Содержание к диссертации
Введение
1. CLASS Обзор литератур CLASS ы. 10
1.1. Некоторые иммунобиологические свойства возбудителя хламидиоза 10
1.1.1. Химический состав хламидий 10
1.1.2. Антигенная структура и иммуногенность хламидий 11
1.2. Индикация хламидийных антител 17
1.3. Хламидиоз домашних плотоядных животных (собак и кошек). 19
1.4. Лечение хламидиоза 24
1.4.1. Чувствительность хламидий к антимикробным препаратам 25
1.4.2. Неспецифическая терапия хламидиоза мелких домашних животных 28
1.4.3. Специфическая терапия хламидиоза мелких домашних животных 29
1.5. Получение глобулиновых лечебных биопрепаратов 30
Собственные исследования 36
2. Материалы и методы 36
2.1. Эпизоотологическое обследование 36
2.2. Штаммы хламидий 36
2.3. Опытные животные 38
2.4. Сыворотки и патологический материал 38
2.5. Индикация возбудителя в патологическом материале 39
2.6. Серологические реакции 39
2.7. Разработка специфического иммуноглобулина против хламидиоза плотоядных животных. 41
2.7.1. Изготовление антигена для иммунизации 41
2.7.2. Гипериммунизация животных-продуцентов, взятие крови и получение сыворотки 42
2.7.3. Электрофоретический анализ сывороток крови быков 44
2.7.4. Изготовление иммуноглобулина 45
2.8. Контроль глобулина в лабораторных и производственных условиях..46
2.9. Статистическая обработка результатов исследований 48
3. Результаты собственных исследований 49
3.1. Степень распространения хламидийньгх инфекций среди поголовья домашних плотоядных животных 49
3.2. Разработка специфического иммуноглобулина против хламидиоза плотоядных животных 54
3.2.1. Изготовление хламидийного антигена для иммунизации 54
3.2.2. Подбор животных и выбор схемы иммунизации 56
3.2.3. Динамика количества общего белка в сыворотках крови быков-продуцентов в процессе гипериммунизации 58
3.2.4. Электрофоретический анализ гипериммунных сывороток 60
3.2.5. Получение иммуноглобулина из гипериммунного сывороточного полуфабриката 86
3.2.6. Тестирование полученного биопрепарата в лабораторных условиях88
3.3. Испытание специфического иммуноглобулина против хламидиоза плотоядных животных в производственных условиях 91
4. Обсуждение результатов исследования 97
5. Выводы 113
6. Практические предложения 115
Список использованной литературы 116
Приложения 141
- Хламидиоз домашних плотоядных животных (собак и кошек).
- Индикация возбудителя в патологическом материале
- Статистическая обработка результатов исследований
- Динамика количества общего белка в сыворотках крови быков-продуцентов в процессе гипериммунизации
Введение к работе
Актуальность темы. Разрабатывая оптимальные противоэпизоотические мероприятия при той или иной болезни, необходимо придерживаться концепции "управляемых инфекций", в которой ведущим принципом является создание биологического равновесия между паразитом и хозяином. Весьма актуальна в этом отношении разработка специфических средств профилактики и лечения инфекционных заболеваний плотоядных животных, таких как чума, парво-вироз, хламидиоз и другие (7,28,49, 53, S9, 90).
Хламидиоз - широко распространенное заболевание человека, птиц и животных, ответственное за широкий круг патологии органов и тканей (40, 54, 68, 108, 146, 148, .160, 202, 208 и другие). Заболевание наносит значительный экономический ущерб животноводству и представляет угрозу здоровью людей. Больные животные часто становятся источником инфекции для работников сельского хозяйства и перерабатывающих производств..
В то же время распространенность возбудителей хламидиозов в природе среди домашних и диких животных, а также птиц представляет постоянную угрозу спорадических заболеваний для людей, профессионально не занятых в сельском хозяйстве (9, 70,106,249).
Исследованиями Равилова Р.Х. (86), Шамсутдиновой Н.В. (132) доказано значительное распространение хламидийных инфекций среди плотоядных животных, в том числе и среди домашних собак и кошек. Тем не менее, многие вопросы эпизоотологии, этиологии, симптоматики, патогенеза, диагностики, лечения и профилактики хламидиозов клеточных и домашних плотоядных остаются нерешенными и требуют детального изучения.
В последнее время исследователи уделяют все больше внимания проблеме организации лечебно-профилактических мероприятий при заразных болезнях мелких домашних животных. Основной упор при этом делается на поиск вакцин и рациональных схем их применения, обеспечивающим иммунную защиту восприимчивых животных. Разработаны и внедрены в ветеринарную практику протективные биопрепараты при хламидииных инфекциях крупного и мелкого рогатого скота, свиней и птиц (40, 105, 114, 123, 148, 204, 209, 214 и другие).
Специфическим средствам воздействия на возбудителя, с целью его нейтрализации, уделяется гораздо меньше внимания. Для пассивной иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных болезней животных применяют сыворотки и глобулиновые препараты. При этом главным образом разрабатываются гипериммунные сыворотки. Однако известно, что эта группа биопрепаратов, кроме положительного эффекта, имеет серьезные недостатки, связанные,.. прежде всего, с наличием большого количества балластных веществ, вызывающих побочное действие на организм, проявляющееся аллергическими реакциями. В этом аспекте наиболее перспективно использование иммуноглобулинов (53,243).
В настоящее время разработаны, выпускаются и применяются специфические лечебные препараты при следующих инфекционных заболеваниях мелких домашних животных: чуме плотоядных, парво- и аденовирозах собак, пан-лейкопении, калицивирозе и инфекционном ринотрахеите кошек (49,.65, 98).
Перспективным направлением в терапии хламидииных инфекций является применение лечебных сывороток. Обычно используют полиспецифические гипериммунные или сыворотки реконвалесцентов, которые сочетают в себе антитела против вирусных, микоплазменных и хламидииных антигенов, т.к. эти заболевания часто встречаются в виде смешанных инфекций (116, 129, 243 и другие).
К началу исследований в нашей стране не выпускались биопрепараты для пассивной иммунопрофилактики и иммунотерапии при хламидиозе мелких домашних животных.
Цель и задачи исследований. Цель исследований — разработать специфический иммуноглобулин против хламидиоза плотоядных животных и изучить его лечебную эффективность.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
- провести клинико-эпизоотологические и лабораторные исследования подозрительных по заболеванию хламидиозом собак и кошек в г. Казани;
- подобрать рациональную схему гипериммунизации животных-доноров с целью получения сывороток с высоким уровнем специфических антител;
- провести лабораторные исследования сывороточных полуфабрикатов;
- отработать технологический регламент производства и контроля биопрепарата;
- провести исследования полученных глобулинов в лабораторных условиях;
- испытать разработанный препарат на спонтанно больных хламидиозом плотоядных животных (собаках и кошках).
Научная новизна. Впервые разработан специфический иммуноглобулин против хламидиоза плотоядных животных. Отработан технологический регламент его производства и контроля.
Разработана рациональная схема иммунизации быков-продуцентов хла-мидийным антигеном.
С использованием компьютерной программы Image Master; ID Gel Analysis v 3.0.,проведен анализ электрофореграмм сывороток крови доноров, иммунизированных хламидийным антигеном.
Полученный биопрепарат протестирован в лабораторных условиях.
С использованием разработанного препарата проведено лечение спонтанно зараженных хламидиями мелких домашних животных.
Практическая ценность. Разработан специфический: иммуноглобулин против хламидиоза плотоядных животных.
Установлена возможность использования указанного биопрепарата для лечения хламидиоза у собак и кошек.
Результаты проведенных исследований вошли в следующие нормативно-технические документы:
A - во "Временную инструкцию по изготовлению и контролю специфического иммуноглобулина против хламидиоза плотоядных животных", утвержденную ректором КГАВМ 26 июня 2003 г.;
- в "Технические условия на специфический иммуноглобулин против хламидиоза плотоядных животных", утвержденные ректором КГАВМ 26 июня 2003 г.;
- во "Временное наставление по применению специфического иммуноглобу лина против хламидиоза плотоядных животных", утвержденное начальником ГУВ Кабмина РТ 26 июня 2003 г.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:
- ежегодных итоговых заседаниях ученых советов Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана (1999-2003 гг.).
- Международной научной конференции, посвященной 70-летию образования зооинженерного факультета (Казань, 2000 г.).
- научно-практических конференциях по проблемам ветеринарии и зоотехнии
(Казань, 2001-03 гг.).
- научно-практической конференции "Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных" (Киров, 2001 г.).
- научно-практических конференциях "Актуальные вопросы ветеринарной медицины домашних животных" (Екатеринбург, 2001 и 2003 гг.).
- X и XII Московских международных ветеринарных конгрессах (2002 и 2004 гг.).
- IV Региональной научно-практической конференции "Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития" (Саратов, 2004 г.).
Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ. Разработаны нормативно-технические документы на биопрепараты: одно наставление, одна инструкция и одни технические условия.
t Основные положения диссертации, выдвигаемые для защиты:
- результаты клинико-эпизоотологических и лабораторных исследований поголовья домашних плотоядных в отношении хламидийных инфекций;
- оценка эффективности подобранной схемы гипериммунизации быков продуцентов хламидийным антигеном;
- разработка специфического иммуноглобулина против хламидиоза плотоядных животных;
- результаты лечения спонтанно больных хламидиозом собак и кошек с использованием разработанного биопрепарата.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах компьютерного текста (текстовый редактор "Microsoft Word 2000м, стиль "Times New Roman", размер шрифта 14 pt, интервал полуторный) и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований (3 главы), обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и указатель литературы (всего 252 источника, в том числе 92 иностранных и 10 ссылок на сайты Internet). Диссертация иллюстрирована 31 таблицей и 29 рисунками. Прилагаются разработанные нормативно-технические и другие документы, подтверждающие результаты исследований, их научно-практическую ценность.
Хламидиоз домашних плотоядных животных (собак и кошек).
Интерес исследователей к домашним плотоядным связан в первую очередь с опасностью заражения человека зооантропонозными заболеваниями (5, 58,63). Собаки и кошки занимают в жизни человека определенное место. Собаки используются: в поиске преступников, наркотиков и взрывчатых веществ; в геологии — при разведке воды и полезных ископаемых, в спасательной службе г для обнаружения пострадавших при стихийных бедствиях и катастрофах, в охотничьем промысле и пограничной службе. Существуют собаки-пастухи, со-баки-охранники, собаки-проводники слепых, собаки-экспериментальные животные и т.д. Важную роль играют эти животные в таких видах деятельности человека, как спорт, туризм, отдых. На севере собаки служат средством передвижения (58). Кошки приносят в дом уют и тепло, трудно переоценить значение кошек в борьбе с грызунами в жилище человека. Многие люди разводят кошек как декоративных животных. Любители объединены во Всероссийское объединение клубов, которое является членом Международной федерации любителей кошек.
Изучением хламидиозов домашних плотоядных занимались многие исследователи (11, 13, 45, 70,.71, 74, 86, 87, 88, 91, 92, 93, 94, 95, 133, 134, 155, 166, 219), однако вопросы специфической иммунотерапии и профилактики хламидийных инфекций мелких домашних животных остаются открытыми.
В доступной литературе имеются сообщения о заболеваемости кошек и собак хламидиозом. В 1966 году Popovici наблюдал заболевание, характеризующееся абортами и мертворожденниями, у собак и предложил о хламидиоз-ной их природе (219). В 1971 г. Baker и Cello доказывают хламидиозную природу конъюнктивитов пневмоний и других заболеваний у кошек (155, 166).
В 1978 г. В.Л. Ковалев с соавт. впервые сообщил, что дикие плотоядные могут быть резервуаром возбудителей хламидиозов. Ими были выделены хла-мидии от дикой красной лисицы и от собак, пасущих отары овец (45, 46). И.Л. Обухов с соавт. (70, 74) проводили клинико-эпизоотологическое изучение хламидиозов кошек и выделили от них возбудителя заболевания. Кроме того, ими были изолированы хламидии при конъюнктивитах собак (71).
Исследованиями Равилова Р.Х. (86), Шамсутдиновой Н.В. (132) доказано значительное распространение хламидийных инфекций среди плотоядных животных, в том числе и среди домашних собак и кошек.
Хламидиоз собак и кошек - инфекционная болезнь, проявляющаяся в типичных случаях лихорадкой, конъюнктивитом, ринитом, пневмонией, абортами и мертворождением плодов. Болезнь проявляется обычно в виде единичных случаев и реже - эпизоотических вспышек (71, 72). Предполагается, что причиной высокой степени пораженности плотоядных хламидиозами является широкое распространение заболевания среди домашней птицы и сельскохозяйственных животных, так как для кормления собак и кошек используют боенские отходы и субпродукты. Известно, что хламидио-зом поражено не менее 50% популяции городских голубей (45).
Источником инфекции служат больные животные и хламидионосители. Основными носителями хламидий служат мелкие грызуны (крысы, мыши), а также кошки и собаки, выделяющие возбудителя со слюной, молоком, калом и мочой: Хотя алиментарный путь заражения собак и кошек через контаминиро-ванные корма весьма вероятен, главным и наиболее важным в эпизоотическом отношении является половой путь передачи инфекции. Кроме того, нередко хламидиоз передается при непосредственном контакте больного животного или бактерионосителя со здоровой особью. Возможен вертикальный путь передачи-возбудителя (70, 92,249).
Восприимчивы кошки и собаки всех возрастов. Наиболее часто встреча ются поражения мочеполовой сферы у самок и самцов, патологическое течение беременности, а также конъюнктивиты у кошек. Не замечено зависимости час тоты поражения у собак от породы. Среди кошек конъюнктивитом, в основном, заболевают длинношерстные породы. Заболевания молодняка с клинической картиной хламидиоза чаще всего наблюдаются у щенков и котят первых 3-5 дней жизни. Прогноз для котят и щенят обычно неблагоприятный (92, 88, 18, 249).
Сложность изучения симптомов болезни обусловлена еще и тем, что нередко хламидиоз возникает в виде смешанных или вторичных инфекций. Часто хламидий обнаруживаются вместе с другими возбудителями: пневмококками, стрептококками, стафилококками, микоплазмами, уреаплазмами, вирусами герпеса и чумы плотоядных. При смешанной инфекции осложнения бывают более тяжелыми и хуже поддаются лечению (245). Принято считать, что домашние животные не представляют для человека опасности как резервуары хламидийной инфекции. Однако при опросе больные хламидиозом люди нередко отмечают наличие в доме больных млекопитающих (кошек, реже - собак) с признаками заболевания глаз, респираторных органов и даже гениталий. Для оценки этой закономерности исследованию подвергали мазки с конъюнктивы "подозрительных" кошек. При этом хламидии были обнаружены. Таким образом, этот вопрос нельзя считать закрытым. Окончательную ясность в него могло бы внести обследование статистически значимой группы больных и их питомцев (86, 87,92).
В большинстве случаев заболевание протекает скрыто, без явных проявлений. Такой вариант отмечается у каждого 6 из 10 больных животных. Каких-то особых, присущих только им, признаков хламидиозы в большинстве случаев не имеют. Инкубационный период при хламидиозе составляет примерно 1-У недели (244,245).
Индикация возбудителя в патологическом материале
Индикацию возбудителя в пробах патологического материала осуществляли при помощи РИФ, которую выполняли в непрямом варианте. При этом использовали набор для диагностики хламидиоза люминесцентным методом "ХламиСкан" (НПФ "Лабдиагностика").
Полимеразную цепную реакцию проводили общепринятыми методами с использованием специфичных для Chi. psittaci олигонуклеотидных праймеров, сконструированных R.G. Hewinson с соавт. (191). Эти исследования были проведены к.б.н. Вафиным Р.Р., который любезно предоставил нам данные для анализа.
В процессе экспериментальных исследований в качестве серологических тестов использовали РСК и ИФА.
Этими методами испытывали сыворотки крови подопытных и подозрительных по заболеванию кошек и собак, а также пробы, полученные от быков-продуцентов в процессе гипериммунизации.
РСК проводили согласно "Методическим указаниям по лабораторной диагностике хламидийных инфекций у животных ", утвержденных Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 30 июня 1999 г.
ИФА ставили на полистероловых планшетах, изготовленных на ПО ВНИИ медицинской техники (г. Москва). В качестве конъюгата использовали белок А, меченный пероксидазой хрена, который получали из НПО "Пептоск-рин-2 " (г. Электросталь).
ИФА выполняли по непрямому методу: - планшет или необходимое количество стрипов разборного планшета (сорбированных хламидийным антигеном) один раз промывали раствором ФСР-Т; - контрольные и исследуемые образцы разводили в растворе ФСР-Т 1:100 и вносили по 100 мкл в лунку (контрольные образцы вносили каждый в 2 лунки);
- в одну лунку не вносили ни контрольные, ни исследуемые сыворотки (контроль конъюгата);
- планшет или стрипы разборного планшета помещали во влажную камеру и инкубировали 60 минут при 37С;
- лунки 4 раза промывали раствором ФСР-Т, остатки содержимого лунок удаляли легким постукиванием по 4-5 слоям фильтровальной бумаги;
- в каждую лунку планшета или стрипа разборного планшета вносили по 100 мкл рабочего раствора конъюгата, после чего планшет или стрипы помещали во влажную камеру и инкубировали 40 минут при температуре 37С;
- лунки 5 раз промывали раствором ФСР-Т, остатки содержимого лунок удаляли легким постукиванием по 4-5 слоям фильтровальной бумаги;
- в каждую лунку планшета или стрипа вносили по 100 мкл субстратного раствора и инкубировали при комнатной температуре в темном месте в течение 10-15 минут;
- реакцию останавливали добавлением в лунки по 50 мкл стоп-реагента и проводили учет результатов ИФА.
При постановке реакции ставили следующие контроли:
- положительный контроль - исследование сыворотки, заведомо содержащий хламидийные антитела (две лунки);
- отрицательный контроль - исследование заведомо негативной сыворотки (две лунки);
- контроль конъюгата (одна лунка).
Результаты ИФА регистрировали с помощью спектрофотометра Muliskan, измеряя оптическую плотность (ОП) смеси реагентов в лунках при длине волны 492 нм. «0» (бланк) устанавливали по воздуху. Результат подлежал учету, если среднее значение ОП отрицательных контролей (ОП ср. К-) не превышало 0,2 оптические единицы (о.е.), а среднее значение ОП положительных контролен (ОП ср. К+) составляло не менее 0,8 о.е. Положительными считали образцы исследуемых сывороток, ОП которых превышала критическое значение ОП (ОП Крит.), которое рассчитывали по формуле: ОП крит.= ОП ср. К- + 0,2.
В разработке специфического иммуноглобулина против хламидиоза плотоядных животных принимали участие сотрудники лаборатории; контроля и индикации возбудителей вирусных и хламидийных инфекций в объектах ветеринарного надзора ВНИВИ [профессор Р.Х. Хамадееві и к.в.н. В.В. Евстифеев, лаборатории культивирования и диагностики инфекционных болезней Республиканского центра по профилактике и борьбе со СПИДом (г. Казань) к.б.н. В.В. Герасимов и к-б.н. К.С. Хаертынов.
Биомассу хламидий получали из лаборатории контроля и индикации возбудителей вирусных и хламидийных инфекций в объектах ветеринарного надзора Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института. Для получения концентрированной биомассы хламидий предназначенной в качестве исходного сырья для изготовления антигена использовали желточные оболочки павших куриных эмбрионов, инфицированных производственными штаммами хламидий с инфекционным титром не менее 10 5 ЭЛД 5 /0,Змл.
Все операции с исходной и концентрированной биомассами хламидий выполняли в стерильных условиях. Для инактивации возбудителя отобранные желточные оболочки инкубировали в водяной бане при 60С в течение 60 минут. Клетки желточных мешков куриных, эмбрионов, содержащие хламидии, разрушали либо трехкратной заморозкой-отморозкой, либо 4 кратным озвучиванием по 30 секунд на ультразвуковом дезинтеграторе (УЗДН-А).
Определение концентрации хламидии в полуфабрикате проводили на ФЭК 56М-У4-1М. Гомогенность взвеси и содержание в ней элементарных телец хламидии контролировали путем световой микроскопии в иммерсионной системе.
Готовый для иммунизации антиген тестировали на стерильность путем посева на питательные общепринятые среды (МЛА, МПБ, МГТПБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро), а также на инфекционность путем контрольного заражения белых мышей.
Стерильные в отношении неспецифической бактериальной и грибковой микрофлоры, не вызывающие заболевание и гибель белых мышей суспензии, использовали для гипериммунизации.
Статистическая обработка результатов исследований
Материалом для изготовления иммуноглобулина являлась стерильная сыворотка, полученная из крови быков-продуцентов.
Для выделения иммуноглобулина применялась одна из модификаций метода, основанного на фракционировании сывороточных белков с помощью сульфата аммония при комнатной температуре (трехкратно). Диализ раствора глобулина проводили против дистиллированной воды, содержащей 0,1% азида натрия в течение 2-х суток при комнатной температуре, меняя дважды в сутки дистиллированную воду (при этом контролируя ее на на личие сульфат-иона). Осветленные растворы подвергли стерилизующей фильтрации через ас бестовые пластины, керамические свечи или нитроцеллюлозные фильтры с размером пор 22 мкм. РН раствора иммуноглобулина доводили до 7,0-7,5. Готовый раствор иммуноглобулина разливали по ампулам (флаконам), и высушивали из замороженного состояния в течение 14 часов. . Контроль глобулина в лабораторных и производственных условиях Для определения растворимости в каждую ампулу (флакон) биопрепарата вносили дистиллированную воду в указанном на этикетке количестве. После этого содержимое встряхивали и наблюдали за растворением сухой массы. Содержимое должно было раствориться полностью в течение 2-3 минут, с образованием прозрачного слегка опалесцирующего с желтым оттенком раствора.
Количественное содержания белка в растворе иммуноглобулина определяли спектрофотометрически.
Контроль безвредности иммуноглобулина осуществляли на клинически здоровых лабораторных животных путем введения биопрепарата 3 морским свинкам и 10 белым мышам. Морским свинкам весом 300-400 г препарат вводили под кожу в дозе 10 мл (по 5 мл в оба бока). Наблюдали за свинками в течение 5 дней. Мышам весом 15-22 г препарат вводили подкожно в дозе 0,5 мл и наблюдали за их состоянием в течение 4 дней. Было проведено по три серии опытов.
Для определения пирогенности препарата трем клинически здоровым кролика весом 1,5-2 кг измеряли ректальную температуру. Годными для испытания считали кроликов с температурой 38,6-39,8С, Не позднее, чем через 15 минут после измерения температуры кроликам внутривенно вводили исследуемый материал иммуноглобулина, подогретый до 37С в количестве 2 мл/кг живой массы. Через 1, 2 и 3 часа после введения препарата кроликам измеряли температуру. Если у одного кролика температура повышалась на один градус и выше, опыт повторяли еще на трех кроликах. Иммуноглобулин считали пиро-генным, если после повторного опыта из 6 кроликов три или более давали повышение температуры на 1 С и выше.
Терапевтическую эффективность биопрепарата изучали на белых мышах, которых вначале подвергали контрольному внутрибрюшинному заражению вирулентной культурой хламидий штамма "250". Материал, содержащий хлами-дии, вводили мышам; внутрибрюшинно в дозе 0,5 мл. Инфекционный і титр штамма "250" для КЭ составлял 10 5 ЭЛДэо/ОЗ мл.
С лечебной целью специфический иммуноглобулин: против хламидиоза плотоядных животных вводили 20 инфицированным белым мышам, начиная с 4 дня после заражения, трехкратно с интервалом 24 часа подкожно (10 голов) и = внутримышечно (10 голов) в дозе 0,01 мл на одно животное. 10 зараженных белых мышей служили контролем инфекционных свойств культуры хламиди й . Было проведено 3 серии опытов.
Испытания терапевтической эффективности препарата на собак и кошках проводились на животных, содержащихся в домашних условиях, владельцы которых обращались за ветеринарной помощью в клиники г. Казани.
Подозрительных по заболеванию животных подвергали исследованию на хламидиоз в РИФ, ПЦР, РСК и ИФА. В случае установления диагноза лабораторными методами, животным назначали лечение, которое включало: этио-тропную, патогенетическую и симптоматическую терапию...
Всего лечению было подвергнуто 39 животных с различными симптомами, которым лабораторными методами был поставлен диагноз: "хламидиоз".
Всех животных лечили по традиционным схемам. Кроме того, 26 животных из числа вышеназванных: дополнительно были. подвергнуты специфической терапии с использованием разработанного нами глобулина против хлами-диоза плотоядных животных.
Специфический иммуноглобулин против хламидиоза плотоядных животных вводили больным собакам и кошкам из расчета 0,2 мл/кг массы. Препарат вводили внутримышечно в области бедра один раз в сутки пять дней подряд, одновременно с проведением других лечебных мероприятий.
Статистическую достоверность полученных данных определяли по методу Стъюдента. Статистическую обработку результатов серологических исследований проводили по методике описанной Т.С. Сайдуллиным (101).
Динамика количества общего белка в сыворотках крови быков-продуцентов в процессе гипериммунизации
На этом этапе работы мы проводили количественную и качественную оценку изменений иммуноглобулинового профиля сывороток крови быков-продуцентов, подвергнутых гипериммунизации хламидийным антигеном.
Наряду с определением титров специфических антител, мы провели сравнительное исследование динамики увеличения количества общего белка в сыворотке крови быков-продуцентов двух групп в процессе их гипериммунизации по разным схемам.
Результаты измерений указанного показателя представлены в таблице З А и на рисунке 3.2.
Данные таблицы и рисунка показывают тенденцию роста количества общего белка в сыворотке крови животных-доноров в процессе иммунизации. При этом темпы роста анализируемого показателя во II группе были несколько выше (р 0,05), чем во I группе животных. Однако полученные результаты не позволяли нам в полной мере оценить влияние интервала между введениями антигена при иммунизации на характер иммунобиологической перестройки животных. Поэтому мы провели изучение динамики содержания глобулинов в исследуемых сыворотках в процессе гипериммунизации.
Для анализа динамики иммуноглобулинов в сыворотках крови иммунизированных быков-продуцентов мы провели электрофоретическую разгонку макромолекул в полиакриламидном геле. Сканирование электрофореграмм выполняли на сканере Sharp (Япония). Анализ результатов сканирования проводили с использованием специализированной компьютерной программы Image Master ID Gel Analysis v 3.0.
Электрофоретической разгонке и компьютерному анализу подвергли сыворотки крови 4 быков-продуцентов во время второй серии опытов:
- двух быков (Ms 1585 и 1517), иммунизированных по первой схеме;
- двух быков (№№ 1547 и 1570), иммунизированных по второй схеме.
Кровь для электрофоретических исследований брали во время "грунди-ровки", при первой, второй, третей и четвертой иммунизациях, а также во время пробного крововзятия (через 20 дней после последней иммунизации), т.е. до иммунизации, через 45 дней после "грундировки", соответственно через 7 и 14 дней (при иммунизации животных по I или II схемам) после первой, второй и третьей иммунизации, а также через 20 дней после четвертой иммунизации, всего по 6 раз от каждого быка-продуцента.
Денситограммы электрофореза сывороток крови быков продуцентов в полиакриламидном геле и результаты анализа этих денситограмм представлены на рисунках 3.5-3.28 и в таблицах 3.3-3.26.
Как видно из рисунка и таблицы, глобулины в электрофоретическом профиле сыворотки крови быка № 1585 через 45 дней после "грундировки" представлены фракциями №№ 1-5, что составляет (44,82%) от общего количества белка в пробе.
Как видно из рисунка и таблицы, глобулины в электрофоретическом профиле сыворотки крови быка № 1585 через 7 дней после первой иммунизации представлены фракциями №№ 1-8, что составляет (45,78%) от общего количества белка в пробе.
