Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Биология возбудителя 13
1.2 .Распространенность возбудителя 16
1.3. Факторы патогенности Y.enterocoUtica и их генетические детерминанты 20
1.3.1. Факторы патогенности, кодируемые плазмидой вирулентности 20
1.3.2. Факторы патогенности, кодируемые хромосомными генами 27
1.3.3. Факторы токсигенности Y. enterocolitica 30
1.3.4. Экзоферменты Y. enterocolitica как факторы патогенности 31
1.4. Дифференциация патогенных и непатогенных иерсиний : 32
1.4.1. Применение полимеразной цепной реакции для идентификации
патогенных Y.enterocolitica 33
1.4.2. Возможности плазмидного скрининга 36
1.4.3. Применение метода ДНК-зондирования 37
Экспериментальная часть 38
Глава 2. Материал и методы 38
2.1. Штаммы 38
2.2. Питательные среды и сыворотки 40
2.3. Определение биохимических свойств ...40
2.4. Определение маркеров вирулентности 43
2.5.Плазмидный скрининг 44
2.6. Полимеразная цепная реакция 45
Глава 3. Изучение биохимических свойств и определение биоваров Yersinia enterocolitica, изолированных от сельскохозяйственных животных 51
Глава 4. Исследование штаммов возбудителя кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных генетическими методами 58
4.1. Плазмидный скрининг 59
4.2. Полимеразная цепная реакция 64
4.3. Результаты ПЦР - анализа 68
Заключение 75
Выводы 83
Список использованных литературных источников... 85
Приложение 100
- Факторы патогенности Y.enterocoUtica и их генетические детерминанты
- Факторы патогенности, кодируемые хромосомными генами
- Питательные среды и сыворотки
- Плазмидный скрининг
Введение к работе
Актуальность темы
Работа посвящена изучению возбудителей кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных. Иерсиниоз — инфекционная болезнь человека и животных, вызываемая Y.enterocolitica, передающаяся алиментарным путем и характеризующаяся интоксикацией, преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта; при генерализованных формах — полиорганным поражением и склонностью к обострениям, рецидивам и хронизации процесса.
Иерсиниоз в соответствии с Международной статистической классификацией болезней (1995) регистрируется под символами: А046 —-энтерит, вызванный Y.enterocolitica, или А28.2 — экстраинтестинальный иерсиниоз.
Заболевание широко распространено во многих странах мира. Наиболее часто эта инфекция встречается в странах Западной и Северной Европы, а также Америки: Великобритании, США, Канаде, Японии, России. В настоящее время наблюдается изменение структуры возбудителей ОКИ бактериальной природы, на первый план в некоторых странах (ФРГ, Дания, Финляндия) выдвигаются Campylobacter и Yersinia (Померанцев, Васильев, 1998; Куликовский, 1984).
В России первый случай кишечного иерсиниоза человека был зарегистрирован в 1968 году (Белова, Ющенко, 1968), официальный учет этой инфекции введен Минздравом в 1987 году. В настоящее время заболеваемость в некоторых регионах (Сибирь, Дальний Восток, Северо-Запад) составляет 3-5 случаев на 100 тыс. населения. Тридцатилетний период интенсивного изучения иерсинии позволил детально охарактеризовать свойства возбудителей кишечного иерсиниоза человека.
Y.enterocolitica - вид, представляющий собой разнородную группу микроорганизмов. По биохимическим свойствам различают 5 биовариантов
6 (первый биовар разделен на 1А и 1В), по антигенной структуре выделяют более 70 серовариантов. Далеко не все представители вида являются патогенными (Wauters et al., 1991). Эти микроорганизмы широко распространены в природе и часто выделяются из объектов внешней среды. Поэтому остается актуальным вопрос о подтверждении патогенносте выделенной культуры.' Помимо определения серогруппы и биоварианта рекомендуется исследовать факторы патогенности. Литературные данные свидетельствуют о полидетерминантной природе различных структур микроорганизма, обеспечивающих реализацию инфекционного процесса. Факторы патогенности Y.enterocolitica достаточно хорошо изучены, определены их генетические детерминанты. Описаны хромосомные гены и их продукты, участвующие в развитии инфекционного процесса. По современным данным литературы проявление патогенных свойств связано с присутствием в клетках Y.enterocolitica плазмиды pYV молекулярной массой 45-47 мДа и экспрессией кодируемых ею белков (Gemsky, Lazere, Casey, 1980; Portnoy, Moseley, Falkow, 1981; Ценева, Солодовникова, Воскресенская, 2002; Смирнов, 2004). В Методических рекомендациях Министерства Здравоохранения РФ по диагностике кишечного иерсиниоза (Псевдотуберкулез, иерсиниоз, Санкт-Петербург, 2005) для идентификации вирулентных иерсиний предлагается использовать фенотипические методы -определять маркеры вирулентности, агглютинационные тесты - постановку реакции агглютинации с сывороткой к вирулентным иерсиниям, а также молекулярно-генетические методы - полимеразную цепную реакцию. Имеются сообщения о возможности применения метода генетического зондирования (Кутырев и др., 1989, Попов и др., 1991).
По современным воззрениям, источником инфекции при кишечном иерсиниозе являются больные сельскохозяйственные, домашние, дикие животные и грызуны, а факторами передачи - продукты животноводства и корма. Поэтому роль Y.enterocolitica в патологии сельскохозяйственных животных и свойства возбудителя требуют всестороннего изучения.
7 Регистрация кишечного иерсиниоза у сельскохозяйственных животных в РФ введена с 1996 году (Иерсиниозы, СП, ВП, 1996). Эпизоотологические исследования свидетельствуют о возрастающей роли Y.enterocolitica в желудочно-кишечной патологии сельскохозяйственных животных. Иерсиниоз основных видов животных описан в различных регионах РФ: Дальневосточном регионе, Нижегородской, Ульяновской, Вологодской, Ленинградской и других областях (Кирьянов, Савчук, 1987; Тихонов, 1999; Корчагин, 2002; Псевдотуберкулез и кишечный иерсиниоз, Вологда, 2003). Из сельскохозяйственных животных наиболее важную роль играют свиньи и КРС, меньшую - МРС, лошади. Описаны случаи кишечного иерсиниоза среди собак, кошек и других домашних животных (Piatt-Samoraj, Szweda, Siwicki, 2000; Vokoim, 1985; Hayashidani et al., 1995; Корчагин, Васильев, 2002). Имеются наблюдения о заражении от диких животных (кабанов) (Shayegani, Stone, DeForge, 1986; Nattermann, Dedek, Loepelmann, 1986), a также от грызунов, которые часто инфицируют своими экскрементами корма и пищевые продукты (Калошина, Ющенко, Шестопалов, 1989; Singh, Sharma, Singh, 1994; Hayashidani, Kitahara, Ogawa, 1994). Значительное количество работ посвящено изучению кишечного иерсиниоза у свиней (Кирьянов, Савчук, 1989; Родионова, Муравьев, Малофеева, 1999; Тихонов, 1999; Корчагин, 2002, Прунтова и др., 2000; Nattermann, Horsch, Seeger, 1985; Markic, 1986; Mickova, Konecny, 1987; Hugenberg J.,1999, Okoroafor, Adesiyun, Agbonlahor, 1988). Почти на всех территориях от свиней изолируют Y.enterocolitica серогрупп ОЗ, 09, 05,27, 08, 06,30, 05, 07, ОН, 012, 017, 019, 04,32. Доказано, что свиньи являются основным источником иерсиниоза. От крупного рогатого скота выделяют иерсинии серогрупп 012, 013, 018, 07,8, 04, 05,27, ОЗ, 08.
К сожалению, количество отечественных работ по изучению спектра биоваров «ветеринарных» штаммов Y.enterocolitica, а также по исследованию их генетическими методами, невелико. Отсутствует нормативно-техническая документация по кишечному иерсиниозу сельскохозяйственных животных,
8 нет диагностических препаратов, утвержденных Министерством сельского хозяйства РФ. Единственные «Методические указания по лабораторной диагностике иерсиниоза животных и обнаружению возбудителя болезни в мясном сырье, молоке и растительных кормах», выпущенные Министерством сельского хозяйства, официально утверждены лишь в октябре этого года, и только начинают действовать. Все перечисленные обстоятельства делают необходимым глубокое и всестороннее изучение ветеринарного аспекта проблемы кишечного иерсиниоза в нашей стране, особенно генетических особенностей Y.enterocolitica в связи с вопросами эпизоотологии и эпидемиологии. Кишечный иерсиниоз по-прежнему остается инфекцией, мало известной работникам животноводства, данные о заболеваемости среди сельскохозяйственных животных неполны и отрывочны.
В Саратовской области существование кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных было доказано Зыкиным Л.Ф. и сотр. в 1997 году (Зыкин Л.Ф. и др., 1997). С этого времени на кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы Саратовского ГАУ им Н.И.Вавилова ведется планомерная работа по изучению кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных. С 1997 по 2005 год были обследованы животные нескольких районов Саратовской области: Саратовского, Советского, Базарно-Карабулакского, Энгельского, Марксовского, Ново-Бурасского, Красноармейского, Калининского и Петровского. При иммунологическом обследовании свиней и КРС в высоком проценте случаев выявлены антитела, а затем бактериологическим методом были выделены культуры Y.enterocolitica от поросят, КРС, из молока коров, а также из мяса и мясопродуктов (Хапцев, 2000; Гвинджилия, Зыкин, 2002; Гвинджилия, 2002; Осипчук, 2003; Киселева, Зыкин, 2004; Киселева, 2005). Большая часть культур выделена в Петровском районе Саратовской области, что согласуется с данными Областного Центра санэпиднадзора за 2001 год, по которым в этом же районе были выявлены лица (6 человек) с
9 диагностическими титрами антител к Y.enterocoUtica 03 серогруппы. Это еще раз подтверждает, что при заболевании людей основным источником инфекции являются сельскохозяйственные животные, а фактором передачи -продукты животноводства.
После выявления кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных в Саратовской области и выделения культур Y.enterocoUtica, выяснения роли молока и мяса в передаче возбудителя (Зыкин и др., 1997; Хапцев, 2000; Осипчук, 2003; Киселева, 2005), возникла необходимость подробно изучить свойства штаммов Y.enterocoUtica, изолированных из разных источников, и определить их генетические особенности.
Цель работы - выяснение генетических особенностей (наличия плазмиды pYV и хромосомного гена inv) штаммов Y. enterocolitica, выделенных от больных и павших поросят, а также из молока КРС, и биотипирование этих штаммов. Задачи исследования:
Определить биоварианты штаммов Y.enterocoUtica, изолированных от больных и павших поросят и из молока коров.
Провести плазмидный скрининг культур различного происхождения.
Исследовать культуры Y.enterocoUtica методом ПЦР, применяя две коммерческие тест-системы: для выявления хромосомного гена inv и ДНК плазмиды pYV.
Научная новизна
1. Впервые определен спектр биовариантов Y.enterocoUtica, циркулирующих среди сельскохозяйственных животных Саратовской области. От свиней и крупного рогатого скота выделяются Y.enterocoUtica первого (А и В), второго, третьего и
10 четвертого биовариантов; преобладают биовары 4 и 1А. Культуры, изолированные от павших поросят и от поросят с признаками диареи, чаще относятся к четвертому биовару, и лишь некоторые - к биоварам 1А и 3. Среди штаммов Y. enter-ocolitica, выделенных из молока коров, преобладают биовары 1А и 4, реже встречаются второй и третий.
Установлено, что хромосомный ген inv одинаково распространен среди Y.enterocolitica, изолированных от больных и павших поросят и из молока коров.
Доказано, что плазмида вирулентности pYV присутствует лишь в клетках Y.enterocolitica, изолированных от больных и павших поросят. Культуры, выделенные из молока КРС, являются бесплазмидными.
Показано, что для определения плазмидного профиля можно использовать плазмидный скрининг, а для выявления ДНК плазмиды вирулентности pYV ПЦР-анализ с тест-системой «ДиаГен- Yersinia».
Практическая значимость
По результатам исследований подготовлены методические рекомендации «Идентификация патогенных штаммов возбудителя кишечного иерсиниоза генетическими методами для оценки их эпидемиологической и эпизоотологической значимости», утвержденные МК ФВМ ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ» (протокол № 5 от 16 ноября 2005 г).
Материалы диссертации используются в учебном процессе по курсам «Ветеринарная микробиология и иммунология» и «Клиническая микробиология».
Основные положения, выносимые на защиту
1. Среди сельскохозяйственных животных Саратовской области
циркулируют Y,enterocolitica первого (А и В), второго, третьего и четвертого биовариантов; преобладают биовары 4 и 1А. Культуры, изолированные от павших поросят и от поросят с признаками диареи, чаще относятся к четвертому биовару, и лишь некоторые - к биоварам 1А и 3. Среди штаммов Y.enterocolitica, выделенных из молока коров, преобладают биовары 1А и 4, реже встречаются второй и третий.
Хромосомный ген invt кодирующий синтез белка инвазина, встречается как у Y.enterocolitica, изолированных от больных и павших поросят, так и у культур кишечно-иерсиниозного микроба, выделенных из молока коров.
Культуры Y.enterocolitica , изолированные от больных и павших поросят, являются носителями плазмиды вирулентности pYV, которая была обнаружена у семи из шестнадцати культур. Ни у одного из двадцати девяти «молочных» штаммов эта плазмида не выявлена. Для подтверждения патогенности с целью решения вопроса об эпизоотической и эпидемической значимости выделенной культуры Y.enterocolitica в комплексе с определением принадлежности к био- и серогруппе и наличия маркеров вирулентности рекомендуется выявлять присутствие в клетке плазмиды вирулентности pYV.
Плазмидный анализ и ПЦР с тест-системой «ДиаГен-Геге/ш'й» для выявления ДНК плазмиды pYV в равной степени могут использоваться для выявления присутствия в клетках плазмиды вирулентности pYV, так как их результаты одинаковы.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы доложены на Межрегиональной научной конференции молодых ученых и специалистов системы АПК Приволжского Федерального округа «Вавиловские чтения» (Саратов, 2003),
на научно-практической конференции РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2004), на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы микробиологии и инфекционной патологии животных» (Омск, 2004), на Научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов по итогам научно-исследовательской и учебно-методической работы за 2004 год (СГАУ им. Н.И. Вавилова, Саратов, 2005).
Материалы диссертации представлены в отчетах НИР кафедры микробиологии и ветсанэкспертизы ИВМиБ за 2003-2005 годы.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 5 работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка использованной литературы, включающего 137 наименований, в том числе 86 иностранных, и приложения. Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста, иллюстрирована 13 таблицами и 9 рисунками.
Работа выполнена на кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы института ветеринарной медицины и биотехнологии ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ имени Н.И.Вавилова» в рамках основной темы направления работы кафедры: НИР № 21/ОЗВ «Разработка и внедрение эффективных методов дифференциальной диагностики туберкулеза, кишечного иерсиниоза, псевдотуберкулеза, листериоза и лейкоза сельскохозяйственных животных в Саратовской области» (2002-2003 гг).
Факторы патогенности Y.enterocoUtica и их генетические детерминанты
Как уже отмечалось, для максимального проявления патогенных свойств необходимы присутствие в клетках иерсиний плазмиды pYV и экспрессия кодируемых ею белков. Первые сообщения об этом опубликованы в 1980-1981 годах. (Gemsky, Lazere, Casey, 1980; Portnoy, Moseley, Falkow, 1981). Размеры плазмиды составляют около 70 тысяч пар оснований. Плазмида вирулентности иерсиний не является конъюгативной. Кроме того, она несовместима с половым фактором F, то есть pYV не способна самостоятельно проникать в клетки или переноситься в них каким-либо агентом. Доказано, что в вирулентных штаммах Y.enterocolitica плазмида может существовать в интегрированном в хромосому состоянии. При этом сохраняется экспрессия всех детерминант патогенности, необходимых для реализации инфекционного процесса. По-видимому, собственные инсерционные элементы иерсиний создают протяженные гомологичные области, по которым может происходить объединение плазмидной ДНК с хромосомной (Гинцбург и др., 1989).
Известно, что штаммы иерсиний, обладающие плазмидой вирулентности, проявляют следующие фенотипические признаки, зависящие от температуры среды: -клеточную адгезию, аутоагглютинацию и поверхностную агглютинацию; -зависимость роста от концентрации Са + в среде культивирования; -синтез белков наружной мембраны (OMPs), в том числе V- и W-антигенов; -высвобождение белков в среду культивирования; -повышенную гидрофобность клеточной поверхности. Организация pYV
Белки, кодируемые плазмидой вирулентности иерсиний, можно разделить на следующие группы (Ценева, Солодовникова, Воскресенская, 2002; Kwaga, Iversen, 1993). 1. Белок YadА (адгезии) и липопротеин YlpA. 2. Белки Yop, (от Yersinia outer protein) - известно примерно 13 полипептидов, около 10 белков обнаруживаются в культуральной жидкости; в некоторых работах их классифицируют как Rp, (released proteins), или как секретируемые белки. Эти белки делят, по крайней мере, на три группы: а) белки-эффекторы направляются внутрь клетки-мишени (YopE, YopH, YpkA/YopO, YopJ/YopP, YopM, YopT); б) белки, необходимые для переноса эффекторов через клеточную мембрану хозяина - порообразующие YopB и YopD, вспомогательный LcrV; в) белки, участвующие в регуляции переноса эффекторов внутрь клетки-мишени - YopN/LcrE, ТуеА, LcrG, (LcrV), YopK/YopQ. 3. Белки, образующие аппарат секреции Yop, кодируются 20 генами ysc (Yersinia secretion). 4. Белки, регулирующие экспрессию генов уор.
К настоящему времени плазмида вирулентности полностью секвенирована у Y.enterocolitica, а также у двух других патогенных видов иерсинии - Y. pestis и Y. pseudotuberculosis . Достаточно подробно изучены расположение генов и их регуляция.
Гены организованы в несколько моно- и полицистронных оперонов, Полицистронные опероны помимо уор, также кодируют белки, участвующие в регуляцииУор, а также шапероны (внутриклеточные переносчики) для уор, которые не имеют сигнальной последовательности. Дополнительные полицистронные опероны кодируют другие регуляторные белки, а также белки аппарата секреции Yop. Все изученные уор опероны и некоторые регуляторные опероны объединены в так называемый уор регулон (или вирулон), который в конечном итоге находится под контролем белка YmoA.
Адгезии и липопротеин YadA (Yersinia adhesin А: первоначально Yopl. YopA) - белок, который синтезируется в клетках независимо от наличия или отсутствия в среде Са вызывает аутоагглютинацию иерсинии и может рассматриваться в качестве ведущего адгезина иерсинии, необходимого для их прикрепления к эукариотическим клеткам. Установлено, что одна из функций белка YadA заключается в защите клеток иерсинии от обезвреживающего действия человеческой сыворотки.
YlpA - липопротеин иерсинии. Он также входит в состав Yop регулона и экспрессируется при температуре 37 С и в отсутствие Са2+.
Факторы патогенности, кодируемые хромосомными генами
Белок инвазии обеспечивает не только прикрепление к поверхности, но и проникновение внутрь клеток хозяина. Его кодирует хромосомный ген inv.
Белок Ail кодируется хромосомой и также опосредует адгезию и инвазию. Однако его активность более специфична по сравнению с инвазином.
Продукт гена inv у Y. enterocoUtica охарактеризован. Он состоит из 835 аминокислот, имеет массу 100 кДа, локализован в наружной мембране и также способствует прикреплению к клеткам хозяина и инвазии.
Ген inv Y. enterocoUtica схож с z wv-геном из Y. pseudotuberculosis (гомология составляет 73 %). Инвазины обоих видов имеют очень сходные аминокислотные последовательности на С-терминальном участке (общая гомологичность составляет 77 %). У инвазнна из Y. pseudotuberculosis два небольших участка на N-конце и последовательность в середине белка из 99 аминокислот, не гомологичны инвазину Y entericolitica.
При исследовании инвазина из Y. enterocoUtica было обнаружено, что он имеет единственный участок в середине белковой молекулы, который располагается на поверхности внешней мембраны, тогда как С-терминальная часть находится либо внутри молекулы, либо в периплазме. При поиске в генетической базе данных не выявлено значительной гомологии инвазина из этого вида бактерий с другими известными последовательностями. Количество инвазина у Y.enterocoUtica зависит от окружающей температуры. Оно максимально при температуре 28-30 С, но не при 37 С. Это согласуется с тем, что штаммы Y enterocoUtica, растущие при температуре 30 С, инвазивнее штаммов, выросших при более высокой температуре. Снижение температуры положительно влияет и на количество шу-специфического посредника у К enterocoUtica. Ген инвазина обнаруживается как у патогенных, так и у непатогенных штаммов иерсиний. Считается, что непатогенные штаммы иерсиний содержат функционально неактивный ген инвазина, поскольку они не способны проникать внутрь НЕр-2 клеток, а при введении в эти штаммы интактного inv-гена их способность к адгезии и инвазии восстанавливается.
Помимо гот-гена у патогенных штаммов Y. enterocolitica инвазивность опосредуется еще одним хромосомным геном ail (attachment invasion locus). Ген ail кодирует белок с молекулярной массой 17 кДа, который локализуется на поверхности клетки.
Аналогично /от -гену экспрессия ail -гена зависит от температуры. Одни авторы говорят о влиянии на эту зависимость фазы роста бактерий, в логарифмической фазе белка образуется больше при температуре 30 С, а в стационарной - при 37 С. Другие отмечают, что в стационарной фазе роста значительные количества белка Ail обнаруживаются только при 37 С, а не при более низких температурах. Интересно, что мутанты по инвазину Y. enterocotitica в условиях роста при температуре 30 С не могут проникать внутрь клеток млекопитающих из-за отсутствия у микроорганизмов продуктов генов ail и гот.
Помимо участия в адгезии/инвазии белок Ail патогенных Y enterocolitica придает им устойчивость к воздействию человеческой сыворотки. Ген ail имеет гомологию с некоторыми другими генами, кодирующими белки бактерии семейства Enterobacteriaceae, которые придают клеткам устойчивость к воздействию человеческой сыворотки, но не имеют принципиального значения для адгезии/инвазии.
У Y. enterocolitica описана структура, аналогичная рН6-антигену Y. pseudotuberculosis и Y pestis и образующая фимбрии. Главная единица этого антигена - белок 21 кДа - кодируется хромосомным геном ту/А (mucoid Yersinia /actor). Экспрессия белков Myf регулируется на уровне транскрипции температурой и рН. Ген ту/А транскрибируется при температуре 35 С и низком значении рН и, подобно энтеротоксину, только в стационарной фазе роста. Му\ имеет 44 % гомологии с рНб-антигеном Y pestis .
Изучение распространенности белка MyfA среди различных видов иерсинии выявило, что он подобно гену yst энтеротоксина встречается у патогенных сероваров Y. enterocolitica. Фибриллярные структуры Y. enterocolitica, по-видимому, могут участвовать в адгезии и колонизации эпителия кишечника млекопитающих. Наличие энтеротоксина и фибриллярных структур у бактерий данного вида также ассоциируется с диареей у источников выделения.
Остров высокой патогенности
В геноме высокопатогенных иерсинии содержится большой хромосомный фрагмент (35 - 45 тысяч пар оснований), содержащий гены вирулентности и имеющий признаки «острова патогенности».
Признаками «островов патогенности» являются: - содержание нескольких повторяющихся последовательностей (IS элементов); - наличие у одного из концов острова гена транспортной РНК; - большее чем в остальном геноме соотношение Г+Ц.
«Острова патогенности» широко распространены у грамотрицательньгх бактерий и были открыты относительно недавно, У разных родов грамотрицательньгх бактерий «острова» включают разнообразные гены, имеющие значение для вирулентности. Поскольку у иерсинии этот участок генома содержит гены, коррелирующие с высокой патогенностью, он получил название «остров высокой патогенности» (HPI high-pathogenicity island). Эти «острова» характеризуются нестабильностью и часто подвергаются спонтанным делениям.
Питательные среды и сыворотки
В работе были использованы следующие среды: 1. Питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-агар) производства НБГЩ ГИП г. Оболенск, Московской области. 2. Среда Хигучи-Смита, выпускаемая РосНИПЧИ «Микроб» 3. Среда АГВ производства ННГЩ ГИП г. Оболенск, Московской области.
Для определения серогрупповой принадлежности использовали диагностические сыворотки к Yersinia enterocolitica адсорбированные кроличьи сухие для РА на стекле, выпускаемые НИИЭМ им. Пастера, С.Петербург.
1. Для определения продукции сероводорода, индола и 3-галактозидазы, уреазной активности, способности утилизировать лизин, орнитин, фенилаланин, эскулин, малонат, инозит, адонит, целлобиозу, сахарозу, сорбит, трегалозу, маннит и цитрат использовали диагностические системы ЭНТЕРОтест 16 (PLIVA - Lachema a.s.,Чешская республика). Изучение биохимической активности проводили в строгом соответствии с прилагаемой инструкцией. Культуру выращивали на питательном агаре в течение 24 часов. Готовили в 0,85 % растворе NaCl суспензию концентрацией 1млрд КОЕ/мл.
Для проверки чистоты культуры и ее ростовых свойств параллельно делали посев суспензии на питательный агар. С помощью автоматической пипетки инокулировали по ОД мл суспензии во все лунки. После этого в лунки для тестов на сероводород, лизин, индол, орнитин, уреазу добавляли по 2 капли стерильного парафинового масла. Для определения р-галактозидазы тестовую полоску стерильным пинцетом помещали в пробирку с исходной суспензией в объеме 0,5-0,6 мл. Инокулированную пластинку, пробирки с тестовыми полосками, а также контрольные чашки инкубировали при 26 С в течение 48 часов. Для учета добавляли по 1 капле в лунки для теста индол и фенилаланин соответствующие реактивы. Реакцию на фенилаланин оценивали немедленно. Затем регистрировали результаты остальных реакций, пользуясь прилагаемой таблицей №2 «Интерпретация реакций». После употребления микросистемы автоклавировались.
2. Лецитиназную активность изучали на агаре Хоттингера, содержащем 20 % желточной взвеси (1 желток на 150-180 мл. стерильного 0,85 % раствора NaCl). Суточную агаровую культуру наносили на поверхность среды в виде бляшки диаметром 7-8 мм. Результаты посевов учитывали ежедневно в течение шести суток. При наличии лецитиназы через 24-48 часов вокруг бляшки образуется зона помутнения, которая со временем увеличивается.
3. Для определения нитратредуцирующей способности испытуемую культуру засевали в бульон, содержащий 1 % нитрата калия. Через 48-72 часа инкубации в пробирку вносили по 0,3-0,5 мл полупроцентных растворов крахмала и йодистого калия. После перемешивания добавляли 1 каплю 5 % раствора серной кислоты и снова взбалтывали. В присутствии нитрита калия цвет среды становится темно-синим до коричневого, а если нитрита нет, цвет бульона не меняется или он голубоватый.
4,Для постановки реакции Фогес-Проскауэра (тест на ацетоин) агаровую культуру засевали в пробирку со средой Кларка, инкубировали при 22 С в течение трех дней. Затем к 1 мл культуры добавляли 0,6 мл 5 % спиртового раствора альфа-нафтола и 0,2 мл 40 % раствора едкого калия.
Пробирки встряхивали и помещали в термостат при 37 С на один час. При положительной реакции среда окрашивается в красный цвет, при отрицательной - цвет среды не изменяется.
5. Способность утилизировать ксилозу и салицин определяли, засевая суточные агаровые культуры на жидкие среды Гисса, имеющие в своем составе 1 % индикатора Андреде и по 1 % соответствующего углевода. Посевы выдерживали при 26 С. Результаты отмечали в течение 15 суток.
1. Для определения кальцийзависимости на среду Хигучи-Смита высевали суточные агаровые культуры (приблизительно 250 микробных тел на чашку). На контрольную чашку кровяным агаром высевали такое лее количество бактерий, а затем их инкубировали при 37 С и через 48 часов подсчитывали количество выросших колоний. Если штамм вирулентный, то на среде Хигучи-Смита роста нет или вырастают единичные колонии. На контрольной чашке обильный рост. Невирулентные штаммы при 37 С дают обильный рост как на среде Хигучи Смита, так и на контрольной чашке.
2. Для учета признака пигментации на агар Хоттингера с конго-красным (0,5 мг/мл) высевали 250 микробных тел суточной агаровой культуры и выращивали при 26 С 48 часов, а затем дополнительно выдерживали при 4 С 72 часа. Вирулентные штаммы образуют пигментированные колонии красного цвета (Р+), невирулентные — бесцветные колонии (Р-).
3. Постановка реакции агглютинации с сывороткой СВИ. Использовали диагностическую сыворотку к вирулентным Y.enterocolitica адсорбированную кроличью сухую для РА на стекле, выпускаемую НИИЭМ им. Пастера, С.Петербург. Содержимое ампулы с сывороткой СВИ растворяли в 1,0 мл дистиллированной воды.
Плазмидный скрининг
Ранее уже упоминалось, что для проявления патогенных свойств Y.enterocolitica необходимо присутствие в клетках плазмиды вирулентности pYV массой 45-47 мДа. Важным условием экспрессии патогенности является также наличие хромосомного гена inv , кодирующего синтез белка инвазина. Поэтому целью исследований, обобщенных в этой главе, было не только установить фенотипические особенности штаммов возбудителя кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных, но и зарегистрировать их возможные отличия по генотипу, содержанию в их клетках плазмиды вирулентности и хромосомного гена инвазина.
Второй задачей было сравнительное изучение двух коммерческих тест-систем, применяемых для генодиагностики Y.enterocolitica, - выяснение их параметров, преимуществ и недостатков.
Для определения плазмидного профиля был проведен плазмидный скрининг исследуемых штаммов. Для подтверждения его результатов все штаммы были проверены с помощью ГЩР. Использовалась тест-система «ДиаГен-Yersinia» для выявления ДНК плазмиды pYV.
Кроме того, был проведен ПЦР-анализ культур с использованием тест-системы «АмплиСенс Yersinia enterocolitica-270», предназначенной для выявления специфического участка ДНК гена inv .
Таким образом, мы считали целесообразным, во-первых, получить сведения о присутствии плазмидного репликона в клетках (плазмидный скрининг), во-вторых, идентифицировать его как плазмиду вирулентности (ПЦР-тест-система «ДиаГен- Yersinia»), и, в-третьих, проверить наличие хромосомного гена inv (ПЦР-тест-система «АмплиСенс Yersinia enterocolitica-270»). Одновременно мы провели сравнение двух ПЦР-тест-систем по чувствительности, специфичности и целесообразности использования для определения вирулентных иерсиний.
В результате плазмидного скрининга было установлено, что в клетках семи из сорока девяти проверенных штаммов Y.enterocolitica, имеется внехромосомный репликон. Молекулярная масса плазмидной ДНК, обнаруженной в исследованных штаммах кишечно-иерсиниозного микроба, оказалась равной 45-47 мДа, которая соответствует величине, характерной для плазмиды вирулентности pYV. Типичная из электрофореграмм представлена на рисунке 5.
Плазмида, предполагаемая как плазмида вирулентности, была обнаружена только у культур, выделенных от павших и больных поросят.
Результаты плазмидного скрининга бактериальных изолятов от поросят представлены в таблице 8. Для удобства анализа полученных данных в таблице приведены также сведения о месте выделения штаммов, наличии маркеров вирулентности и указаны их серогруппы.
Культуры от поросят можно разделить на три подгруппы по месту выделения.
Изоляты подгруппы А были получены из хозяйства СПОГА-2 Саратовского района от павших и больных поросят. Они обладали маркерами вирулентности и содержали плазмиду pYV, за исключением культуры №160.
Иная картина наблюдалась со штаммами подгруппы В, полученными из хозяйства «Трудовое» Марксовского района. Они, имея набор маркеров вирулентности, не обнаруживали в своем составе плазмиду pYV, за исключением культуры №24.
Изоляты третьей подгруппы (С), выделенные из ОПХ «Кристалл» Саратовского района были лишены маркеров вирулентности: кальцийзависимости, пигментсорбции, способности агглютинироваться сывороткой СВИ и др. Отсутствие плазмиды вирулентности подтверждало отсутствие этих признаков. Штамм №53 из этой подгруппы, не обладая маркерами вирулентности, имел плазмиду pYV.
Что касается свойств двадцати девяти культур, выделенных из молока КРС, то оказалось, что ни одна из них не содержала плазмиду 45-47 мДа, хотя пятнадцать из них относились к эпидемиологически значимым серогруппам ОЗ и 09 и имели маркеры вирулентности (табл. 9). В опытах с тринадцатью штаммами зарегистрированы неоднозначные результаты, а у одного штамма маркеры вирулентности не обнаруживались совсем. Интересно, что последние относились не к серогруппам 03 и 09, а к редко встречающимся сероварам 04,32, Об; 06,30; 07,8; 012,25; 018 (табл. 9). Роль их в патологии сельскохозяйственных животных и человека некоторыми исследователями оспаривается.
Результаты плазмидного скрининга выделенных от больных и павших поросят штаммов подгруппы А вполне ожидаемы - наличие плазмиды вирулентности у них совпадает с маркерами , и все они относятся к эпидемиологически и эпизоотологически значимой серогруппе 03.
Результаты плазмидного скрининга штаммов подгруппы В можно объяснить тем, что у них или произошла утрата плазмиды в процессе пересевов и хранения культур, или плазмидный репликон встроился в хромосому бактериальной клетки, аналогично тому, как это было показано у ряда штаммов Y.enterocolitica А.Л. Гинцбургом с соавторами (1989). Показано, что при этом может сохраняться экспрессия детерминант патогенности.
Культуры подгруппы С не принадлежали к серогруппе ОЗ, не имели маркеров вирулентности и не содержали плазмиду 45-47 мДа. Исключение -штамм №53, обладающий плазмидой вирулентности. Наиболее вероятное объяснение этого феномена состоит в наличии мутационного дефекта общего гена-регулятора, контролирующего экспрессию ряда генов, задействованных в детерминантах вирулентности.
Похожие диссертации на Сравнительное изучение штаммов Yersinia Enterocolitica различного происхождения
![Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс]](/i/i/4503/199818.png "Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс] Донин Михаил Васильевич")