Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Роль анаэробных микробов в патологии человека 11
1.2. Номенклатура и классификация анаэробов 19
1.3. Факторы патогенносте анаэробов 21
ГЛАВА 2. Материалы и методы 30
2.1. Материалы 30
2.2. Методы исследования 32
2.2.1. Методика создания анаэробиоза 32
2.2.2. Подготовка транспортных сред и приспособлений для взятия проб 33
2.2.3.Посев патологического материала, приготовление нативных мазков 34
2.2.4. Видовая идентификация выделенных культур анаэробных микроорганизмов 35
2.2.5. Изучение вирулентности анаэробов 36
2.3.Опре деление чувствительности анаэробов к антибиотикам... 40
2.4. Статистическая обработка результатов исследований 42
ГЛАВА 3. Частота обнаружения анаэробов у больных и здоровых людей 43
3.1. Видовой состав анаэробов у больных и здоровых людей 43
3.2. Патогенетическая роль анаэробных микроорганизмов 54
ГЛАВА 4. Микробиологическая характеристика анаэробов, выделенных от больных и здоровых людей 63
4.1. Изучение морфологических, культуральных и биохимических свойств анаэробов 63
4.1.1. Морфологические свойства 63
4.1.2. Культуральные свойства анаэробов 66
4.1.3. Биохимические свойства анаэробов 69
ГЛАВА 5. Факторы патогенности анаэробов, изолированных от больных при желудочно-кишечных и гнойно-воспалительных заболеваниях 78
5.1. Исследование адгезивных свойств 78
5.2. Персистирующая способность анаэробов при гнойно-воспалительном процессе в организме человека 88
5.3. Гемолитические свойства анаэробов 94
5.4. Распределение изученных штаммов анаэробов по патоварам.. 97
ГЛАВА 6. Изучение чувствительности к антибиотикам штаммов анаэробных микроорганизмов, выделенных при гнойно-воспалительных процессах различной локализации в организме человека 106
6.1. Чувствительность анаэробов к антибиотикам 106
6.2. Тактика лечения острых кишечных и гнойно-воспалительных заболеваний, обусловленных или осложненных анаэробами 116
Заключение 121
Выводы 132
Список использованной литературы 134
- Роль анаэробных микробов в патологии человека
- Изучение вирулентности анаэробов
- Видовой состав анаэробов у больных и здоровых людей
- Персистирующая способность анаэробов при гнойно-воспалительном процессе в организме человека
Введение к работе
Актуальность проблемы
Анаэробная инфекция известна более 150 лет, когда A. Velpean впервые в 1839 г. описал клинику газовой гангрены. В начале XX в. заболевания, вызываемые анаэробами, выделились в самостоятельный раздел, в который входят 3 группы болезней: гнойно-воспалительные; столбняк, ботулизм; гангрена мягких тканей. Последние две группы, обусловленные клостри-диями, в представлении врачей являются главенствующей формой анаэробных поражений. Вместе с тем клостридии составляют очень небольшую часть встречающихся у человека анаэробов - около 5%. В то же время существует гораздо более значительная группа патогенных для человека анаэробов, которые не образуют спор. Среди них клиническое значение имеют представители родов Bacteroides, Fusobacterium (грамотрицательные палочки), Peptococcus и Peptostreptococcus (грамположительные кокки), Veillonella, Actinomyces. Вызываемые ими заболевания часто называют неклостридиальными анаэробными инфекциями.
Анаэробные бактерии представляют существенную часть нормальной микрофлоры человека и имеют большое значение при смешанных инфекциях. Смешанный характер клинических инфекций объясняется тем, что при повреждении слизистых оболочек в ткани попадают все бактерии, населяющие данный участок тела. При углублении гипоксии анаэробы становятся ведущим фактором деструктивного процесса. По данным D. Scevola (1998) ответственными за хирургическую инфекцию являются 7 видов бактерий, 2 из которых - анаэробы (бактероиды и клостридии). Большинство анаэробных инфекций эндогенны, отсюда вытекает их клиническая особенность - близость к местам естественного обитания анаэробов - желудочно-кишечный тракт, верхние дыхательные пути, половые органы. При этом анаэробная инфекция развивается на фоне повреждения слизистых оболочек.
Известна роль анаэробов в поражении желудочно-кишечного тракта. Так, С. perfrmgens считается самым распространенным видом при пищевых отравлениях микробной природы. Другой представитель клостридий — С. difficile является этиологическим фактором псевдомембранозного колита и причиной внутри больничных диарей.
Однако роль анаэробов в возникновении широкого спектра хирургических инфекций, равно как и при поражении желудочно-кишечного тракта, в литературе освещена недостаточно. Это объясняется трудностями, связанными с обнаружением и выделением анаэробов, их идентификацией, а также слабой изученностью факторов патогенности этой группы микроорганизмов. В последние годы сообщается об увеличении резистентности анаэробов к различным антибактериальным препаратам. Поэтому знание чувствительности региональных клинически значимых штаммов анаэробных бактерий к антибиотикам приобретает важное значение при выборе эффективных этиотропных средств.
Вышеизложенное явилось обоснованием актуальности проведения настоящего диссертационного исследования, направленного на определение спектра доминирующих анаэробных бактерий, причастных к возникновению желудочно-кишечных и гнойно-воспалительных заболеваний, и детальное изучение их биологических свойств.
Цель работы: охарактеризовать анаэробные бактерии, являющиеся возбудителями желудочно-кишечных и гнойно-воспалительных заболеваний человека, по широкому спектру биологических свойств, включая факторы патогенности и чувствительность к антимикробным препаратам; разработать критерии внутривидового типирования анаэробных бактерий для последующего мониторинга госпитальных инфекций, вызванных ими.
7 Задачи исследования:
Изучить частоту обнаружения и таксономическую принадлежность анаэробных бактерий, выделенных от больных с различными гнойно-воспалительными и желудочно-кишечными заболеваниями, а также от здоровых людей, проживающих в Ставропольском крае.
Охарактеризовать штаммы анаэробных бактерий, обнаруживаемых у больных и здоровых людей, по широкому спектру морфологических, культуральных и биохимических свойств. Оптимизировать схему выделения и идентификации анаэробных бактерий, присутствующих в клиническом материале.
Изучить наличие и частоту встречаемости отдельных факторов патогенности (способность к адгезии, антилизоцимная и каталазная активности, продукция а-гемолизинов) у штаммов анаэробных бактерий, выделенных из клинического материала различной локализации.
Разработать критерии и схему внутривидового типирования клинических изолятов анаэробных бактерий на основе определения присутствия у них отдельных факторов патогенности и их комплексов.
Изучить чувствительность клинических штаммов анаэробных бактерий к антибактериальным препаратам. Предложить эффективные антибактериальные препараты для терапии больных в Ставропольском крае с гнойно-воспалительными и острыми кишечными анаэробными инфекциями.
Научная новизна работы.
Оптимизирована по срокам проведения анализа схема выделения и идентификации анаэробных бактерий, присутствующих в различном патологическом материале.
Проведена детальная таксономическая характеристика более 500 штаммов анаэробных бактерий, выделенных от здоровых людей и больных гнойно-воспалительными и желудочно-кишечными заболеваниями. Среди клинических изолятов преобладали представители В. firagilis, Peptostreptococcus, F. nucleatum, С. septicum, С. histolyticum.
Штаммы анаэробных бактерий, причастные к гнойно-воспалительным и желудочно-кишечным заболеваниям, обладали различными наборами факторов патогенности (способность к адгезии, антилизоцимная и каталазная активности, продукция а~гемолизинов); определена возможность типирова-ния нггаммов анаэробных бактерий на основании наличия у них совокупности отдельных факторов патогенности, что имеет значение для оценки их патогенетической роли при гнойно-воспалительных и желудочно-кишечных заболеваниях, а также при мониторинге госпитальных инфекций, обусловленных анаэробами.
Установлено отсутствие достоверной взаимосвязи между наличием у госпитальных штаммов анаэробных бактерий тех или иных факторов патогенности и локализацией инфекционного процесса (гнойно-воспалительные гинекологические заболевания, гнойные раны хирургических больных, острые кишечные заболевания).
Практическая значимость работы.
Определен спектр доминирующих анаэробных бактерий, присутствующих в клиническом материале больных с гнойно-воспалительными и желудочно-кишечными заболеваниями в Ставропольском крае. Показано широкое распространение полирезистентных к антибиотикам клинически значимых штаммов анаэробных бактерий, в том числе устойчивых к антимикробным препаратам последнего поколения. Для экстренной терапии анаэробной инфекции в качестве химиопрепаратов выбора рекомендуется использовать имипенем и метронидазол. Внедрения результатов работы.
По результатам работы подготовлены «Методические рекомендации по патотипированию анаэробных бактерий» и «Методические рекомендации по выделению и идентификации возбудителей анаэробной инфекции», которые одобрены Ученым Советом (протокол № 10 от 27 ноября 2003г. и № 1 от 29 января 2004 г.) и утверждены директором Ставропольского научно-исследовательского противочумного института. Указанные методические
9 документы используются в работе бактериологических лабораторий больниц и центров Госсанэпиднадзора Ставропольского края (подтверждено соответствующими актами о внедрении результатов НИР).
Апробация работы.
Материалы диссертации представлены на юбилейной научной конференции, посвященной 50-летию Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (Ставрополь, 2002), научно-практической конференции, посвященной 70-летию санитарно-эпидемиологической службы России (Ставрополь, 2002), на конференции «Актуальные проблемы медицины» (Томск, 2004), на конференции «Социально-гигиенические и эпидемиологические проблемы сохранения здоровья военнослужащих и населения» (Нижний Новгород, 2004), на Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - XXI век» (Саратов, 2004), на научно-практической конференции «Региональные особенности здоровья населения Ставропольского края и среда обитания» (Ставрополь, 2004).
Публикации.
Основное содержание работы отражено в 10 публикациях.
Основные положения, выносимые на защиту:
Анаэробные неспорообразующие бактерии, наряду со спорообра-зующими, играют существенную патогенетическую роль в возникновении гнойно-воспалительных заболеваний у гинекологических и хирургических больных, а также при острых кишечных инфекциях в Ставропольском крае.
Клинические изоляты анаэробных бактерий характеризуются отсутствием достоверной взаимосвязи между наличием у них факторов патогенности (адгезия к эритроцитам, наличие антилизоцимной и каталазноЙ активности, продукция а-гемолизина) и нозологическими формами инфекционных поражений, вызываемых этими микроорганизмами.
Наличие и совокупность отдельных факторов патогенности у клинических штаммов анаэробных бактерий могут быть использованы для оценки их патогенного потенциала, а также для внутривидового типирования
10 с целью мониторинга госпитальных инфекций, вызванных этими микроорганизмами.
4. Госпитальные штаммы анаэробных бактерий, изолированные от больных в Ставропольском крае, обладают полирезистентностью к широкому кругу антимикробных препаратов. Для экстренной химиотерапии гнойно-воспалительных и острых кишечных анаэробных инфекций рекомендуется в качестве препаратов выбора использовать имипенем и метро ни дазол.
Структура и объем диссертации.
Работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 242 цитируемых источников, в том числе 130 отечественных и 112 зарубежных авторов. Общий объем диссертации 155 страниц. Текст иллюстрирован 40 таблицами и 13 рисунками.
и Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Роль анаэробных микробов в патологии человека
Последние десятилетия характеризуются возросшим вниманием исследователей к анаэробным микроорганизмам. Отмечен рост выделения анаэробных возбудителей, как причины возникновения воспалительных заболеваний. Ю. В. Цвелев с соавт. (1998) считают, что выделить возбудитель воспалительных заболеваний по общепринятым методам удается лишь в 26%-55% случаях, в то время как использование строгой анаэробной техники и правильного забора материала позволяет обнаружить патогенные микроорганизмы в 98% - 99%. Известно, что анаэробные микроорганизмы составляют абсолютное большинство нормальной микрофлоры человеческого тела. Кожа заселена анаэробами в десятки раз больше чем аэробами. Главное место обитания анаэробов - пищеварительный тракт, где нет стерильных отделов. Флора во рту на 99% состоит из анаэробов, что близко к толстой кишке. Анаэробные бактерии преобладают, не только в нормальной микрофлоре полости рта (в слюне 1,8»Ю8/мл анаэробов и 4»107/мл аэробов) (Brook I., 1999), но и в опухолевой язве, в соскобах из периодонтальных карманов, кариозных полостей (Billington S. J. et al., 1998; Brook I., 1999). Толстая кишка - основное место обитания анаэробов вследствии отсутствия кислорода и очень низкого окислительно-восстановительного потенциала /-2 50 мВ/. Количество бактерий в фекалиях может достигать 10 2 КОЕ /г содержимого. Предполагают, что в 1 г содержимого слепой кишки присутствуют представители более 17 семейств, 45 родов и более 400 видов бактерий, при этом число анаэробов в 100- 1000 раз превышает таковое аэробных бактерий.
Заселение микрофлоры на слизистые желудочно-кишечного тракта начинается с первых часов с момента рождения. Микробиоценоз желудочно-кишечного тракта формируется из трех различных бактериальных экосистем (половых путей матери, прианальной области матери и окружающей среды)
12 и зависит от типа вскармливания. В течение первой недели жизни по данным P.L. Stark, A. Lee (1982) независимо от типа вскармливания, кишечник младенцев колонизируется энтеробактериями и энтерококками, за которыми следуют бифидобактерии, бактероиды, клостридии и анаэробные стрептококки, В дальнейшем биоценозы различаются по обсемененности энтеробактериями, энтерококками и клостридиями: в группе детей находящихся на искусственном вскармливании их количество превышает аналогичные показатели у детей, вскармливаемых грудным молоком. В возрасте 12 месяцев популяции анаэробных бактерий в толстой кишке младенцев (обе группы) начинают соответствовать микрофлоре взрослых лиц, как по количеству, так и по составу.
Благодаря наличию сложной и разветвленной системы кооперации экологическая система - человек - его анаэробная микрофлора выступает как единое целое, согласованно работающее в интересах всей системы. При этом подобно тому, как соматические эукариотические клетки организма и тканей высших организмов дифференцировались и выполняли определенные функции, так и многочисленные виды бактерий хозяина и их ассоциации также специализировались, регулируя конкретные физиологические функции макроорганизма в естественных условиях его обитания (Ruseler-van Embden J.G. et al., 1994; Van der Waaij D., 1996; Guerin-Danan С et al, 1997).
Анаэробные бактерии в толстой кишке, в частности, могут осуществлять гидролиз гликозидов, глюкоронидов, сульфаматов, амидов, нитратов и различных эфиров, дегидроксилировать С- и Н-гидроксигруппы, декарбокси-лироватъ и дезаминировать различные аминокислоты, вызывать демитили-рование, дегидрогенирование различных органических соединений, восстанавливать двойные связи, нитро- и азогруппы, спирты, альдегиды, вызывать ароматизацию, этерификациго и ацетилирование многих соединений (тендеров Б.А., 1996; Масу J.M., Probst I., 1979).
Метаболизация только азотсодержащих соединений вовлекает более десятка микробных ферментов: нитратредуктазы, нитритредуктазы, нитро-
редуктазы, дезаминазы, декарбоксилазы, азоредуктазы, протеингидролазы и др. (Savage D.C., 1989; Corfield А.Р. et al., 1992; Meyer H.O. et al., 1993).
Таким образом, анаэробную микрофлору следует рассматривать как интегральную часть организма хозяина, как своеобразный метаболический экстракорпоральный орган.
Среди механизмов, контролирующих состав нормальной микрофлоры, особое место занимают специфические и неспецифические иммунорегуля-торные системы хозяина (Бухарин О.В., 1999). Прежде всего это иммуноглобулины класса А, препятствующие адгезии и способствующие выведению аллохтонных бактерий. Показано, что подавляющее число представителей индигенной анаэробной микрофлоры, в отличие от аэробных бактерий, не покрыты IgA (Van Der Waaij D., Ї984). Данный факт может объяснять некоторые механизмы взаимодействия макроорганизма и индигенной анаэробной микрофлоры в поддержании колонизационной резистентности экониш тела человека.
Одним из главных механизмов защиты от колонизации патогенными и/или условно-патогенными микроорганизмами является присутствие в организме хозяина индигенной анаэробной микрофлоры. Данный протективный эффект индигенных анаэробов реализуется через комплекс механизмов, связанных с метаболизмом бактерий, и является более эффективным, чем защита, обусловленная иммунной системой хозяина (Barker Н.А., 1981; Freter R., 1984).
P.Stark, A.Lee (1982) показали, что микрофлора у преждевременно родившихся детей в основном представлена родами: Bacteroides, Bifidobacterium и Clostridium, которые на фоне сниженной адаптации представляют реальную угрозу у новорожденных пневмонии и сепсиса. (Stark С. et al., 1996). Часто анаэробы выделяют из культуры крови недоношенных детей, особенно когда кровь берут из пуповины сразу после рождения. Анаэробные грамположительные кокки (пептококки и пегггострептококки) часто являются возбудителями анаэробной инфекции половой системы и бактериемии
14 новорожденных. Обнаружено что липополисахариды грамотрицательных анаэробных бактерий провоцируют иммунный конфликт между организмом матери и плодом, проявляющийся в форме гемолитической болезни новорожденного. Удельный вес анаэробной микрофлоры при остром послеродовом эндометрите составляет 70 - 93% (Брилис В. И., с соавт., 1986; Цвелев Ю.В. с соавт., 1988). Наиболее часто обнаруживались бактероиды (41,5%) и грамположительные кокки (Цвелев Ю.А. с соавт., 1998; Брилис В.И., 1983). Даже без воспаления область малого таза не является стерильной. Анаэробные микроорганизмы — представители нормальной микрофлоры половых путей женщины - могут распространяться в верхние отделы., адгезируясь на спермиях. Этиология острых аднекситов чаще всего полимикробная, но ведущая роль принадлежит строгим анаэробам: бактероидам, пептококкам и пеп-тострептококкам. При остром сальпингите большую этиологическую роль играют анаэробы, численность которых значительно возрастает при сопутствующей гонорее (Йорданов Г., Катрану шкова Н., 1980). Анаэробы могут вызывать вторичный сальпингит в результате миграции из гнойно-воспалительного очага других тазовых органов, например аппендикса (Голубев В.А. с соавт., 1986). Анаэробы, ровно как гонококки и хламидии, являются причиной женского бесплодия.
Подавляюще число перитонитов у хирургических больных протекает с участием анаэробных микроорганизмов. (Борисов И.А., 1986; Тец В.В., 1994).
Нагноения, вызываемые анаэробно-аэробной микрофлорой требуют несколько иных подходов. Исследования последних лет свидетельствуют, что неспорообразующие анаэробы и их ассоциации с аэробами играют важную роль в развитии острой и хронической инфекции. По-новому представляется этиология таких часто встречающихся заболеваний, как перитонит (в 62 % имеет место участие анаэробов), эмпиема плевральной полости (в 70 % - 90 %), диабетическая гангрена (в 50 %), гнойный холангит (в 70 %), острый холецистит (в 20 %) и т. д. Без учета анаэробов, этиологическая диагностика
15 становится неточной, искаженной, возникает большая группа нерегистри-руемых инфекций. Применение совершенных способов этиологической диагностики за счет обнаружения ранее не регистрировавшейся микрофлоры снизило удельный вес стафилококка в общем микробном пейзаже до 17 %, что в 4 - 5 раз ниже, чем при традиционных методах микробиологического исследования (Чадаев А. П. с соавт., 1996).
Основным механизмом развития гнойно-воспалительных заболеваний, этиологическим фактором которых выступают неспороебразующие анаэробные организмы, является эндогенный путь инфицирования, отражающий нарушение сложившегося в ходе эволюции баланса между макроорганизмом и его микрофлорой, с одной стороны, и нарушением равновесия внутри микробных ассоциаций (т.е. дисбиотическими процессами) - с другой (Кулешов С.Е., 1991). Обычно удается проследить не только близость очагов к слизистым оболочкам, но и повреждение этих оболочек. Так, например, абсцессы мозга вызываются анаэробными бактериями в 60% случаях, флегмоны шеи -в 100%, аспирационные пневмонии - 93%, абсцессы легкого - 100%, гнойники в брюшной полости - 90%, аппендикулярный перитонит - 96%, гинекологические инфекции - 100%, абсцессы мягких тканей - 60 %. В настоящее время общепринятым стало положение о поливалентном микробном пейзаже гнойно-некротических поражений стопы у больных сахарным диабетом с участием факультативно - и облигатно - анаэробных неклостридиальных микроорганизмов (Gerding N., 1995; Grayson М, 1995;). По данным А. М. Светухина с соавт. (2000) в гнойно-некротических очагах на стопе у больных сахарным диабетом смешанная аэробно - анаэробная инфекция обнаружена в 83, 3 % случаев, только аэробная -вП, 7%. У 5 % больных роста микрофлоры не обнаружено, что может быть связано с длительным проведением антибактериальной терапии. Наиболее часто из облигатных анаэробов встречались Ptevotella melamnogenica, Bacteroides fragilis, Peptococcus spp., Peptostreptococcus spp., Fusobacterium spp. Так же развитие абсцесса легкого связывается, прежде всего, с анаэробной флорой - Bacteroides spp., Fusobac-
16 terium nucleatum, Peptostreptococcus spp., Peptococcus niger - нередко в сочетании с энтеробактериями (вследствие аспирации содержимого ротоглотки), а основными возбудителями эмпиемы, ассоциируемой с пневмонией (с абсцессом легкого или без него), являются анаэробы.
В настоящее время при обсуждении анаэробных инфекций клиницисты особое внимание уделяют клостридиальной инфекции, ей приписывается крайняя тяжесть течения, обширность некротических изменений, газообразование и высокая летальность. В действительности же клостридии составляют лишь очень небольшую часть встречающихся у человека анаэробов (около 5%) (Баженов Л.Ґ., 1986; Баскаков В.П. с соавт., 1982). В то же время существует гораздо более значительная группа патогенных для человека анаэробов, которые не образуют спор. Среди них, наибольшее клиническое значение имеют представители родов Bacteroides, Fusobacterium, Peptococcus и Peptostreptococcus, Veillonella, Actinomyces и др.
Вызываемые ими заболевания часто называют неклостридиальными анаэробными инфекциями. Больные с этими инфекциями не являются редкостью и часто не обладают какой-либо клинической уникальностью. Они представляют собой большую часть повседневных хирургических инфекций и могут характеризоваться преимущественно местными проявлениями и доброкачественным течением, либо иметь клинику тяжелых процессов с неблагоприятным прогнозом.
Опыт показывает, что основная масса инфекций, протекающих с участием анаэробов, не бывает мономикробной. Чаще всего они вызываются сочетанием анаэробов с аэробами. По данным D. Scevola (1998), за 62, 5 % хирургических раневых инфекций отвечают 7 видов бактерий (19 % -Escherichia coli, 18,3 % - Staphylococcus aureus, 8,8 % - Proteus spp., 8,7 % -Pseudomonas aeruginosa, 3,9% - Bacteroides spp., 2,6 % - Streptococcus spp., 1,1% - Clostridium perfringens). Хирургическая раневая инфекция составляет 14% всех неблагоприятных исходов, регистрируемых в стационаре, и яв-
17 ляется причиной увеличения в 2 раза времени послеоперационного пребывания больного в стационаре и связанных с этим материальных издержек.
G, MiragHotta et al. (1993) высказали гипотезу, что продукция анаэробами летучих жирных кислот (ЛЖК) в области периодонта вызывает локальное повреждение защитной системы макроорганизма. Скорее всего, ЛЖК как продукты метаболизма анаэробов полости рта участвуют в патогенезе заболеваний пародонта.
A. Hackford (1990) полагает, что грамотрицательные аэробы ответственны за фазу перитонита и смертность больных при интраабдоминальной инфекции, анаэробы - за формирование абсцессов у выживших. Поэтому антимикробная терапия и профилактика должны быть направлены на оба эти компонента. Развитие гнойно-воспалительных осложнений после операций на гениталиях у женщин обусловлено вегетированием смешанной аэробно - анаэробной флоры в зоне операции. Неадекватное профилактическое применение антибиотиков приводит к развитию послеоперационных гнойно-воспалительных осложнений (Mancuso S., Oliva G., 1988; Mayer H.O. et al., 1993). При бактериологическом исследовании удаленных органов были получены данные, подтверждающие превалирование анаэробных микроорганизмов в зоне операции. Отмечалась связь между частотой послеоперационной лихорадки и наличием и степенью обсеменения анаэробной флорой (Дмитриева Н. В. с соавт., 1992).
A. Heimdahl et al. (1990) отмечают, что инфекции, вызванные анаэробными бактериями, протекают наиболее тяжело. Вне зависимости от локализации очага имеются общие и весьма характерные клинические особенности инфекционных процессов, протекающих с участием анаэробов. Многие клинические особенности данного вида инфекции объясняются особенностями метаболизма анаэробов, а именно - гнилостным характером поражения, газообразованием, серо-зеленым или коричневым цветом экссудата.
Широко распространенный термин ''кишечные инфекции" относится к большой группе инфекционных заболеваний с преимущественным пора-
18 жением желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и соответствующей симптоматикой (диарея, боли в области живота, в подложечной области, тошнота, иногда рвота, в тяжелых случаях - выраженная интоксикация, обезвоживание). Эти инфекции вызываются главным образом различными патогенными или условно - патогенными бактериями, вирулентные и токсигенные свойства которых определяют особенности патогенеза. Характер течения заболевания зависит от свойств микроорганизмов, в первую очередь от их токсиген-ности и инвазивности. Особое место занимают пищевые токсикоинфекции, патогенез которых определяют бактериальные экзотоксины с энтеротропны-ми свойствами (энтеротоксины, цитотоксины). Клиника заболевания связана в первую очередь с поражением верхних отделов желудочно-кишечного тракта. Энтеротоксины могут продуцировать токсигенные штаммы анаэробов (Clostridium perfringens, Bacteroides fragilis). Наиболее серьезную опасность представляют термостабильные энтеротоксины. Чаще энтеротоксины относятся к термолабильным токсинам (Падейская Е.Н., 1997; Рахманова А.Г. с соавт., 1995). Среди Bacteroides fragilis обнаружены энтеротоксичные штаммы, вызывающие диарею у человека, особенно детей. Токсин (фрагилизин) нарушает структурно-функциональные контакты между эпителиоцитами кишечника ("параделлюлярный барьер"), вызывая их эксфолиацию и гиперсекрецию жидкости (Мухина Ю. Г., 1999).
Вслед за стафилококковой интоксикацией и сальмонеллезной инфекцией Clostridium perfringens считается самым распространенным агентом пищевого отравления микробной природы. Clostridium perfringens вызывает диарею в результате продукции токсинов. Токсинообразование происходит в ходе пролиферации микроорганизмов в контаминированных пищевых продуктах, в то время как пролиферация микроорганизмов в кишечнике не имеет существенного значения. Для заболевания характерны схваткообразные боли в животе, зловонный пенящийся понос, изредка рвота и температура. Симптомы возникают через 7-24 ч после приема инфицированной пищи, выражены обычно умеренно и проходят без лечения через 2-3 дня. Для
развития заболевания необходимо 10 клеток Clostridium perfringens, (в кишечнике в норме Clostridium perfringens 103 в I г) которые, подвергаясь споруляции в тонком кишечнике, высвобождают энтеротоксин, накопившийся в бактериях при вегетации в продуктах питания; в пищеварительном тракте возбудитель не размножается. (Падейская Е.Н., 1997; Лобзин Ю. В., 2000).
Возбудитель псевдомембранозного колита ассоциированного с применением антибиотиков, Clostridium difficile, является едва ли не главной причиной внутрибольничной диареи. Классическим симптомом является понос с примесью крови, которому сопутствуют схваткообразные боли в животе, лейкоцитоз и лихорадка. Парадоксом является широкая контаминация здоровых детей - 14-50%; у новорожденных достигает 90%. Считают, что токсины Clostridium difficile не рецептаруются энтероцитами новорожденных и не вызывают их поражения (Лобзин Ю. В., 2000),
1.2. Номенклатура и классификация анаэробов.
Биологическая классификация бактерий неоднократно пересматривалась. Но лишь современная классификация, представленная в Руководстве по систематике бактерий Берджи, содержит ясные указания о медицинском значении представителей конкретных таксонов. В соответствии с ними (на основе строения клеточной стенки и отношения к окраске по Граму) бактерии разделены на 35 групп, входящих в 4 категории.
Касаясь номенклатуры и классификации анаэробов, согласно определителю бактерий Берджи, среди анаэробных микроорганизмов выделяют следующие группы (таблица 1).
20 Таблица 1. Классификация и номенклатура анаэробных бактерий,
имеющих наибольшее медицинское значение
21 1.3. Факторы патогенности анаэробов.
Развитие и исход заболеваний микробной этиологии зависят от персис-тентных свойств микроорганизмов, направленных на инактивацию факторов естественной резистентности организма человека (лизоцим, комплемент и др.) (Бухарин О.В. с соавт.,1996). Ранее было показано, что характер течения эндометритов и сальпингоофоритов зависит от выраженности факторов пер-систенции возбудителя (Первушина Л. А., 1990).
Для того, что бы быть патогенными, бактерии должны: инфицировать слизистые поверхности, проникать через них в хозяина, размножаться во внутренней среде хозяина, противодействовать его защитным механизмам и причинять ему вред. Для выполнения каждого из этих требований бактерии должны обладать рядом биологических факторов. (Бухарин О.В., Литвин В.Ю., 1997). Факторы вирулентности (фенотипическое выражение патогенного генотипа) - факторы, обеспечивающие адгезию, колонизацию, персис-тенцию микроорганизма в макроорганизме; токсические факторы (токсины, ферменты, метаболиты), оказывающие неблагоприятное воздействие на клетки - мишени и нарушающие нормальные регуляторные механизмы макроорганизма. Факторы патогенности микроорганизмов делят на 3 основные группы (Петровская В.Т., Бондаренко В.М., 1994): определяющие взаимодействие возбудителей с эпителием входных ворот; сообщающие микробам устойчивость к гуморальным и клеточным факторам защиты макроорганизма; способность продуцировать токсины и токсические продукты. Таким образом, анаэробные бактерии имеют широкий набор различных факторов патогенности, направленных на противодействие защитным системам хозяина (Bergan Т., 1984; Hofstad Т., 1989;1992; Finegold S.M et al., 1993; Duerden В.I., 1994). К факторам патогенности спорообразующих анаэробов традиционно относят продукцию токсинов, в то время как инвазивность их по сравнению с аспоровыми анаэробами, почти всегда ограничена. Краткая характеристика основных факторов вирулентности анаэробов и их патогенетические эффекты представлены в таблице 2 (Маянский А.Н., 1999).
22 Таблица 2. Характеристика основных факторов вирулентности анаэробных бактерий и механизм их действия на организм хозяина
Но помимо указанных факторов, анаэробные микроорганизмы обладают каталазнои и супероксиддисмутазнои активностью, что позволяет им переживать контакт с кислородом, оказывая протективный эффект при взаимодействии с кислородзависимыми системами макрофагов.
К факторам патогенности бактерий семейства Bacteroidaceae традиционно относят капсульный полисахарид, гистологические ферменты (про-теиназы, гиалуронидазы, липазы, нуклеазы и т.д.), ферменты инактивации
23 кислорода (каталаза, супероксиддисмутаза), эндотоксин и фимбрий, обеспечивающие адгезию к эпителию (Brook I. et al, 1984).
Адгезивные свойства. Адгезия создает предпосылки для размножения бактерий. Представители двух основных таксономических групп микроорганизмов - грам положительные и грамотрицательные бактерии - используют различные стратегии специфической адгезии. У грам отрицательных микроорганизмов молекулы адгезинов входят в состав специализированных орга-нелл - ворсинок (фимбрий, пилей), вследствие чего они названы фимб-риальными адгезинами.
У грамположительных бактерий фимбриальные адгезины не описаны. Эти микроорганизмы осуществляют адгезию посредством афимбриальных адгезинов. Структура многих афимбриальных адгезинов не установлена. Большинство из известных являются белковыми молекулами, связанными с цитоплазматичсской мембраной микробной клетки. Рецепторами для адгезинов грампозитивных бактерий чаще всего являются фибронектин и белки межклеточного матрикса. Афимбриальные адгезины описаны и у грамне-гативных бактерий. Адгезины - это особые специфические макромо-лекулярные комплексы микробных клеток, входящие в состав бактериальных фимбрий или поверхностных структур клеточной стенки, с помощью которых происходит фиксация возбудителя на поверхности слизистой оболочки. Адгезины часто являются лектинами - протеинами, способными связываться с карбогидратами. Морфология адгезинов очень разнообразна и реализация адгезивной функции происходит за счет довольно сложных физико-химических реакций. Адгезия бактерий на эпителии является и наиболее важным этапом развития инфекционного процесса (Далин М.В. с соавт., 1985; Землянкина Л.П. с соавт., 1989; Ткаченко Н.Л., 1990).
По данным Brook I. et al. (1984) наличие у Bacteroides fragilis пилей, позволяет бактероидам прикрепляться к стенкам хозяина и склеиваться друг с другом, образуя адгезивные агломераты в виде сети бактерий, лучше противостоящие фагоцитозу, чем единичные бактерии. Очень немного из-
вестно о факторах, которые могут объяснять патогенность актиномикоза, вызываемого ферментатирующими актиномицетами. Тем не менее, уже достаточно давно установлено, что Actinomyces spp. могут образовывать на своей поверхности ворсинчатый слой, который может напоминать волоски и который может способствовать адгезии возбудителя к клеткам хозяина.
Токсины и токсические продукты. Значительное место в персисти-ровании бактерий отводится признанным факторам вирулентности - токсинам, основной мишенью которых являются клеточные механизмы защиты хозяина. Участие бактериальных токсинов в развитии инфекционного процесса впервые было определено еще в 1888 году в работах Э. Ру, А. Иерсена, Л. Пастера и др. Уже в то время были получены данные, позволяющие разделить бактериальные токсины на термостабильные и термолабильные, что в какой-то мере отражало их природу, но не химическую структуру.
Токсины - это регуляторные элементы, действующие в гетерологичных клеточных системах вне их контроля и сдвигающие равновесие протекающих в них физиологических процессов (Вертиев Ю.В., 1996).
Последующие годы были ознаменованы не только увеличением количества вновь открываемых токсинов, но и, прежде всего, расшифровкой их химической структуры, молекулярных механизмов действия и генетического контроля (Малов В.А. с соавт., 1994; Вертиев Ю.В., 1996). Техника клонирования генов, контролирующих синтез хорошо известных токсинов и их субъединиц, позволила уточнить роль различных токсинов-возбудителей в развитии инфекционного процесса (Покровский В.И. с соавт., 1990; Езепчук Ю.В., 1991; Петровская В.Г., Бондаренко В.М., 1994).
С позиции инфекционной патологии бактериальные токсины условно можно разделить на две группы:
- определяющие основу патогенеза и специфичность клинической картины инфекционного заболевания (энтеротоксины Vibrio cholerae) и ЕТЕС (эн-теротоксигенные кишечные палочки), экзотоксины Clostridium tetani, Clostridium botulinum и др;
25 - участвующие в патогенезе заболевания, но не определяющие его специфики (гемолизины грамотрицательных бактерий, цитотоксины энтеро-бактерий, токсины стафилококков и др.).
Как правило, бактероиды продуцируют многочисленные протеолити-ческие энзимы и другие «ферменты агрессии», в т. ч. гепариназу, липазу, ряд протеаз, Р- лактамазу, гиалуронидазу, дезоксирибонуклеазу и АТФ-азу. Эти ферменты способствуют образованию микротромбов и клеточных агрегатов в системе микроциркуляторного русла, существенно ухудшая тканевый кровоток, стимулируют процессы диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови, могут вести к разнообразным эмболическим осложнениям. Они также способствуют генерализации инфекционного начала, снижению барьерных свойств слизистых. Bacteroides fragilis обладает рядом факторов, обусловливающих патогенность: способность секретировать лактамазу, энтеротоксин, гиалуронидазу, гепариназу, фибролизин, нейраминидазу. Имеются указания, что 10% случаев диарей вызываются энтероток-сигенными штаммами Bacteroides fragilis; особенно часто диарея, обусловленная бактероидами, наблюдается у детей дошкольного возраста. (Мухина Ю. Г., 1999).
К числу важных токсических веществ относятся гемолизины. Тканевому распространению микроорганизмов способствуют также ферменты фосфо-липазы, вызывающие лизис эукариотических клеток в результате образования пор в цитоплазматической мембране. К фосфолипазам относятся широко распространенные среди микроорганизмов гемолизины. Целый ряд видов фузо-бактерий способны секретировать гемолизины, гемагглютинины и факторы агрегации тромбоцитов. Поэтому при тяжелых септицемиях, связанных с ростом фузобактерий, могут возникать тромбоэмболии, имеющие соответствующую клиническую характеристику. (Мухина Ю. Г., 1999).
Эндотоксин (или липополисахарид) является обычным структурным компонентом клеток многих грамотрицательных бактерий. Эндотоксин состоит из белка (А), являющегося токсической порцией молекулы, связанной с
26 липополисахаридным комплексом. Большинство бактериальных экзотоксинов белковой природы реализуют "свой потенциал", либо вмешиваясь в какой-то биохимический процесс в клетке-мишени (холерный экзотоксин), либо взаимодействуя с компонентом мембраны (а-токсин гангренозной палочки) или нейротрансмиттером (ботулинический или столбнячный токсины). Эндотоксин же действует совершенно иначе. При определенных обстоятельствах он оказывает прямое повреждающее действие на клетки эндотелия, но основным механизмом является взаимодействие со специфическими видами клеток и каскадными системами плазменных белков, в результате чего высвобождается множество активных промежуточных продуктов. Некоторые из них обладают сосудорасширяющим действием и, следовательно, вызывают гипо-тензию; другие участвуют в патогенезе ДВС-синдрома.
Анаэробные клостридии выделяют ряд сильнейших экзотоксинов (нейро-, некро-, энтеротоксин, гемолизин) и ферментов (гиалуронидазу, нейраминидазу, фибринолизин, коллагеназу и эластазу, лецитиназу и др.), которые вызывают отек тканей, резкую проницаемость сосудов и гемолиз, некроз и расплавление тканей, тяжелую интоксикацию организма с повреждением внутренних органов.
Среди прочих биологически активных веществ самым неоднозначным продуктом жизнедеятельности анаэробных бактерий можно считать летучие жирные кислоты (ЛЖК). ЛЖК - монокарбоновые кислоты с длиной цепи до 8 атомов углерода, поэтому в англоязычной литературе их еще называют "short chain fatty acids" (SCFA) - короткоцепочечными жирными кислотами. К ним относятся уксусная, пропионовая, изомасляная, масляная, изовалериановая, валериановая, изокапроновая и капроновая кислоты. ЛЖК - основной продукт микробной ферментации углеводов, жиров и белков. (Шендеров Б. А. Д998).
За последние 15 лет была установлена их роль в ряде физиологических и патологических процессов. Botta G. et al. (1994) указывают, что ЛЖК являются одним из факторов вирулентности таких относительно патогенных анаэробов, как Bacteroides spp. Prevotella и др., ставя их по значимости в один
27 ряд с такими факторами агрессии, как пили, ферментные системы, компоненты бактериальной капсулы.
Антилизоцимная активность (АЛА). Важное место в процессах мик-робно-гостального взаимодействия занимает адаптация бактерий к защит-норегуляторым системам хозяина, реализуемая через угнетение клеточных и гуморальных факторов защиты макроорганизма (Бухарин О.В., 1999). Одним из адаптационных механизмов микроорганизмов к факторам неспецифической резистентности хозяина, который ведет к длительному переживанию (персистенции) бактерий, является их способность к инактивации катионного белка с антибактериальной и иммуномодулирующей активностью - лизоцима (Бухарин О.В. с соавт., 1982; 1985). Особого внимания из факторов развития инфекционного процесса и персистенции микроорганизма, заслуживает способность микробной клетки инактивировать механизмы естественной защиты - лизоцим и лейкоцитарный интерферон, определяемые как антилизоцимная (АЛА) и антиинтерфероновая (АИА) активность (Бухарин О.В. 1999). Методом поп уляцион ного анализа доказано, что АЛА можно рассматривать, как маркер персистенции бактерий, способных к паразитированию в организме человека (Бухарин О.В. с соавт. 1984; 1993; Бухарин О.В., 1992; Первушина Л.А., 1990; Бозиев А.Б., 1993).
Антилизоцимный фактор не сообщает бактериям дополнительных адгезивных свойств и способности проникать внутрь клеток, а так же не влияет на поглотительную способность макрофагов (Петровская В.Г. с соавт., 1986; Соколов В.Ю., 1990). Оказалось, что значение антилизоцимного признака при взаимодействии бактерий с эпителием и фагоцитами заключается в замедлении этапа переваривания антилизоцимположительных трансконьюга-тов лизосомальными ферментами в 2 раза. Бактерии, обладающие антили-зоцимной активностью, сохранялись в фагоцитах 10-12 часов, в то время как не обладающие антилизоцимной активностью полностью элиминировались из культуры макрофагов через 5-6 часов от момента заражения. Приведенные данные показывают, что антилизоцимный признак способствует подавлению
28 фагоцитоза, а так же сохранению, и возможно, размножению обладающих им штаммов бактерий.
Таким образом, установлено, что АЛА играет роль в инфекционном процессе и с полным основанием может быть причислена к факторам патогенносте (Габрилович И.М. с соавт., 1994). При наличии штаммов такого типа у больных наблюдается более тяжелое течение заболевания и более длительное выделение возбудителя (Бухарин О.В. с соавт., 1985; Бухарин О.В., 1994; Бондаренко В.М. с соавт., 1996).
Аитиинтерфероновая активность (АИА). К секретируемым факторам, обеспечивающим персистирование микробной клетки, следует отнести и АИА, характеризующую способность бактерий инактивировать бактерицидный компонент препарата лейкоцитарного интерферона человека (Бухарин О.В. с соавт., 1990).
Частота выделения этого признака, находится в тесной зависимости от источника вЬ7деления микроорганизма и практически не коррелирует с его видовой принадлежностью. (Бухарин О.В. с соавт., 1993).
АИА бактерий выявлена у большой группы патогенных и условно-патогенных грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов и рассматривается как автономное свойство микробов, предназначенное для целенаправленного специфического инактивирования бактерицидной фракции человеческого лейкоцитарного интерферона (Спивак Н.Я. с соавт., 1987).
Каталазная активность (КА). Рассматривая роль экзоклеточно сек-ретируемых факторов, обеспечивающих выживание патогенов в организме хозяина, следует отметить бактериальную каталазу, которая способствует резистентности микроорганизмов к уничтожению макрофагами хозяина в результате воздействия перекиси водорода (Бухарин О.В. с соавт., 1992). Бактерицидные системы фагоцитов классифицируются на две группы: кислородозависимые и кислородонезависимые. Активность кислородозависи-мой системы при завершенном фагоцитозе, как правило, реализуется через «кислородный метаболический взрыв», когда повышается активность гек-
29 созонофосфатного шунта и образуются высокоактивные кислородные радикалы - атомарный кислород (О-), супероксиданлон (Ог), перекись водорода (Н202), при которых функционирует основной фермент миелопероксидаза (Спивак Н.Я. с соавт., 1987).
Инактивация кислородозависимой бактерицидной системы внутрифаго-цитарным паразитом осуществляется за счет нескольких механизмов. Возможно предупреждение «кислородного взрыва» за счет подавления ключевых биохимических путей синтеза активных кислородных радикалов. Возможна инактивация уже образовавшихся окислительных радикалов за счет синтеза специальных ферментов - супероксиддисмутаз и каталаз.
Вышеизложенное позволяет сделать вывод, что в настоящее время накоплен достаточный фактический материал о роли анаэробных микроорганизмов в формировании микроэкологического статуса желудочно-кишечного тракта, о роли данных микроорганизмов в развитии патологических процессов в различных органах и тканях человека, описаны детерминанты пато-генности многих видов анаэробов, их способность обеспечивать реализацию инфекционных свойств. Однако до настоящего времени отсутствуют работы обобщающего плана, позволяющие оценить истинную значимость отдельных факторов патогенности при поражении конкретных органов и тканей. Практически отсутствуют данные о роли анаэробных микроорганизмов при кишечных инфекциях.
Роль анаэробных микробов в патологии человека
Последние десятилетия характеризуются возросшим вниманием исследователей к анаэробным микроорганизмам. Отмечен рост выделения анаэробных возбудителей, как причины возникновения воспалительных заболеваний. Ю. В. Цвелев с соавт. (1998) считают, что выделить возбудитель воспалительных заболеваний по общепринятым методам удается лишь в 26%-55% случаях, в то время как использование строгой анаэробной техники и правильного забора материала позволяет обнаружить патогенные микроорганизмы в 98% - 99%. Известно, что анаэробные микроорганизмы составляют абсолютное большинство нормальной микрофлоры человеческого тела. Кожа заселена анаэробами в десятки раз больше чем аэробами. Главное место обитания анаэробов - пищеварительный тракт, где нет стерильных отделов. Флора во рту на 99% состоит из анаэробов, что близко к толстой кишке. Анаэробные бактерии преобладают, не только в нормальной микрофлоре полости рта (в слюне 1,8»Ю8/мл анаэробов и 4»107/мл аэробов) (Brook I., 1999), но и в опухолевой язве, в соскобах из периодонтальных карманов, кариозных полостей (Billington S. J. et al., 1998; Brook I., 1999). Толстая кишка - основное место обитания анаэробов вследствии отсутствия кислорода и очень низкого окислительно-восстановительного потенциала /-2 50 мВ/. Количество бактерий в фекалиях может достигать 10 2 КОЕ /г содержимого. Предполагают, что в 1 г содержимого слепой кишки присутствуют представители более 17 семейств, 45 родов и более 400 видов бактерий, при этом число анаэробов в 100- 1000 раз превышает таковое аэробных бактерий.
Заселение микрофлоры на слизистые желудочно-кишечного тракта начинается с первых часов с момента рождения. Микробиоценоз желудочно-кишечного тракта формируется из трех различных бактериальных экосистем (половых путей матери, прианальной области матери и окружающей среды) и зависит от типа вскармливания. В течение первой недели жизни по данным P.L. Stark, A. Lee (1982) независимо от типа вскармливания, кишечник младенцев колонизируется энтеробактериями и энтерококками, за которыми следуют бифидобактерии, бактероиды, клостридии и анаэробные стрептококки, В дальнейшем биоценозы различаются по обсемененности энтеробактериями, энтерококками и клостридиями: в группе детей находящихся на искусственном вскармливании их количество превышает аналогичные показатели у детей, вскармливаемых грудным молоком. В возрасте 12 месяцев популяции анаэробных бактерий в толстой кишке младенцев (обе группы) начинают соответствовать микрофлоре взрослых лиц, как по количеству, так и по составу.
Благодаря наличию сложной и разветвленной системы кооперации экологическая система - человек - его анаэробная микрофлора выступает как единое целое, согласованно работающее в интересах всей системы. При этом подобно тому, как соматические эукариотические клетки организма и тканей высших организмов дифференцировались и выполняли определенные функции, так и многочисленные виды бактерий хозяина и их ассоциации также специализировались, регулируя конкретные физиологические функции макроорганизма в естественных условиях его обитания (Ruseler-van Embden J.G. et al., 1994; Van der Waaij D., 1996; Guerin-Danan С et al, 1997).
Анаэробные бактерии в толстой кишке, в частности, могут осуществлять гидролиз гликозидов, глюкоронидов, сульфаматов, амидов, нитратов и различных эфиров, дегидроксилировать С- и Н-гидроксигруппы, декарбокси-лироватъ и дезаминировать различные аминокислоты, вызывать демитили-рование, дегидрогенирование различных органических соединений, восстанавливать двойные связи, нитро- и азогруппы, спирты, альдегиды, вызывать ароматизацию, этерификациго и ацетилирование многих соединений (тендеров Б.А., 1996; Масу J.M., Probst I., 1979).
Метаболизация только азотсодержащих соединений вовлекает более десятка микробных ферментов: нитратредуктазы, нитритредуктазы, нитроредуктазы, дезаминазы, декарбоксилазы, азоредуктазы, протеингидролазы и др. (Savage D.C., 1989; Corfield А.Р. et al., 1992; Meyer H.O. et al., 1993).
Таким образом, анаэробную микрофлору следует рассматривать как интегральную часть организма хозяина, как своеобразный метаболический экстракорпоральный орган.
Среди механизмов, контролирующих состав нормальной микрофлоры, особое место занимают специфические и неспецифические иммунорегуля-торные системы хозяина (Бухарин О.В., 1999). Прежде всего это иммуноглобулины класса А, препятствующие адгезии и способствующие выведению аллохтонных бактерий. Показано, что подавляющее число представителей индигенной анаэробной микрофлоры, в отличие от аэробных бактерий, не покрыты IgA (Van Der Waaij D., Ї984). Данный факт может объяснять некоторые механизмы взаимодействия макроорганизма и индигенной анаэробной микрофлоры в поддержании колонизационной резистентности экониш тела человека.
Одним из главных механизмов защиты от колонизации патогенными и/или условно-патогенными микроорганизмами является присутствие в организме хозяина индигенной анаэробной микрофлоры. Данный протективный эффект индигенных анаэробов реализуется через комплекс механизмов, связанных с метаболизмом бактерий, и является более эффективным, чем защита, обусловленная иммунной системой хозяина (Barker Н.А., 1981; Freter R., 1984).
P.Stark, A.Lee (1982) показали, что микрофлора у преждевременно родившихся детей в основном представлена родами: Bacteroides, Bifidobacterium и Clostridium, которые на фоне сниженной адаптации представляют реальную угрозу у новорожденных пневмонии и сепсиса. (Stark С. et al., 1996). Часто анаэробы выделяют из культуры крови недоношенных детей, особенно когда кровь берут из пуповины сразу после рождения. Анаэробные грамположительные кокки (пептококки и пегггострептококки) часто являются возбудителями анаэробной инфекции половой системы и бактериемии новорожденных. Обнаружено что липополисахариды грамотрицательных анаэробных бактерий провоцируют иммунный конфликт между организмом матери и плодом, проявляющийся в форме гемолитической болезни новорожденного. Удельный вес анаэробной микрофлоры при остром послеродовом эндометрите составляет 70 - 93% (Брилис В. И., с соавт., 1986; Цвелев Ю.В. с соавт., 1988). Наиболее часто обнаруживались бактероиды (41,5%) и грамположительные кокки (Цвелев Ю.А. с соавт., 1998; Брилис В.И., 1983).
Изучение вирулентности анаэробов
Сведения авторов о частоте выделения анаэробных бактерий от больных людей представлены в первой главе. Эти данные разноречивы.
Так, по данным L. G. Keith et all. (1988), среди нормальной микрофлоры цервикапьного канала доминируют Clostridium perfnngens, Peptococcus и Bacteroides fragilis, количество которых резко возрастает при цервиците, в меньшей степени микрофлора представлена пептострептококками, фузобак-териями и другими видами.
По данным R. Trevoux et al. (1977 г) среди анаэробов женских половых органов чаще других встречаются три основных вида микроорганизмов: бактероиды - 57-78%; пептококки и пептострептококки - 33-69%; и клостридии - 5%. По данным J. Bartlett et al. (1977 г.) - ранговая последовательность бактериальных видов была следующей: анаэробные лактобактерии Peptococcus Bacteroides Eubacterium. Очевидно, постоянное присутствие анаэробов в церв икал ьном канале предрасполагает к развитию анаэробных инфекционных процессов. Данные о выделении анаэробных микроорганизмов при острых кишечных инфекциях очень скудны. В основном выделялись Clostridium perfnngens, Clostridium botulinum, Clostridium difficili. К настоящему времени роль отдельных возбудителей в микробных ассоциациях изучена недостаточно. В этиологии и патогенезе анаэробной инфекции, по мнению В.И. Кочеровец (1990 г), ведущее значение следует придавать бактериальному синергизму, при котором главную роль играют не-спорообразующие анаэробные микроорганизмы. Все вышеизложенное послужило основанием для разрешения следующих задач: 1. Определить частоту выделения анаэробов от больных гнойно-воспалительными хирургическими инфекциями, от больных гнойно-воспалительными заболеваниями гениталий, от больных с поражением желудочно-кишечного тракта. 2. Сопоставить частоту выделения анаэробов у больных и здоровых людей. В соответствии с данными задачами изучали видовой состав анаэробной микрофлоры у 291 больного гнойно-воспалительными заболеваниями гениталий, хирургических больных раневой инфекцией и больных с нарушениями желудочно-кишечного тракта. В качестве контроля исследовали содержимое цервикального канала здоровых женщин и стула здоровых взрослых и детей различного возраста (255 человек). Данные, представленные в таблице 5, свидетельствуют, что у здоровых женщин не обнаружено 2 вида: Bacteroides ovatus и Actinomyces israiln. У детей всех возрастов не выделены 4 вида анаэробов: Bacteroides ovatus, Bacteroides urealyticus, Actinomyces israilii, Veillonella parvula. У больных женщин с гнойно-воспалительными заболеваниями гениталий не обнаружено 2 вида анаэробов: Bacteroides vulgatus и Actinomyces israilii. Последний вид не обнаружен и у здоровых женщин. У больных с гнойно-воспалительными заболеваниями гениталий чаще выделяли Bacteroides fragilis (42,8%). У здоровых женщин данный вид бактерий обнаружен в 18,9 %. Несколько чаще изолировались представители рода Peptostreptococ-cus - у больных женщин 30,5% и 23,2% - у здоровых женщин. Следует также отметить, что еще 3 вида анаэробных бактерий выделялись у больных женщин с одинаковой частотой (3,6 %) - Bacteroides ovatus (этот вид вообще не обнаружен у здоровых женщин), Bacteroides urealyticus и Veillonella parvula. В гнойных хирургических ранах наиболее часто обнаруживались Bacteroides fragilis (37,4 %) и Peptostreptococcus (42,9 %). Bacteroides ovatus, Bacteroides vulgatus и Bacteroides urealyticus в содержимом ран не обнаруживали, У детей (от 0 до 1 года) с поражением желудочно-кишечного тракта количество анаэробных неспорообразующих микробов ниже (66,7 %), чем у здоровых детей того же возраста (77%). Наиболее часто обнаруживали у больных детей представителей рода Peptosfreptococcus (23,7 %); у здоровых детей этого возраста данные микроорганизмы встречались в 17,5 % случаев. Bacteroides vulgatus обнаруживали как у здоровых, так и у детей с поражением желудочно-кишечного тракта. Несколько чаще у больных детей первого года жизни обнаруживали Bacteroides fragilis (52,6 %), у здоровых детей того же возраста этот микроорганизм выделялся в 47,5 % случаев. У детей от 1 года до 14 лет, больных острыми кишечными инфекциями, наиболее часто выделялись Fusobacterium nucleatum (25 %) и Peptostrepococcus (25 %), в то время как у здоровых детей этого возраста данные микроорганизмы выделялись в 4,4 % и 13,3 % случаев соответственно. У взрослых с кишечными инфекциями анаэробные неспорообразующие микробы обнаруживались реже (31,5%), чем у здоровых людей (84%). Как у взрослых здоровых, так и у больных взрослых людей не обнаруживались Bacteroides ovatus, Actinomyces israilii и VeilloneUa parvula. Только у пациентов с кишечными инфекциями выделены Bacteroides urealyticus (7,1 %), Peptostreptococcus spp. у взрослых, больных острыми кишечными инфекциями, отсутствовали, а вид Bacteroides fragilis у данных больных выделяли только в 50 % случаев.
Спорообразующие анаэробные микробы (рисунок 3) от больных с гнойно-воспалительными заболеваниями гениталий обнаружены у 30 % обследованных против 17,4 % у здоровых женщин. Наиболее часто обнаруживали (таблица 6) Clostridium septicum (41,7 %), Clostridium histolyticum (16,7 %), perfringens и sordellii (no 12,5 %). При этом Clostridium perfringens у здоровых женщин не обнаруживали, a Clostridium tetani не выявлены ни у здоровых, ни у больных женщин гнойно-воспалительными заболеваниями гениталий.
От 77 больных с гнойными хирургическими ранами спектр спорообразу-ющих анаэробных микробов более широк: обнаруживались виды Clostridium septicum (преобладающий вид - 38,4 % случаев), Clostridium novyi, Clostridium histolyticum, С. perfringens, С. sporogenes, С. sordellii, С. tetani. При этом С. tetani, С. sporogenes выделяли в чистой культуре.
Видовой состав анаэробов у больных и здоровых людей
Группа анаэробов включает в себя спорообразующие (клостридиаль-ные) и неспорообразуюшие (неклостридиальные) анаэробы.
Морфологической особенностью клостридиальных анаэробных микроорганизмов является способность образовывать споры (точнее эндоспоры), которые вызывают утолщение клеток, придавая им вид веретена.
Выделенные культуры рода Clostridium в мазках из колоний представляли собой грамположительные подвижные палочки, с овальными или круглыми эндоспорами. Морфологические свойства выделенных нами споро-образующих микроорганизмов были следующие: - С. septicum - полиморфные палочки, яйцевидные, веретеновидные, образуют цепочки. Среди них не были выделены штаммы, образующие капсулу. - С. perfringens - крупные палочки с обрубленными концами. Образовывали капсулу. Из 8 штаммов С. perfringens, выделенных от больных с острыми кишечными инфекциями у 5 (62,5%) была обнаружена капсула, а у больных гнойно-воспалительными заболеваниями из 13 выделенных штаммов в 77 % случаев обнаруживалась капсула. В контрольной группе из фекалий здоровых людей из 4 выделенных штаммов этого вида только 1 (25%) образовывал капсулу (таблица 10). - С. histolyticum - грамположительные палочки, в мазках образовывали пары и цепочки, субтерминальные споры, не деформирующие клетку. - С. novyi - крупные или слегка изогнутые грамположительные палочки, обладали выраженным полиморфизмом (некоторые образовывали короткиецепочки или нити), споры овальные расположены субтерминально, капсул выявлено не было. - С. sordellii - грамположительные палочки, располагались парами или цепочками, капсула не выявлена. - С. sporogenes - грамположительные палочки, располагались одиночно, капсул выявлено не было. - С. tetani - грамположительные палочки с закругленными концами, располагались одиночно или цепочками, споры круглые, располагались терминально, их диаметр превышал толщину бактерий, вследствие чего клетки имели форму теннисной ракетки или барабанной палочки, капсул выявлено не было. Грамположительные анаэробные кокки рода Peptococcus и Peptostrepto-coccus имели морфологию неподвижных сферических клеток, которые располагались парами, тетрадами, беспорядочными скоплениями или цепочками. Капсулы у представителей этих бактерий также не обнаружены. Среди грамотрицательных анаэробных микроорганизмов были выделены следующие роды: Bacteroides, Prevotella, Veillonella, Fusobacterium, Actinomyces. У рода Bacteroides выделенные микроорганизмы отличались вариабельными по своим размерам палочковидными бактериями, отличающиеся большой степенью полиморфизма. Бактерии В. fragilis в мазках из колоний -выглядели в виде плеоморфных палочек. По Граму окрашивались иногда неравномерно. Из 39 штаммов, выделенных от больных гнойно-воспалительными заболеваниями, только у 5 (12,8%) отсутствовала капсула. При острых кишечных инфекциях все выделенные В. fragilis обладали капсулой. В контрольной группе из 12 штаммов В. fragilis, выделенных из цервикаль-ного канала - 4 (33,3%) обладали капсулой, а из 59 штаммов В. fragilis, выделенных из фекалий здоровых людей, 11 (18,6%) птгаммов обладали капсулой (таблица 10). Эти данные не противоречат данным литературы. Так, A.J. Lindner et al., в 1978 г. в клинических исследованиях показали, что от больных с гнойно-воспалительными процессами чаще выделяются капсульные штаммы группы В. fragilis. A.Brook et al. (1984) установили, что капсульные варианты В. fragilis более устойчивы к фагоцитозу, чем бескапсульные. Из других бактероидов, выделенных от больных с гнойно-воспалительными заболеваниями, наблюдалось наличие капсулы. Из 5 штаммов В. не fragilis, выделенных от больных с острыми кишечными инфекциями, 3 обладали капсулой. В контрольной группе капсулообразование встречалось реже. Приведенные данные свидетельствуют, что практически все виды бактероидов способны образовывать капсулу. Следовательно - капсулообразование -характерный признак, капсула придает бактероидам определенные биологические особенности, обеспечивающие повышение патогенных свойств данных бактерий. Штамм Prevotella mellaninogenicus, выделенный из фекалий больного острой кишечной инфекцией, образовывал капсулу, в мазках представлял собой короткие грамотрицательные палочки. Штаммы Veillonella parvula, выделенные от больных и здоровых людей в мазках из колоний - были в виде мелких, неподвижных кокковидных клеток, располагающихся парами, беспорядочными скоплениями или короткими цепочками, не образующие капсулу и споры. Выделенный из раны Actinomyces israilii в мазках из колоний был в виде длинных тонких нитей, имел разветвления, капсулу не образовывал. Штаммы Fusobacterium nucleatum в мазках из колоний выглядели как длинные клетки с заостренными концами, веретенообразной формы, капсулы и спор не образовывали. Данные о капсулообразовании, изложенные выше, демонстрирует таблица 10. Как считает S.M.Funegoid (1977), нельзя утверждать, что кислород обладает прямой токсичностью по отношению ко всем анаэробам. Известно, что чувствительность к кислороду различных анаэробных бактерий широко варьирует. Даже среди облигатных анаэробов обнаруживается спектр устойчивости к кислороду от крайне чувствительных до умеренных, способных выдерживать низкие концентрации кислорода. T.Rosebury (1962) обнаружил, что рост отдельных штаммов анаэробов зависит от концентрации кислорода. Так, один штамм В. melaninogenica хорошо рос в присутствии 0,1% Ог, но не рос при 4%. Аналогичные результаты были получены при изучении штаммов С. novyi, С. tetani, В. fragilis, F. nucleatum.
Одна из теорий анаэробиоза была предложена J. Мс Cord, B.Keele et І. Fridovich (1971), которые установили, что облигатные анаэробы, не обладавшие каталазной активностью, не содержали и фермента - супер-оксиддисмутазы (СОД). СОД инактивирует Н2О2 в присутствии воздуха. Выработка СОД не является обязательной для всех анаэробов и далеко не всегда защищает их от губительного действия кислорода.
Исследования F. Tally et al. (1977) показали, что существует общая, но не обязательная, корреляция между степенью аэротолерантности и уровнем СОД, Крайне чувствительные к присутствию Ог анаэробы не содержали этого фермента, тогда как многие патогенные возбудители, выделенные из ран, им обладали.
Анаэробные микроорганизмы требуют особых условий культивирования, требовательны к питательным средам. Для их роста необходимо добавление гемина, витамина Ki (или менадиона). Оптимальный рН для роста спорообразующих анаэробов 7,3-7,6. Спорообразование лучше происходит при сдвиге рН в щелочную сторону.
Персистирующая способность анаэробов при гнойно-воспалительном процессе в организме человека
Анаэробные микроорганизмы составляют абсолютное большинство нормальной микрофлоры человеческого тела. Успехи, достигнутые в их изучении, убедительно показывают значимость этой группы микроорганизмов как в поддержании нормального состояния различных экониш тела человека (Шендеров Б.А., 1996; Stephent A.M., Gumings J.H., 1980; Banwell J.G. et ai., 1981), так и в этиопатогенезе широкого круга заболеваний человека (Hentges D.J., 1986).
Полученные нами данные о выделении анаэробных микроорганизмов у больных с гнойно-воспалительными заболеваниями, свидетельствуют об их причастности к патологическому процессу гнойно-воспалительного характера у людей. По данным литературы (Кира Е.Ф., 1999; Коршунов В.М. с соавт., 1999; Кочеровец В.И., 1990) основная роль возбудителей инфекционных заболеваний гениталий на сегодняшний день принадлежит ассоциациям микробных клеток: стафилококков, стрептококков, энтеробактерий, хламидий, микоплазм, гонококков, анаэробов и аэробов (Савельева Й.С., 1999). Как подтверждает большинство исследователей, при гнойных воспалительных заболеваниях придатков наиболее часто выделяют облигатные анаэробы, в частности бактероиды, реже - факультативные анаэробные бактерии, которые, как правило, сочетаются с грамположительными и гра-мотрицательными анаэробами. (Цвелев Ю.В., Кира Є.Ф., Баскаков В.П. и др.,1998; Цвелев Ю.В., Кира Е.Ф., Кочеровец В.И., 1995).
Полученные нами данные о количественном содержании анаэробных бактерий и факторах их патогенности в стуле больных желудочно-кишечными заболеваниями свидетельствуют об этиологической роли выделенных анаэробов в возникновении острой кишечной инфекции.
В связи с вышесказанным следует, что адекватный режим антибактериальной терапии гнойно-воспалительных и желудочно-кишечных заболеваний должен обязательно охватывать анаэробные микроорганизмы.
Основным механизмом развития гнойно-воспалительных и желудочно-кишечных заболеваний, этиологическим фактором которых выступают анаэробные микроорганизмы, является эндогенный путь инфицирования.
Нерациональное назначение антибактериальных препаратов - наиболее частая причина нарушения состава нормальной микрофлоры, что ведет к еще большему углублению нарушений баланса между макроорганизмом и его микрофлорой, с одной стороны, и нарушениям равновесия внутри микробных ассоциаций (т.е. дисбиотическими процессами) с другой стороны.
Поэтому определяющим фактором при выборе антибактериального препарата является его антимикробная активность в отношении анаэробов -возбудителей гнойно-воспалительных и желудочно-кишечных заболеваний. Рациональное использование антибиотиков абсолютно необходимо для предупреждения развития резистентности у анаэробных микроорганизмов.
По заключению Б.Р. Гельфанда (1999) неадекватное назначение антибиотиков увеличивает смертность от перитонита минимум на 20%. Кроме того, по данным этого же автора, неадекватная антибактериальная терапия имеет большое фармакоэкономическое значение, т.к. стоимость лекарственного лечения перитонита увеличивается на 89%, а общая стоимость стационарного лечения - на 30%. Приведенные данные свидетельствуют, что своевременная и адекватная антибиотикотерапия определяет не только дальнейший прогноз при гаойно-воспалителъных и желудочно-кишечных заболеваниях, но и имеет существенное экономическое значение для медицинских учреждений. Так же адекватная антибиотикопрофилактика снижает частоту или полностью предупреждает развитие послеоперационных гнойных осложнений и уменьшает прогнозируемую общую стоимость лечения.
Выбор оптимальной схемы терапии может быть основан на опубликованных данных о чувствительности анаэробов к антимикробным препаратам (Гельфанд В.Д. с соавт., 2000; Борисова O.K. с соавт., 1989; Титов Л.П., 1998). Тем не менее, учитывая различную устойчивость в различных регионах и даже больницах, следует изучать распространение резистентности анаэробов в отдельных стационарах и выявлять появившиеся устойчивые штаммы. Развитие устойчивости к антибиотикам у анаэробных бактерий значительно влияет на выбор антимикробных препаратов для эмпирической терапии. В этой связи, согласно нашим данным, рекомендуется проводить экстренную терапию анаэробной инфекции имипенемом и метро-нидазолом.
При лечении гнойно-воспалительных и кишечных заболеваний, обусловленных или осложненных бесспоровыми анаэробами рода Bacteroides и Fusobacrerium, предпочтительнее использовать по данным нашей работы следующие препараты: метронидазол, имипенем, азитромицин, клиндами-цин, левомицетин. При выделении от больных с данными заболеваниями анаэробных грамположительных кокков целесообразно, по полученным нами данным, использование таких препаратов как: имипенем, азитромицин, клиндамицин, метронидазол. Анаэробные грамотрицательные кокки рода Veillonella, выделенные при различных патологических процессах, проявили высокую чувствительность в отношении пенициллина, цефокситина, цефотаксима, азитромицина; не было выделено штаммов, устойчивых к имипенему, клиндамицину и мет-ронидазолу. При лечении гнойно-воспалительных и желудочно-кишечных заболеваний, обусловленных клостридиями, целесообразнее использовать цефо-кситин, эритромицин, азитромицин, клиндамицин, метронидазол и ими-пенем. Анаэробные микроорганизмы, выделенные от больных с гнойно-воспалительными и желудочно-кишечными инфекциями, проявили низкую чувствительность к таким антибактериальным препаратам, как ампициллин, тетрациклин, пенициллин; в связи с этим назначение данных препаратов для лечения анаэробной инфекции представляется нецелесообразным.
Использование р-лактамных антибиотиков при лечении гнойно-воспалительных и желудочно-кишечных заболеваний, обусловленных или осложненных анаэробами, необходимо начинать только после исследования продукции В-лактамазы данными микроорганизмами, так как наличие штаммов, продуцирующих р-лактамазу, при терапии такими антибактериальными препаратами может стать наиболее важным фактором распространения резистентных штаммов среди других пациентов в условиях стационара и привести к развитию внутрибольничной инфекции. Помимо этого, по данным 1. Brook (1996), р-лактамаза, продуцируемая В. fragilis при совместном культивировании последнего с гемолитическими стрептококками, в несколько раз повышает его устойчивость к пенициллину и кефлину.
Нами не выделены штаммы, устойчивые к Р-лактамным антибиотикам от больных с гнойно-воспалительными гинекологическими заболеваниями среди штаммов Peptococcus niger. Штаммы анаэробных бактерий, выделенные от больных с желудочно-кишечными заболеваниями, обладали продукцией р-лактамазы.
