Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Историческая справка 12
1.2. Этиологическая структура и клинико-эпизоотологические особенности проявления инфекционного кератоконъюнктивта крупного рогатого скота 18
1.2.1. Инфекционный кератоконъюнктивит, вызываемый бактериями Moraxella bovis 18
1.2.2. Конъюнктивит, вызываемый герпесвирусом типа I крупного рогатого скота 22
1.2.3. Инвазионный конъюнктиво-кератит, вызываемый телязиями 25
1.2.4. Конъюнктивит, вызываемый хламидиями 27
1.2.5. Конъюнктивит, вызываемый Mycoplasma bovoculi 29
1.3. Характеристика и биологические свойства основного возбудителя инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота - бактерий Moraxella bovis ЗО
1.3.1. Классификация бактерий рода Moraxella семейства Neisseriaceae 30
1.3.2. Ростовые потребности и питательные среды для культивирования 31
1.3.3. Биологические свойства культур бактерий Moraxella bovis 31
1.4. Лабораторные методы диагностики ИКК крупного рогатого скота, вызываемого бактериями Moraxella bovis 32
1.5. Заключение по обзору литературы " 34
2. Собственные исследования 36
2.1. Материалы и методы 36
2.1.1. Анализ эпизоотической ситуации по ИКК крупного рогатого скота в хозяйствах региона Среднего Поволжья 36
2.1.2. Подопытные животные ,37
2.1.3. Патологический материал 37
2.1.4. Оборудование, материалы и реактивы 38
2.1.5. Бактериальные среды 39
2.1.6. Штаммы культур бактерий Moraxella bovis 39
2.1.7. Методы лабораторной диагностики 39
2.1.7.1 Отбор проб клинического и патологического материалов 39
2.1.7.2. Бактериологические методы 40
2.1.7.3. Патологоанатомические, гистологические и электронно-микроскопические исследования 43
2.1.7.4. Дифференциальная диагностика 44
2.1.7.5. Иммунологические методы 45
2.1.8. Определение спектра патогенности выделенных культур бактерий Moraxella bovis для лабораторных животных 47
2.1.9. Определение патогенности выделенных культур бактерий Moraxella bovis по отношению к естественно восприимчивым животным 52
2.1.10. Статистическая обработка результатов исследований 53
3. Результаты собственных исследований 54
3.1. Клинико-эпизоотологические особенности проявления ИКК крупного рогатого скота в хозяйствах региона Среднего Поволжья и Предуралья 54
3.2. Микробиологические исследования с целью выделения возбудителя ИКК крупного рогатого скота 64
3.3. Изучение биологических свойств культур бактерий, выделенных от животных, больных инфекционным кератоконъюнктивитом, на территории Республики Татарстан 68
3.3.1. Морфологические признаки '68
3.3.2. Культуральные свойства 69
3.3.3. Биохимические свойства 71
3.3.4. Хранение штаммов 75
3.4. Иммунологическая идентификация выделенных культур бактерий Moraxella bovis 77
3.5. Дифференциальная диагностика ИКК крупного рогатого скота.. 83
3.6. Определение спектра патогенности культур бактерий Moraxella bovis для белых мышей 84
3.7. Патоморфологическое воздействие токсинов вьщеленных культур бактерий Moraxella bovis на морских свинок 87
3.8. Изучение токсического действия культур бактерий Moraxella bovis на кроликов 96
3.9. Экспериментальное воспроизведение ИКК на телятах 98
Обсуждение результатов исследований 104
Выводы 119
Практические предложения 121
Список использованной литературы 122
Приложения 142
- Этиологическая структура и клинико-эпизоотологические особенности проявления инфекционного кератоконъюнктивта крупного рогатого скота
- Характеристика и биологические свойства основного возбудителя инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота - бактерий Moraxella bovis
- Анализ эпизоотической ситуации по ИКК крупного рогатого скота в хозяйствах региона Среднего Поволжья
- Клинико-эпизоотологические особенности проявления ИКК крупного рогатого скота в хозяйствах региона Среднего Поволжья и Предуралья
Этиологическая структура и клинико-эпизоотологические особенности проявления инфекционного кератоконъюнктивта крупного рогатого скота
Инфекционный кератоконъюнктивит, вызываемый этим микроорганизмом, клинически характеризуется односторонним или двусторонним воспалением конъюнктивы и роговицы, слезотечением, серозно-гнойными истечениями из носа и глаз, светобоязнью. Сопровождается катаральным конъюнктивитом, кератитом и гнойно-язвенным поражением роговицы [М.В.Плахотин и соавт., 1966, 1971; G.E.Wilcox, 1968; Р.Дженсен и соавт., 1977; и др.]. Заражается крупный и мелкий рогатый скот, а согласно некоторым авторам - все виды животных [К.А.Фомин, 1968]. Отдельные случаи заболевания отмечены у лошадей, свиней и собак, имевших контакті с больными животными, но у них болезнь проявляется спорадически [В.Б.Андриасян и соавт., 1988].
Заболевание наносит значительный экономический ущерб хозяйствам вследствие высокой частоты его проявления. Потери складываются из снижения продуктивности, уровня потребления корма, уменьшения привесов, потерь живой массы, иногда падежа, а также расходов на дорогостоящее лечение [К.Эльце и соавт., 1977; Я.ККараджов, 1979; Т.Е.Какоулин, 1982; K.E.Kopecky et al., 1983; В.Н.Карайченцев и соавт. 1992; и др.].
Причиной болезни является сочетание физического фактора и биологического возбудителя. Ведущая роль при ее возникновении принадлежит бактериям Moraxella bovis [J.Poels, 1917; J.R.Hughes et al., 1964; Р.Дженсен и соавт., 1977; А.Ф.Русинов, 1995; и др.]. В качестве сопутствующей микрофлоры часто встречаются Р-гемолитические диплококки, стрептококки и стафилококки. На течение болезни как у отдельных животных, так и у всего поголовья неблагополучного стада влияют: недостаток витамина А, интенсивное УФ-облучение (солнечный свет), пыль и высокая трава на пастбище, травмирующая глаза [К.Эльце и соавт., 1977; Я.Н.Караджов, 1979; А.Ф.Русинов, 1995]. Возбудитель может выделять эндотоксин, который при введении в роговицу глаза вызывает типичные для кератоконъюнктивита изменения [D.E.Hughes et al., 1970; V.Schmidt, 1973; A.KArora, 1982; W.George, 1984; R.Rosenbusch, 1985; S.LJroutt et al., 1985].
Бактерии Moraxella bovis, ранее относимые к роду Hemophilus, обычно обнаруживаются в конъюнктивальном мешке глаз и выделениях из носа крупного рогатого скота, пораженного инфекционным кератоконъюнктив.итрм [E.J.Madigan et al., 1974; Р.Дженсен и соавт., 1977; Я.Н.Караджов, 1979; H.Stellmacher et al., 1988; и др.]. Источником инфекции являются больные животные. Заражение осуществляется при прямом контакте, а также через обслуживающий персонал и предметы ухода. Доказана возможность переноса возбудителя мухами Musca domestica и Stomoxys calcitrans [Tien-Xei Cheng, 1967; G.W.Pugh, 1968; К.Эльце и соавт., 1977; Я.Н.Караджов, 1979]. По наблюдениям многих авторов наиболее уязвимы к болезни молодые и с непигментированной кожей вокруг глаз животные шортгорнской, голштинфризской и герефордской пород [E.M.Baldwin, 1945; J.B.Henson et al., 1960; J.A.Sykes et al., 1964; М.В.Плахотин, 1966; К.А.Дорофеев, 1973; Р.Дженсен и соавт., 1977; В.Н.Авроров и соавт., 1985].
Заболевание обычно возникает весной, достигает максимальной интенсивности в начале лета и несколько уменьшается к осени [P.Baptista, 1979]. Его частота наиболее высока среди крупного рогатого скота на откормочных площадках и пастбищах, охватывая 60-90% животных [Р.Дженсен и соавт., 1977; Т.Е.Какоулин, 1982; RThalmann, 1984; T.Barth et al., 1986; G.Kehnscherper, 1987; В.А.Черванев, 1998].Часто инфекционный процесс продолжается и осенью, а отдельные случаи могут быть и зимой, что обусловлено снижением резистентности организма, нарушением зоогигиенических условий содержания животных [М.В.Плахотин и соавт., 1971; G.W.Pugh et al, 1972; В.АЛерванев и соавт., 1995].
Установлено, что молодые животные, переболевшие острой и хронической формами ИКК, были резистентны к повторному заражению в старшем возрас/ге [E.M.Baldwin, 1945; R.D.Barner, 1952; D.E.Hughes et al, 1968; G.E.Wilcox, 1968; H.S.Bryan et al., 1973; К.Эльце и соавт., 1977; P.Baptista, 1979]. Следовательно, у переболевших животных формируется иммунитет, который предотвращает реинфекции или обусловливает, по меньшей мере, легкую форму болезни.
Говоря о патогенезе болезни, следует отметить, что инфекционный агент проникает через эпителий конъюнктивы и вызывает серозно-катаральный воспалительный процесс, который быстро переходит на поверхность роговицы. Нарушение целостности эпителиальных клеток создает условие для вторичной инфекции, вызванной гноеродными и другими микроорганизмами [Я.Н.Караджов, 1979; G.Kehnscherper, 1987].
Инкубационный период длится от 3 до 10 дней [Р.Дженсен и соавт., 1977; и др.], а по утверждению Караджова Я.Н. - от 2-х дней до 3 недель и зависит от сезона года и внешней температуры. Инфекция затрагивает один или оба глаза животного. Вначале появляется легкое покраснение конъюнктивы, слезотечение и начало изъязвления роговицы. В случае тяжелого течения конъюнктива сильно гаперемирована, веки отекшие, местная температура повышена, появляется светобоязнь. Затем процесс переходит на роговицу. При этом наблюдается инфильтрация, инъецирование кровеносных сосудов роговицы, нарушение целостности и потеря блеска последней, которая в результате васкуляризации мутнеет. Зрение ухудшается или совсем теряется. Появляется абсцесс и поверхностная язва. В следующей стадии болезни могут наступить и более выраженные деструктивные процессы: язва на глазном яблоке и его перфорация.
Характеристика и биологические свойства основного возбудителя инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота - бактерий Moraxella bovis
Представители данного рода - палочковидные или кокковидные бактерии. Палочки часто очень короткие и толстые, приближающиеся по форме к коккам (1,0-1,5 х 1,5-2,5 мкм), располагаются обычно парами и короткими цепочками (деление происходит в одной плоскости). В культурах часто наблюдается изменчивость по признакам размеров и формы клеток, а также образование нитей или длинных цепочек; полиморфизм усиливается в отсутствие кислорода и при температуре выше оптимальной [М.А.Сидоров и соавт., 1995].
Кокки обычно более мелкие (диаметром 0,6-1,0 мкм) и расположены одиночно или парами, где соприкасающиеся стороны клеток уплощены (разные плоскости деления); деление происходит в двух взаимоперпендикулярных плоскостях, иногда с образованием тетрад [I.G.Holt et al., 1997].
Клетки бактерий могут быть окружены капсулой, грамотрицательные, но часто с более или менее выраженной устойчивостью к обесцвечиванию, жгутики отсутствуют. Как палочковидные, так и кокковидные бактерии могут иметь фимбрии. Способностью к движению путем плавания не обладают, но у некоторых видов палочковидных бактерий описано движение рывками по твердой поверхности.
Ростовые потребности и питательные среды для культивирования Для культивирования представителей этого рода используют общепринятые питательные среды (МПА, МПБ, бульон и агар Хоттингера), обогащенные кровью, сывороткой крови или специальные, но конкретные ростовые потребности до конца не изучены. Оптимальная температура для роста 33-35С. Свежевыделенные штаммы бактерий Moraxella bovis на кровяном агаре (с кровью крупного рогатого скота или лошади) через 48 часов формируют как выпуклые, так и плоские колонии диаметром до 1 мм, часто врастающие в агар и окруженные отчетливой зоной гемолиза. На шоколадном агаре зона гемолиза окрашивается в темный цвет. Штаммы, выделенные от лошадей, проявляют гемолитические свойства только на шоколадном агаре [М.А.Сидоров и соавт., 1995].
Биологические свойства культур бактерий Moraxella bovis Большинство видов бактерии рода Moraxella - аэробы, но отдельные штаммы могут давать слабый рост в анаэробных условиях; обычно каталазоположительные; на средах с углеводами кислоту не продуцируют (табл. 1). Они относятся к группе неферментирующих грамотрицательных бактерий (НГОБ), представители которой утилизируют сахара и спирты путем окисления, реже - щелочения [М.А.Сидоров и соавт., 1995]. Бактерии Moraxella bovis - паразитические организмы, встречающиеся на слизистых оболочках у человека и пойкилотермных животных. Все их виды чувствительны к пенициллину.
Лабораторные методы диагностики ИКК крупного рогатого скота, вызываемого бактериями Moraxella bovis Диагноз на ИКК крупного рогатого скота устанавливают по результатам бактериологических исследований клинического и патологического материалов, биохимического анализа выделяемых культур бактерий и определение антигенного родства по отношению к представителям бактерий подрода Moraxella в иммунологических реакциях.
Антитела, специфичные для бактерий Moraxella bovis и представленные иммуноглобулинами класса А и G, обнаруживают в сыворотке крови или слезной жидкости крупного рогатого скота с помощью метода ИФА, применяя в качестве антигена экстракт культур бактерий Moraxella bovis.
Установлено, что количество обнаруживаемых антител зависит от способа приготовления антигена, используемого в ИФА. Данный метод выявляет, что два подкожных введения антигена вызывают возрастание титров антител (Р 0,0001) в сыворотке крови. Инфицирование телят бактериями М. bovis приводит к образованию иммуноглобулинов класса IgG и IgA в сыворотке крови с преобладанием IgA в слезной жидкости [B.Bishop et al., 1982].
Проведение реакции агглютинации (РА) усложнено из-за способности многих штаммов бактерий Moraxella bovis к аутоагтлютинации.
Применение реакции иммуноэлектрофореза не достаточно надежно для количественного определения антител к бактериям Moraxella bovis.
При постановке РДП по изменению в агаровом геле судят о наличии антител к бактериям Moraxella bovis в сыворотке крови крупного рогатого скота, больного инфекционным кератоконъюнктивитом. Тест также используют для определения последующих изменений титров антител в сыворотке крови крупного рогатого скота, привитого вакциной на основе штаммов бактерий Moraxella bovis. Выделенные у скота культуры бактерий Moraxella bovis используют в тесте для их идентификации [G.W.Pugh et al., 1971]. Некоторые авторы утверждают, что РДП может быть использован для серологической диагностики ИКК и изучения антигенных свойств бактерий Moraxella bovis, но подобные исследования нуждаются в проведении более достоверных тестов для количественного подсчета [G.W.Pugh. et al., 1971; A.K.Arora, 1980].
Анализ эпизоотической ситуации по ИКК крупного рогатого скота в хозяйствах региона Среднего Поволжья
Патологический материал Бактериологическим, гельминтологическим и патоморфологическим исследованиям подвергались: - 320 проб смывов из конъюнктивального мешка глаз; - 52 пробы сывороток крови телят 1-6-месячного возраста, взятых в период наиболее остро выраженных симптомов заболевания; - 66 проб сывороток крови кроликов; 80 проб сывороток крови белых мышей; - 12 проб сывороток крови морских свинок; - патологический материал: кусочки сердца, легких, почек, печени, селезенки, поджелудочной железы, лимфатических узлов, конъюнктивы глаз, участки скелетной мышцы морских свинок, экспериментально зараженных культурами бактерий Moraxella bovis.
Оборудование, материалы и реактивы Для проведения опытов использовали следующие инструменты и оборудование: автоклав ВК-75; баня водяная по ТУ 64-2-278-79; весы аналитические ВЛА по ГОСТ 24104; - иономер универсальный ЭВ-74; - одно- и многоканальные микропипетки НПО «Биоприбор»; - осветитель ОЙ-19; пипетки мерные вместимостью 1,2, 5 и 10 см3 по ГОСТ 29230-91; посуда лабораторная стеклянная по ГОСТ 35336-82Е; — полистироловые планшеты «Медтехника» по ТУ 64-2-278; световой микроскоп МБИ-3; - спектрофотометр СФ-46; - считывающее устройство Tutertek Multiskan; термостат ТВ-400; шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80; - холодильник бытовой Ока-6-М-206-1 (+4); центрифуга лабораторная РС-6 по ГОСТ 28705; чашки Петри по ГОСТ 25336; - бьиий (лошадиный) сывороточный альбумин 1%-ый (БСА/ЛСА); карбонатно-бикарбонатный буфер 0,0 ЇМ (КББ); кислота серная по ГОСТ 4204-77; конъюгат иммунопероксидазный против иммуноглобулинов кролика (быка, мыши, морской свинки); натрий хлористый по ГОСТ 4233-77; спирт этилсшьшрекшфицированньш по ГОСТ 18300-87; - сыворотка крови крупного рогатого скота по ТУ 46-21-916-73.
Бактериальные среды При выделении культур микроорганизмов из клинического материала и изучении их биологических свойств были использованы: мясопептонный агар (МПА) с добавлением 5-10% дефибринированной крови барана; мясопептонный бульон (МПБ) с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота; триптон-соевый агар (ТСА); триптон-соевый бульон (ТСБ); полужидкий мясопептонный агар (ПМПА); картофельный агар; 12% мясопептонная желатина (МІЖ); лакмусовое молоко; нитратная среда; среды Гисса с содержанием 1% сахарозы, глюкозы, лактозы и маннита; синтетическая среда 199; культура перевиваемых клеток трахеи эмбриона коровы (линия TR).
Штаммы культур бактерий Moraxella bovis Идентификацию выделенных культур микроорганизмов проводили путем определения их физико-химических, морфологических, тинкториалывдх, и других биологических свойств относительно референтных культур штаммов бактерий М. bovis, полученных из Американской национальной коллекции штаммов микроорганизмов: АТСС 17947, 17948, 10900, в соответствии «Краткого определителя бактерий Bergeys» (1948) и «Определителя зоопатогенных микроорганизмов» [М.А.Сидоров и соавт., 1995].
Методы лабораторной диагностики 2.1.7.1. Отбор проб клинического и патологического материалов Взятие проб слезной жидкости из пораженных глаз животных производили путем введения сухого стерильного ватного тампона в конъюнктивальный мешок. Тампоны вращательным движением проводили по конъюнктиве мешка и роговицы, а затем помещали во флакон со стерильной средой 199. Из хозяйств полученные пробы перевозили в лабораторию в термосе со льдом, поддерживающем температуру не выше 6-10С.
Клинико-эпизоотологические особенности проявления ИКК крупного рогатого скота в хозяйствах региона Среднего Поволжья и Предуралья
После 18-24-часовой инкубации в аэробных условиях при температуре 35-37С на поверхности кровяного агара образовывались рассеянные колонии диаметром от 1,0 до 1,5 мм с шириной зоны бета-гемолиза 0,5-1,0 мм (рис. 12). Колонии не имели склонности к слиянию, если только они не .были расположены близко друг к другу. Они были круглые, блестящие, напоминающие каплю росы, полупрозрачные, серовато-белого цвета, выпуклые в центре в виде бугорка, слегка вросшие в агаровую среду; на вид прочные, но разрывались при касании их бактериологической петлей. При переносе колонии на ее месте оставалось небольшое углубление, обусловленное разжижением среды.
В последующие 48-часов инкубации при 37С колонии составляли 2-4 мм в диаметре. Зона гемолиза при этом увеличивалась в 2 раза, затем еще вдвое в течение следующих 24-х часов инкубации при температуре 25С. При старении колонии сливались, нарастали друг на друга, и в центре формировалось небольшое возвышение, но края оставались ровными.
Во всех случаях при первичном выделении возбудителя ИКК от животных с острой формой заболевания колонии были такие, как описано выше, их можно отнести к гладкому типу. Но при последующих субкультивированиях, после 4-5-ти пассажей на искусственных питательных средах, наблюдали уменьшение колоний в диаметре до 0,5-0,8 мм («карликовые колонии»). Спонтанная диссоциация происходила даже при оптимальных условиях инкубирования. Эти колонии также были выпуклыми, с гладкой блестящей поверхностью. При дальнейшем субкультивировании стали встречаться и колонии шероховатого типа с гладкой поверхностью, «промежуточные», а затем - чисто шероховатый вариант. Такой порядок диссоциации был непостоянным, часто происходила трансформация разных типов колоний в гладкие. Размеры шероховатого варианта колебались в пределах от 1 до 3 мм, наблюдалась большая тенденция к слиянию колоний. На вид они были сухие, неблестящие, полупрозрачные, серовато-белого цвета, неправильные по форме, края волнистые, поверхность крупнозернистая, более плотные в центре; теряя приподнятость, становились плоскими. Зона гемолиза, окружающая шероховатые колонии, после длительной инкубации не увеличивалась. Консистенция этих колоний становилась мягкой и вязкой и после переноса их бактериальной петлей не оставляли углублений на средах. Они были более резистентны к старению.
По морфологическим признакам бактериальные клетки колоний шероховатого типа сходны с таковыми колоний гладкого типа, но для первых характерно выстраивание их в длинные цепи. Капсул у бактерий шероховатого типа колоний обнаружено не было, спонтанная агглютинация не происходила, бактериальная масса образовывала однородную суспензию в нормальном солевом растворе. Попытки сохранить вариант шероховатого типа колоний были безуспешными: после нескольких пассажей на искусственных питательных средах они превращались в колонии гладкого типа. Шероховатые типы колоний бактерий выделялись из слезной жидкости животных со старыми хроническими случаями заболевания, но никогда не удавалось получить их от клинически больных и животных-носителей этого возбудителя.
При культивировании эпизоотических штаммов бактерий на триптон-соевом агаре морфологические характеристики колоний всех изученных микроорганизмов были сходны с характеристиками колоний, полученных на мясопептонном агаре. После 48-72-часовой инкубации при 37С в МПБ и ТСБ все штаммы бактерий дали скудный рост; было отмечено незначительное помутнение бульона и образование небольшого осадка в виде «пугойки», который при взбалтывании распадался на крупные частицы. Рост в дальнейшем усиливался при добавлении в 5% объеме сыворотки крови крупного рогатого скота.
После 24-часового культивирования выделенных бактерий на кровяном агаре с экстрактом картофеля культуры на поверхности среды образовывали колонии неправильной формы сероватого цвета.
