov. В процессе изучения таксономического положения Alteromonas tetraodonis были использованы три штамма: КММ 45 8Т, любезно предоставленный нам У. Сим иду, т IAM 14160 (А-М), который предоставила М. Акагава-Матсушита и IAM 14160 , присланный Коллекцией Культур Института молекулярной и клеточной биологии, Токио, Япония, первый из которых был получен как Alteromonas tetraodonis, остальные - как штаммы P. haloplanktis subsp. tetraodonis. Полученные нами данные ясно показали, что штаммы КММ 458 и IAM 14160 почти неразличимы и представляют собой самостоятельный вид, как и было описано первоначально (Simidu et al., 1990) с типовым штаммом P. tetraodonis IAM 14160т (Simidu, Kitasukamoto, Yasumoto, Yotsu 1990). Таксономический статус типового вида P. haloplanktis subsp. haloplanktis был восстановлен как P. haloplanktis.
К оригинальному описанию Alteromonas tetraodonis (Simidu et al, 1990), реклассифицированному как Pseudoalteromonas tetraodonis comb. nov. были добавлены следующие характеристики. Бактерия P. tetraodonis способна расти на средах, содержащих 1-7% NaCl. Утилизирует D-глюкозу, D-фруктозу, сахарозу, D-галактозу, DL-лактат, капроат, валерат, бутират, цитрат, фумарат, сукцинат, глутамат, ацетат, пируват, этанол, и L-тирозин; и неспособна утилизировать D-маннозу, лактозу, D-рибозу, D-ксилозу, D-арабинозу, D-рамнозу, глюконат, салицин, глицерин, сс-кетоглутарат, мальтозу, маннит, L-гистидин, L-пролин, и D-малат. Чувствительна к ампициллину, бензилпенициллину, стрептомицину, эритромицину, гентамицину, ванкомицину, тетрациклину, и карбенициллину. Не чувствительна к 0/129, линкомицину, и оксациллину. Бактерия содержит основные клеточные жирные кислоты 16:let»7с, 16:0, 17:1 и8с. Минорные жирные кислоты 15:0, 15:ft 8c, 17:0, 18:1G 7C. Фосфатидилэтаноламин и фосфатидилглицерин составляют 75,1 и 23,7 % от общего содержания фосфолипидов, соответственно. Бактерии не содержат кардиолипин и гликолипид.
Psychrobacter submarinus и Psychrobacter marincola — новые галофильные бактерии рода Psychrobacter
Исследования показывают, что характерной особенностью бактерий морской среды является наличие комплекса внеклеточных гидролитических ферментов, с помощью которых микроорганизмы участвуют в процессах биодеградации сложных молекул полисахаридов, белков, нуклеиновых кислот. Бактерии рода Pseudoalteromonas отличаются высокой активностью гидролаз и являются продуцентами хитиназ (Tsujibo et al., 1998), агараз (Yaphe, 1957; Vera et al., 1998). В публикациях и предыдущих главах были охарактеризованы псевдоальтеромонады, изолированные из Н. aurantium, продуценты гидролаз, в том числе, внутриклеточных специфических РНК-аз, рестриктаз (Табл. 7); и оксидоредуктаз тирозиназ (Романенко и др., 1994а, б, в).
Полученные результаты по таксономическому составу и биологической активности микроорганизмов-ассоциантов пурпурной асцидии подтверждаются также данными, представленными в обзорных статьях (Holmstrom, Kjelleberg, 1999; Mikhailov et al., 2002), что свидетельствует о широком распространении бактерий рода Pseudoalteromonas в ассоциациях с различными морскими животными и растениями и обнаружении у бактерий этого рода антимикробных, бактериолитических, агаролитических и альгицидных свойств. Способность синтезировать разнообразные БАВ, рассматриваемая некоторыми авторами как уникальная характеристика рода Pseudoalteromonas, позволяет псевдоальтеромонадам конкурировать с другими бактериями в борьбе за источники питания и колонизацию объектов морской среды (Holmstrom et al., 1998; H6lmstrom, Kjelleberg, 1999).
Способность бактерий морской среды проявлять антагонистические свойства в отношении наземных патогенных бактерий является важной характеристикой микроорганизмов. Как показали наши исследования, наибольший процент штаммов-антагонистов С. albicans и P. vulgaris был обнаружен среди представителей родов
Pseudoalteromonas (84% и 81%), Vibrio (75%), Bacillus sensu lato (64% и 41%) и Cytophaga/Flavobacterium (41% и 47%) (Табл. 12), Особенностью бактерий Bacillus sensu lato было проявление антимикробной активности в отношении грамположительных микроорганизмов S. aureus и В. subtilis (39% и 23%, соответственно). В отличие от спорообразующих бацилл и группы цитофаг-флавобактерий бактерии рода Pseudoalteromonas имели ограниченный спектр антимикробной активности. Незначительной была антимикробная активность всех исследуемых микроорганизмов против Е. coli и отсутствовала в отношении Р, aeruginosa.
Полученные данные подтверждают исследования японских ученых по изучению антимикробной активности бактерий, изолированных из морской воды и зоопланктона прибрежной зоны Японского моря, которые показали, что максимальное число активных изолятов было выделено из зоопланктона и ракообразных, 81% из которых составили бактерии группы Pseudomonas-Alteromonas (Nair, Simidu, 1987). Антибиотические вещества способны синтезировать пигментированные бактерии рода Pseudoalteromonas (Gauthier, Flatau, 1976; Austin, 1988). Антагонистические свойства морских микроорганизмов имеют важное биологическое значение, поскольку синтез бактериями антимикробных веществ является важным преимуществом в конкурентной борьбе за пищу и пространство (Gauthier, Flatau, 1976). Кроме того, антимикробные соединения, продуцируемые некоторыми видами псевдоальтеромонад, могут служить химической защитой гидробионта-хозяина от патогенных микроорганизмов (Gilurnes et al., 1989).
Таким образом, в процессе исследований бактерий-ассоциантов асцидий Halocynthia aurantium показано, что внутренние ткани и органы данного вида асцидий колонизированы сообществом гетеротрофных микроорганизмов, которое характеризовалось таксономическим разнообразием и высокой биологической активностью. В бактериальном комплексе ассоциированных микроорганизмов доминировали бактерии рода Pseudoalteromonas (38% от числа изученных штаммов), которые являются облигатными морскими гаммапротеобактериями и широко распространены в морской среде как среди свободноживущих, так и в ассоциациях с различными видами морских беспозвоночных животных. Выделенные бактерии-ассоцианты Halocynthia aurantium способны синтезировать широкий спектр гидролитических ферментов, в том числе, РНК-азы, специфические эндонуклеазы рестрикции, и проявляют антагонизм в отношении С. albicans, P. vulgaris, В. subtilis, S. aureus. От 81% до 84% псевдоальтеромонад проявили антагонизм в отношении P. vulgaris и С. albicans. Спорообразующие микроорганизмы Bacillus sensu lato составляют значительную часть (25%) бактериального комплекса и обладают высокой биологической активностью. Для этой группы отмечены такие характерные особенности, как, высокая хитиназная и внеклеточная РНК-азная активности, и наибольшее количество штаммов-антагонистов грамположительных микроорганизмов S. aureus и В. subtilis (39% и 23%, соответственно). Возможно, биологически активные метаболиты доминирующих групп бактерий-ассоциантов, могут служить для защиты данного вида асцидии-хозяина от колонизации болезнетворными микроорганизмами.
