Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Краткая историческая справка 11
1.2. Таксономия кампилобактерий 13
1.3. Морфологические свойства кампилобактерий 14
1.4. Культуральные свойства кампилобактерий 15
1.5. Дифференциально-диагностические признаки кампилобактерий... 19
1.6. Антигенная структура кампилобактерий 21
1.7. Факторы вирулентности кампилобактерий 22
1.8. Эпизоотология кампилобактериоза 26
1.9. Эпидемиология кампилобактериоза 33
1.10. Устойчивость кампилобактеров 38
1.11. Лабораторная диагностика кампилобактериоза 38
2. Собственные исследования 49
2.1. Материалы и методы 49
2.1.1. Штаммы кампилобактерий 49
2.1.2. Питательные среды 49
2.1.3. Антибиотики 50
2.1.4. Газовые пакеты 50
2.1.5. Тест — системы для изучения биохимических свойств кампилобактерий и реактивы 51
2.1.6. Методы выделения, изучения и идентификации штаммов возбудителя кишечного кампилобактериоза 52
2.1.7. Обследование хозяйств и материал для исследования 60
2.1.8. Изучение контаминации С. jejuni и С. coli желудочно-кишечного тракта клинически здоровых кур и кур, направленных на санитарный убой 61
2.1.9. Изучение контаминации С. jejuni и С. coli тушек птицы в процессе переработки 62
2.1.10. ПЦР - анализ С. jejuni в продуктах убоя кур 63
2.2. Результаты исследования и их обсуждение 68
2.2.1. Исследование желудочно-кишечного тракта кур с птицефабрик и племенных птицеводческих заводов Саратовской области на наличие С jejuni и C.coli 68
2.2.2. Определение контаминации С. jejuni и С. coli тушек птицы в процессе переработки 78
2.2.3. Использование ПЦР для обнаружения С. jejuni в мясе и субпродуктах птицы 81
Заключение 88
Выводы 94
Список использованных литературных источников 95
- Краткая историческая справка
- Таксономия кампилобактерий
- Штаммы кампилобактерий
- Методы выделения, изучения и идентификации штаммов возбудителя кишечного кампилобактериоза
Введение к работе
Актуальность работы
Острые кишечные инфекции широко распространены во многих странах мира и представляют серьезную опасность для современного общества. По оценке ВОЗ ОКИ уносят ежегодно 3 миллиона жизней людей. В России экономические потери от кишечных инфекций, куда включаются и пищевые, исчисляются 51 миллиардом рублей (Светоч и др., 2007).
Важное место среди ОКИ занимает кампилобактериоз ввиду его широкой распространенности, множественности резервуаров, постоянной тенденции к росту заболеваемости и наносимого им значительного социально-экономического ущерба. Микроорганизмы рода Campylobacter в качестве этиологического фактора ОКИ встречаются чаще, чем сальмонеллы, шигеллы и ротавирусы. По данным ВОЗ, в зависимости от географического положения региона и сезонности, кампилобактеры вызывают от 3 до 73 % ОКИ (Сафонова и др., 1988; Сичинский, 1991; Иванов, Бойцов, Порин, 1995; Кирик, 1995; Черкасский, Подунова, Акулова, 1995; Friedman et al., 2001).
Значимость проблемы распространения кампилобактериоза подтверждает тот факт, что ВОЗ включила эту инфекцию в национальную программу по борьбе с инфекционными заболеваниями в 108 странах мира, в том числе и в России (Клево, 2006).
Кампилобактериоз подлежит обязательной регистрации в США, Великобритании, Франции, Германии и во многих других европейских странах (Блюстад, Блад, Гисеке, 2005). В России диагностика кампилобактериоза проводится редко, что свидетельствует об отсутствии четкой информации о распространенности этого заболевания в РФ.
В нашей стране официальная регистрация кампилобактериоза введена с 1992 года, и с этого времени проводиться эпидемиологический надзор, а с
1999 года формируется система наблюдения за инфекцией (Новости об инфекциях. . II (Рус). URL: [31 Марта 2004]). За вышеуказанный период в Санкт-Петербурге зарегистрировано 2536 случаев кампилобактериоза, что составляет почти 60 % от отмеченных по Российской Федерации. Соответственно показатели заболеваемости за все годы превышают средние республиканские в 15-20 раз.
Опасность заключается в том, что основную группу больных
составляли дети от 14 до 16 лет - 75,4 %, так как частота их обследования и
высеваемость в этой группе выше, чем среди взрослых. В возрастной
структуре наибольший удельный вес составляют дети первых 3 лет жизни
- 29 % и с 3 до 6 лет - 26 % (Новости об инфекциях. pasteur-
. II (Рус-). URL: -
[31 Марта 2004]).
Основным естественным резервуаром бактерий рода Campylobacter является промышленная птица, в первую очередь бройлерная, и животные (Светоч и др., 2007).
Контаминация бактериями рода Campylobacter бройлерной птицы может достигать 100 %, а послеубойная обработка ее не всегда предотвращает попадание указанных бактерий на тушки птицы (Жакипбаева, 1992; Болохович и др., 1995;Wallace, Stanley, 1998).
Кроме этого кампилобактериоз наносит существенный экономический ущерб птицеводству за счет снижения яйценоскости, живой массы, падежа птицы и затрат на ликвидационные мероприятия (Кирьянов, 1992).
Актуальность проблемы связана с тем, что при употреблении в пищу недостаточно термически обработанного мяса птицы, появляется риск возникновения кампилобактериоза у людей.
Бессимптомное течение инфекции и опасность реализации населению контаминированных продуктов убоя кур, резко увеличивает их роль в распространении кампилобактериоза среди потребителей. (Свирина, 1992; Новикова, 2001).
Эпидемиологическая опасность мяса возрастает в связи с тем, что бактерии рода Campylobacter высококонтагиозны, что позволяет рассматривать их как возможный этиологический фактор профессионального заболевания у работников птицеводства (Blaser et al., 1986; Tee et al., 1987; Кирьянов, 1992).
В нашей работе, мы исследовали материал из птицефабрик и птицеводческих хозяйств Саратовской области, на наличие С. jejuni и C.coli, так как в большинстве случаев именно эти виды вызывают ОКИ животных и птиц.
Сведений о распространенности кампилобактериоза среди птиц в районах Саратовской области в литературе отсутствовали, до настоящего времени, поскольку бактериологические исследования на кампилобактериоз не проводились. Такое положение и определяет актуальность исследования материалов из птицефабрик и птицеводческих хозяйств, а также продуктов убоя кур на наличие возбудителя кампилобактериоза.
Цель работы - изучение распространения и идентификации бактерий рода Campylobacter на птицефабриках и птицеводческих хозяйствах Саратовской области, а также выявление кампилобактеров в продуктах убоя птицы.
Задачи исследования:
Провести сравнительный анализ по содержанию кампилобактеров в содержимом желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и в смывах с тушек здоровой птицы и больной, направленной на санитарный убой на птицефабриках и в птицеводческих хозяйствах Саратовской области.
Определить видовой состав выделенных кампилобактеров и изучить их биологические свойства.
Оценить влияние условий обработки тушек птицы на степень их бактериальной контаминации перед упаковкой.
Провести выявление С. jejuni в мясе и субпродуктах кур, реализуемых в торговой сети города Саратова, с использованием полимеразной цепной реакции (ГТЦР); сравнить эффективность бактериологического метода диагностики кампилобактеров и метода ГТЦР.
8
5. Разработать рациональную схему бактериологического
исследования продуктов убоя птиц для выявления и идентификации бактерий рода Campylobacter.
Научная новизна
Впервые установлен факт обнаружения бактерий рода Campylobacter в продуктах убоя кур на птицефабриках и птицеводческих хозяйствах Саратовской области; подтверждена роль мяса и продуктов убоя птицы, как источника передачи кишечного кампилобактериоза при несоблюдении санитарно-гигиенических требований.
Впервые показано, что С. jejuni и С. coli сохраняются в продуктах убоя птицы, в том числе, в желудках и печени кур, поступающих в сети розничной торговли, а также присутствуют в смывах с тушек, как больной, так и здоровой птицы.
Основными видами, выделенными при кампилобактериозе у птиц, явились С jejuni и С. coli; были изучены их биологические свойства.
Установлено, что ПНР является эффективным методом индикации С jejuni в продуктах убоя птицы и по чувствительности, и времени постановки анализа существенно превосходит общепринятый бактериологический метод.
Практическая значимость работы
Полученные данные расширяют представление о распространении бактерий рода Campylobacter в продуктах убоя птицы птицефабрик и племрепродукторов Саратовской области, открывая новые возможности для научно-обоснованного подхода к применению современных методов диагностики.
Для выявления и идентификации бактерий рода Campylobacter была разработана рациональная схему бактериологического исследования продуктов убоя птиц.
По результатам исследований опубликованы «Методические
рекомендации по выделению кампилобактеров из продуктов убоя птицы и их дифференциация», предназначенные для проведения практических занятий студентов старших курсов, а также для работы аспирантов и научных
9 работников, специализирующихся в области ветеринарной микробиологии, рекомендованные Учебно-методической комиссией и одобренные Ученым советом ветеринарного факультета Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова (протокол № 4 от 26 октября 2007 г.)
Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии, факультета ветеринарной медицины и на кафедре технологии мяса и мясопродуктов факультета технологии продуктов питания ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова».
Основные положения, выносимые на защиту
На птицефабриках и птицеводческих хозяйствах Саратовской области впервые выделены бактерии рода Campylobacter, в материале от птиц и продуктах ее убоя, которые сохраняются в процессе переработки.
Для индикации С. jejuni в материале от птиц и продуктах ее убоя использовали метод ПЦР.
Разработан доступный для практических исследований метод бактериологического анализа и идентификации С. jejuni и С. coli в материале от птиц и продуктах ее убоя.
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии факультета ветеринарной медицины ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова», в рамках ассоциации «Аграрное образование и наука» за 2007 — 2008 гг.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на:
Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова», посвященной 119 годовщине со дня рождения академика Н.И. Вавилова (2006 г.);
Всероссийской научно - практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и животноводства» (2007 г.);
Международной научно - практической конференции «Технология и продукты здорового питания» (2007 г.);
Международной научно - практической конференции «Актуальные проблемы производства продукции животноводства» (2007 г.);
Научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по итогам научно - исследовательской работы за 2007 -2008 гг. (2008 г.);
Четвертой международной конференции, посвященной 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ имени Пастера и 120-летию Парижского института Пастера (2008 г.);
Всероссийской научно - практической конференции, посвященной памяти профессора кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова», профессора, доктора медицинских наук Зыкина Леонида Федоровича «Актуальные проблемы ветеринарной патологии сельскохозяйственных животных и птиц» (Саратов, 2008);
II Международной научно - практической конференции «Технология и продукты здорового питания» (Саратов, 2008);
Публикации
По материалам диссертации опубликованы 12 работ, из них одна статья в журнале, входящем в перечень ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка использованных литературных источников и приложения. Материалы диссертации изложены на 109 страницах машинописного текста, иллюстрированы 11 таблицами и 9 рисунками. Список использованных литературных источников включает 145 наименований, в том числе 82 зарубежных.
Краткая историческая справка
Впервые возбудителя кампилобактериоза выделили в Англии в 1909 году из патологического материала от абортировавшей овцы, ив 1913 году — от абортировавшей коровы (McFadien, Ctockman, 1913; Шумилов и др., 1999).
Позже бактерии, имеющие сходные характеристики, выявили в плодных оболочках и плодах абортировавших коров, назвав их Vibrio fetus (по новой систематике Campylobacter fetus), а болезнь - вибриозом. (Smith, Taylor, 1919). Позже кампилобактерии выделили у большого количества видов больных животных с разнообразными формами проявления инфекции.
Поводом назвать Vibrio jejuni (по новой систематике Campylobacter jejuni) (jejuni лат. - тощая кишка) стало наблюдение F.S. Jones и R.M. Little в 1931 году острого контагиозного энтерита у КРС, возбудителем которого был Vibrio jejuni (Jones, Oreutt, Little, 1931). Этиологическую роль С. jejuni в возникновении дизентерии КРС подтвердили D.J. Taylor и R.R. Al-Mashat в 1980 году (Al-Mashat, Taylor, 1980) и B.D. Firehammer и L.L. Myers в 1981 году (Firehammer, Myers, 1981). С. jejuni вызывает у животных тяжелые формы энтеритов, особенно опасные для молодняка в возрасте до 10 дней (Бондаренко, Велик, 1988).
Первые сведения о возбудителе кампилобактериоза у коров в нашей стране принадлежат В.А. Якимову (1926), он обнаружил их в мазках из тканей плода коровы, павшей от пироплазмоза. В 1929 году В.П. Тавельский (1929) выделил культуру кампилобактерии из абортированного плода овцы, описал течение и клиническое проявление кампилобактериоза овец. Большой вклад в изучение данной проблемы внесли Е.В. Козловский, П.А. Трилевко, П.А. Волосков, Н.Н. Михайлов, М.А. Лучко, А.В. Голиков и др. (Кирьянов, 1992).
Считалось, что аборты у овец вызывает только С. fetus, но R.M. Smibert впервые от овец выделил С. jejuni (Smibert, 1965). В Австралии B.I. Clark и M.J. Monsburgh из желчных пузырей4 овец выделяли С. jejuni чаще, чем С fetus, но аборты у овец чаще вызывали С. fetus (Clark, Monsburgh, Dufly, 1969).
О кишечной форме кампилобактериоза у свиней впервые сообщал L.P. Doyl в 1944 году, выделив микроаэрофильных кампилобактерий из слизистой оболочки кишечника животных с клиникой дизентерии. Максимальное количество этих бактерий содержалось в слепой и ободочной кишках, где возбудитель располагался группами и одиночно как в просвете кишечника, так и в толще слизистой оболочки. Встречались кампилобактерий также внутри эпителиальных и бокаловидных клеток. Ж.М. Иоргенсеном (1979) (цитата по Зенину, 1986). При проведении бактериологического исследования кишечника свиней в 72 % случаев были выделены бактерии вида С. jejuni. На основании чего автор считает, что свиньи являются резервуаром данного вида и могут быть источником этой инфекции для человека.
Основываясь на выделении кампилобактерий из печени больных кур, у которых болезнь протекала в подострой или хронической формах и характеризовалась воспалением слизистой кишечника и образованием в печени некротических очагов, M.S. Hofstad (1956) ассоциировал кампилобактериоз с гепатитом домашней птицы.
В дальнейшем кампилобактеры были выделены и из других источников: кишечника свиней, кишечника ягнят при энтерите, помета кур, уток и индеек, фекалий собак и кошек, от диких животных и птиц, из прибрежной морской воды и загрязненных продуктов питания животного происхождения.
Долгое время считалось, что кампилобактериоз поражает исключительно животных, но в 1913 году Кэртис впервые выделил подвижные, изогнутые анаэробные палочковидные микроорганизмы из маточных выделений у пациентки после искусственного аборта и у пациентки после родов.
Ж. Леви (1946), описал вспышку энтерита у людей, вызванную микроаэрофильными изогнутыми палочками. В 31 из числа 73 исследованных проб кала он обнаруживал кампилоподобные микроорганизмы, которые ему не удалось окончательно идентифицировать. Источником инфекции являлось сырое молоко (цитата по Зенину, 1986).
М.В. Skirrow в 1982 году впервые доказал, что кампилобактерии вида С. jejuni и С.соН могут быть причиной острых энтеритов у людей, при этом наибольшую роль в поражении ЖКТ имеет С. jejuni.
Выявление в последующие годы многочисленных случаев заражения человека кампилобактериозом сделало это заболевание актуальным зоонозом (Karmali, Allen, Fleming, 1981).
Самые крупные вспышки кампилобактериозных энтеритов у людей отмечались при употреблении: не пастеризованного молока (Robinson et al. 1981); сырых моллюсков (Iton et al., 1982); сырой воды, плохо проваренного или прожаренного мяса птицы (Svedham, Sjogren, 1981; Skirrow, 1981); контаминированных фруктов, овощных соков, винегрета (Чайка, Хазенсон, Бутцлер, 1983).
Таксономия кампилобактерий
По мере поступления новых данных о свойствах кампилобактеров, токсономия рода Vibrio стала кардинально меняться (King, 1962; Smibert, 1978). По предложению М. Sebald и М. Veron (1963) микроаэрофильные вибрионы были выделены в новый род — Campylobacter (campylos греч. -изогнутая палочка), так как они имеют ряд отличительных особенностей.
В соответствии с систематикой Bergey s (1997) род Campylobacter входит в семейство Spirillaceae. Род Campylobacter включен в группу №2, объединяющую аэробные (микроаэрофильные, спиральные, подвижные) грамотрицательные бактерии. (Определитель бактерий Берджи, Д. Хоулт, (ред.), 1997) и представлен 15 видами бактерий: С. cinaedi, С. coli, С. concisus, C.cryaerophila, С. fennelie, С. fetus, С. hyointestinales, С. jejuni, С. lari, C.mucosalis, С. nitrqfigillis,C. sputorum, С. upsaliens и добавочно включенными в этот род видами Wolinella curva и Wolinella succinogenes. Некоторые виды объединяют в себе подвиды и биовары. Так, вид С. fetus объединяет подвиды fetus и venerealis; вид С. jejuni - подвиды jejuni и doylei; вид С. sputorum -биовары .spwtorwm, bubulus и fecalis. Типовой вид С. fetus.
Кампилобактерии — это тонкие, спирально изогнутые, не образующие спор и капсул, грамотрицательные палочки с одним (подвиды fetus, venerealis, fecalis и sputorum), двумя (виды coli, lari и jejuni) или 4-5 {pyloridis) полярно расположенными жгутиками. Форма бактерий спиральная с одним или несколькими завитками, изогнутые в виде запятой, серпа, латинской буквы Sv, «крыла чайки» (Триленко, 1956; Каравайчик, 2001; Васильев, Золотухин, Никишина, 2006). С увеличением числа пассажей на средах, количество завитков увеличивается.
Измерения, произведенные с помощью электронных фотографий, показали, колебания величины- отдельных клеток кампилобактеров: ширина 0,25-0,5 мкм, длина 0,9-3,0 мкм, длина жгутиков 1,4-3,6 мкм (Rhodes, 1954; Чайка, Рыбальченко, 1988). При культивировании более 48-72часов образуют кокковидные формы (С. jejuni) и спирилловидные формы {С.venerealis) (Karmali, Allen, Fleming, 1981). Кампилобактеры обладают характерным «винтообразным движением».
Клеточная стенка бактерий состоит из трехслойной внешней мембраны, прилегающего к ней периплазматического пространства, содержащего тонкий .пептидогликановый слой, и трехслойной цитоплазматической мембраны. Вдоль клеточной стенки расположена широкая плотная полоса, содержащая плотно упакованные частицы рибосом. В центральной части клеток лежит электронно-прозрачная зона нуклеоида, заполненная сетью тонкофибриллярных нитей ДНК (Сафонова и соавт., 1988). В клеточной стенке содержатся только галактоза и глюкоза или галактоза, глюкоза и манноза. Клеточный липид содержит циклопропановую С-19:0 жирную кислоту. Кроме того, клеточный липид содержит С-14:0, С-6:0, С-16-1 и С-18 - 1 жирные кислоты. (Шманов, Иренков, 1984; Голиков, Зенин, 1987; Hanninen, Ercoan, Valtonen, 1988).
Длительное время кампилобактеры считали некультивируемыми. Культивировать in vitro их удалось сравнительно недавно: в 1977 г английским микробиологом Скирроу был с успехом использован кровяной агар с антибиотиками для изоляции и репродукции С. jejuni, что стало новым этапом в изучении биологических свойств кампилобактеров и обеспечило открытие новых их видов (Ниманд, Сутер, 1998).
Культуральные свойства кампилобактеров обусловлены их отношением к кислороду воздуха. Патогенные для человека виды являются капнофилами (необходимая концентрация ССЬ 10-15 %) и микроаэрофилами (необходимая концентрация СЬ 3-15 %). Некоторые другие виды кампилобактеров могут также расти и в аэробных условиях (21 % 02), другие, например С. fetus subsp. fetus, способны к росту в анаэробных условиях (Васильев, Золотухин, Никишина, 2006). Поэтому оптимальный состав газовой среды содержит 5 % кислорода, 10 % углекислого газа и 85 % азота.
Штаммы кампилобактерий
Жидкие среды - тиогликолевый бульон и бульон с сердечно - мозговой вытяжкой (М 210). Коммерческий тиогликолевый бульон (питательная среда для контроля стерильности сухая) производства ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова, Московская обл., Красногорский район, село Петрово - дальнее.
Тиогликолевый бульон использовался в качестве транспортной среды, в соответствии с инструкцией по клинической и лабораторной диагностике кампилобактериоза (Черкасский и др., 1989). По сравнению с другими транспортными средами, используемыми для выделения кампилобактеров, такими как 0,1 % пептонная вода и физиологический раствор хлористого натрия, тиогликолевый бульон обладает более длительным сроком хранения исследуемого материала (при комнатной температуре до 3 суток, при + 4 С до 7 суток).
Бульон с сердечно - мозговой вытяжкой (Brain Heart Infusion Broth — M210) производства HiMedia Laboratories Pvt. Ltd. Mumbai - 400086, India. Бульон применялся нами в биохимическом тесте с дисками с гиппуратом натрия (DD035), для определения С. jejuni и для определения подвижности бактерий.
Плотная среда - основа агара для бруцелл (Brucella Agar Base (без добавок) М074 - 500G) производства HiMedia Laboratories Pvt. Ltd. Mumbai -400086, India. Агар использовали для приготовления селективной среды с антибиотиками и с добавлением дефибринированной крови барана, а также без антибиотиков для выделения чистых культур и хранения выделенных штаммов.
Стерильную кровь барана дефибринируют и добавляют в количестве 5-7 % в среду (остуженную до 50 С), перед внесением в чашки Петри.
Для приготовления селективной среды с агаром для бруцелл пользовались методическими рекомендациями «Этиология, клиника и диагностика кампилобактериоза» (Сафонова и др., 1989).
Кроме этого из агара для бруцелл готовили ГОКА для определения подвижности методом «укола». Для выделения кампилобактеров использовали смесь отечественных антибиотиков: 1. Фузидин-2 мг, 2. Рифампицин - 10 мг, 3. Амфотерицин В - 2 мг.
Необходимые количества антибиотиков взвешивали на аналитических весах. Рифампицин растворяли в 0,05 мл диметилсульфоксида, остальные антибиотики — в 2 мл стерильной дистиллированной воды. Эти растворы вносили віл среды перед внесением в чашки Петри.
Для выращивания бактерий рода Campylobacter в микроаэрофильных условиях применяли следующие газовые пакеты:
1. Anaerogas CampyloPack 3,5 L (LE002D), производства HiMedia Laboratories Pvt. Ltd. Mumbai - 400086, India.
2. BBL 43-71045 CampyPakPlus and GasPak are trademarks of Beston Dickinson and Company, USA.
Для развернутого изучения биохимических свойств кампилобактер применяли:
1. ОКСИтест (MIKRO-LAEST OXItest) - индивидуальный тест для обнаружения бактериальной цитохромоксидазы, производства PLIVA -Lachema Diagnostika s.r.o., Brno, CZ.
2. ГИППУРАТтест (MIKRO-LAEST HIPPURATEtest) детекционная полоска теста предназначена для определения способности бактериальных штаммов гидролизовать гиппурат натрия, производства PLIVA - Lachema Diagnostika s.r.o., Brno, CZ. Используется для определения С. jejuni.
3. Реактив для ГИППУРАТтеста — реактив для испытания гидролиза гиппурата натрия, производства PLIVA - Lachema Diagnostika s.r.o., Brno, CZ.
4. Диски с гиппуратом натрия (Hippurate Нр DD035) - используются для определения гидролиза гиппурата натрия микроорганизмами, производства HiMedia Laboratories Pvt. Ltd. Mumbai - 400086, India.
5. Тест - система "КАМ-БАК" для диагностики и идентификации возбудителя кампилобактериоза С. jejuni методом ПЦР, на 55 проб. Тест — система предназначена для диагностики и идентификации возбудителя кампилобактериоза С jejuni методом ГГЦР в крови, молоке, фекалиях, сперме, материале от абортированных плодов, плаценте, плодовых оболочках и паренхиматозных органов от абортировавших животных, мясных продуктах и кормах животного происхождения. Тест - система изготовлена ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзор, АмплиСенс, Москва. Одобрено Советом по ветеринарным препаратам 28.09.99 г.
Методы выделения, изучения и идентификации штаммов возбудителя кишечного кампилобактериоза
Проанализировав данные методических рекомендаций «Этиология, клиника и диагностика кампилобактериоза» (Сафонова и др., 1989) и инструкций по клинической и лабораторной диагностике кампилобактериоза (Черкасский и др., 1989), нами была предложена следующая методика выделения, изучения и идентификации штаммов возбудителя кишечного кампилобактериоза. По данной методике составили схему лабораторной диагностики кампилобактериоза (рис. 1).
Исследуемый материал, в условиях бокса, засевали на селективную среду, состоящую из основы агара для бруцелл (HiMedia, India) с добавлением 5 - 7 % стерильной дефибринированной крови барана и смеси антибиотиков: фузидина, рифампицина и амфотерицина В. Высев материала производили методом «истощения». Этот метод удобен для отбора отдельно расположенных колоний, по культурально - морфологическим признакам, сходных с кампилобактерами Наличие в используемой среде антибиотиков позволяет нам наблюдать рост отдельных колоний и предотвращает рост сопутствующей микрофлоры.
После высева исследуемого материала на селективную среду, все чашки Петри складывали в эксикатор. Оптимальный состав газовой среды для выращивания кампилобактеров составляет: 5 % 02, 10 % С02 , 85 % N2. Поэтому для создания микроаэрофильных условий в эксикатор помещали газовый пакет Anaerogas CampyloPack 3,5 L (HiMedia, India) или CampyPakPlus (USA), активированный согласно инструкции.
При отсутствии газовых пакетов, для создания условий, благоприятных для выращивания кампилобактер, пользовались методом «горящей свечи». Кроме этого, для увеличения количества углекислого газа в эксикатор со свечей помещали флакон с 10 мл водопроводной воды и 2 - 3 г кристаллизованной лимонной кислоты.
Эксикатор герметично закрывали и помещали в термостат при 42 С, на 48 - 72 часа. Все данные заносили в термостатный журнал и журнал для опытов.
По прошествии времени эксикатор с чашками Петри вынимали из термостата и проводили осмотр посевов для отбора колоний, по культуральным признакам похожих на кампилобактерии.
Для дальнейшей идентификации необходимы чистые исследуемые культуры, поэтому отобранные с селективной среды колонии, пересевали на среду, состоящую из основы агара для бруцелл (HiMedia, India) с добавлением 5 - 7 % стерильной дефибринированной крови барана.
После отбора колонии пересевали на среды, в чашки Петри и помещали в эксикатор. Для создания микроаэрофильных условий пользовались выше упомянутыми методами. Герметично закрытый эксикатор также помещали в термостат при 42 С, на 48 - 72 часа. Все данные заносили в термостатный журнал и журнал для опытов. Через 72 часа проводили идентификацию выросших на чашках культур.
Для идентификации С. jejuni и С. coli определяли морфологию колоний. При посеве вырастали два типа колоний:
a) колонии первого типа негемолитические, сероватые, плоские, влажные, блестящие, как бы растекающиеся, прозрачные, похожи на капли конденсата водяных паров. При большом количестве кампилобактеров в исследуемом материале наблюдали сплошной рост в виде влажной прозрачной пленки на поверхности питательной среды (рис. 2);
b) колонии второго типа также негемолитические, более плотные и оформленные, чем колонии первого типа, выпуклые, блестящие. Значительные участки поверхности многих колоний покрыты толстым слоем слизи, который прерывается в отдельных местах (рис. 3).
1) Окраска мазков по Граму.
В положительном случае в мазках окрашенных по Граму, обнаруживали грамотрицательные микробные клетки, имеющие форму удлиненных спирилл, мелких кокков, «летящих чаек», запятой, изогнутых палочек (рис. 4).
2) Определяли подвижность бактерий. Изучение подвижности бактерий исследуемых культур проводили следующими способами: по характеру роста в ГОКА;
Исследуемую культуру засевали методом «укола» в ГОКА, приготовленный из основы агара для бруцелл (HiMedia, India). Пробирки с культурой помещали в эксикатор и после создания микроаэрофильных условий, помещали в термостат при 28 С на 48 часов.
По истечению времени в пробирках наблюдали рост в виде «ламповой щеточки», с большим количеством ответвлений в нижней части пробирки и с малым в верхней части. После этого делали заключение, о подвижности исследуемых бактерий, что является характерным признаком кампилобактерий.
