Введение к работе
Актуальность проблемы. Выяснение механизмов, определяющих персистенпию Mycoplasma hominis - одной из наиболее распространенных микоплазм, ассоциированной с социально-значимыми заболеваниями человека, являющейся также контаминантом клеточных культур, используемых в биотехнологии для производства вирусных вакцин, представляет значительный интерес как с точки зрения фундаментальных исследований, так и практических разработок, связанных с определением молекулярно-генетических основ формирования системы «паразит-хозяин» и способов ее контроля [Борхсениус и др., 2002; Waitesefa/., 2005].
В организме человека М. hominis способна вызывать развитие как урогенитальных, так и экстрагенитальных острых и хронических, локальных и системных инфекций аппарантного и инаппарантного типов. Урогенитальные микоплазменные инфекции могут обусловливать осложнения беременности, патологию и гибель плода [Прозоровский и др., 1995; Поздеев, 2004; Razin, Herrmann, 2002; Waites et al., 2005; Egawa et al., 2007]. Контроль микоплазменной инфекции представляет серьезную проблему, решение которой связывают с успехами изучения молекулярных основ адаптации микоплазмы к стрессорным воздействиям и восприимчивости индивидов к персистенции М. hominis [Борхсениус и др., 2002; Razin, 2006].
Факторы, обусловливающие персистенпию патогенных бактерий у млекопитающих и человека, в значительной мере определяются особенностями биологии инфекционного агента и организма-хозяина [Прозоровский и др., 1995; Lysnyansky et al., 2001а; Wise et al., 2006]. Гены иммунного ответа организма-хозяина, а также иммунодоминантных и стресс-индуцированных белков инфекционного агента имеют при этом существенное значение [Yogev et al., 2002; Rhen et al., 2003; Razin, 2006; Hamsten et al., 2008]. Показано, что восприимчивость к персистенции ряда патогенных микроорганизмов у человека может быть связана с наличием у индивидов определенных генотипов инфекционных агентов, а также полиморфных локусов генов ключевых иммуномодуляторов про- и противовоспалительных реакций -IL-1 (IL-1B-5UOT, IL-1B+39540T, IL-1RN(VNTR)) и IL-10 (IL-10-10820A) [Rad et al., 2004; Mege et al., 2006]. Изменения экспрессии генома, морфологии, ультраструктуры, пролиферации и вирулентности бактерий в ответ на воздействие стрессоров обусловливают адаптацию микроорганизмов к неблагоприятным условиям среды (НУС) и их персистенцию [Головлев, 1998; Чернов и др., 2007, 2008а, 2009, 2010; Muela et al., 2008; Madsen et al., 2006a, 2006b; Schafer et al., 2007; Folmsbee et al., 2010]. Результаты комплексных исследований генов иммунного ответа организма-хозяина, а также иммунодоминантных и стресс-индуцированных белков инфекционного агента могут использоваться для определения механизмов выживания патогенов в различных условиях среды (РУС) и способов контроля их персистенции, а также разработки региональных программ и индивидуальных схем лечения заболеваний, ассоциированных с персистенцией микроорганизмов. Однако данные о
проведении соответствующих исследований в отношении М. hominis отсутствуют.
Цель данной работы - выявление факторов восприимчивости к микоплазменной инфекции и особенностей ответных реакций клеток М. hominis PG37 на стрессорные воздействия.
Основные задачи исследования:
Протестировать клинический материал на наличие М. hominis с помощью ПЦР и определить частоту встречаемости микоплазмы у индивидов с отягощенным акушерским анамнезом (жители г. Казани).
Определить варианты IL-1 (IL-1B-5UOT, IL-1B+39540T, IL-1RN(VNTR)) и IL-10 (IL-10-1082G>A) у инфицированных и не инфицированных М. hominis индивидов и провести анализ распределения частоты их встречаемости в обследуемых группах.
Определить нуклеотидные последовательности vaa-гена у клинических изолятов М. hominis и выяснить особенности вариабельности гена, кодирующего фактор вирулентности микоплазмы - цитоадгезин Vaa.
Провести сравнительный анализ морфологии, ультраструктуры и пролиферации клеток М. hominis PG37, образующихся в различных условиях среды -оптимальных и стрессовых.
Провести сравнительный анализ метрических параметров ДНК, а также матричных свойств молекулы в отношении амплификации нуклеотидных последовательностей генов у клеток М. hominis PG37, образующихся в различных условиях среды.
Провести сравнительный анализ токсигенности М. hominis PG37 при культивировании микоплазмы в различных условиях среды.
Провести сравнительный протеомный анализ клеток М. hominis PG37, образующихся в различных условиях среды.
Научная новизна. Впервые проведены комплексные исследования факторов, определяющих персистенцию М. hominis у человека. С помощью ПЦР определены встречаемость М. hominis у пациентов с отягощенным акушерским анамнезом (ОАА), особенности распределения генотипов полиморфных локусов генов ключевых цитокинов у инфицированных и не инфицированных микоплазмой индивидов -жителей г. Казани, а также вариабельности у клинических изолятов М. hominis vaa-гена, кодирующего фактор вирулентности микоплазмы - цитоадгезин Vaa.
Впервые выявлены молекулярно-генетические маркеры предрасположенности к инфицированию М. hominis. Установлено, что аллель IL-1B+3954*C и генотипы IL-1В+3954*С/*С и IL-10-1082*G/*G повышают риск персистенции М. hominis, а генотипы IL-1B-511*T/*T / IL-1RN*1/*1 и IL-1B+3954*C/*T / IL-lRN*l/*2 снижают вероятность микоплазменной инфекции. В нуклеотидных последовательностях vaa-гена, кодирующих сайты адгезии и иммунозначимую зону белка, установлен гипервариабельный участок.
Впервые показано, что в результате длительного пребываниям hominis PG37 в
стрессовых условиях происходит переход бактерии в некультивируемое состояние (НС); в культуре микоплазмы достоверно возрастает количество хльтРаМикРФРм (УМФ) - сферических, окруженных мембраной наноструктур (диаметр < 0,2 мкм).
Впервые установлено, что М. hominis PG37 обладает генотоксичностью, проявление которой в стрессовых условиях имеет особенности. Показано, что клетки М. hominis PG37, образующиеся при длительном культивировании в стрессовых условиях, и их культуральная жидкость не оказывают ДНК-повреждающего действия на клетки тестерного штамма Escherichia coli PQ37.
Впервые выполнен сравнительный протеомный анализ клеток М. hominis PG37, образующихся в РУС, и идентифицированы 53 белка, участвующих в ответных реакциях микоплазмы на действия стрессоров (ТШ, СДС).
Научно-практическая значимость. Полученные данные вносят вклад в понимание адаптации М. hominis PG37 к стрессовым условиям, представления о молекулярно-генетических аспектах персистенпии микоплазмы у человека и их региональных особенностях.
В работе выявлены генетические маркеры предрасположенности индивидов (жители г. Казани) к персистенпии М. hominis - бактерии, ассоциированной с заболеваниями репродуктивной системы человека, а также являющейся контаминантом клеточных культур, использующихся, в том числе в биотехнологии для производства вирусных вакцин, и предложен диагностический зонд, позволяющий не только идентифицировать различные штаммы М. hominis, но и выявлять экспресс-методом ПЦР культивируемые и некультивируемые формы бактерии.
Идентифицированные в результате протеомного анализа стресс-реактивные белки М. hominis PG37 могут быть использованы для определения молекулярно-генетических механизмов адаптации микоплазмы к стрессовым условиям, а также способов контроля микоплазменной инфекции.
Полученные результаты могут найти применение в медицине для разработки дифференцированных программ, индивидуальных схем лечения и профилактики заболеваний, ассоциированных сМ hominis.
Данные работы могут быть использованы также в курсах лекций по микробиологии, молекулярной генетике, иммунологии инфекционных процессов и молекулярной медицине в ВУЗах.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследование. Работа проводилась в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН по теме «Взаимодействие микоплазм и эукариот: молекулярно-генетические основы образования некультивируемых форм бактерий и формирования системы «паразит-хозяин»» (№ гос. per. 01200901965) при финансовой поддержке РФФИ (проект № 01-04-49008); фонда НИОКР РТ (№ 03-3.10-163/2002-2004); Государственных контрактов № 35-405/06 на выполнение научно-исследовательских работ, а также № 02.740.11.0391 в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. Научные
положения диссертации базируются на результатах собственных исследований автора. Синтез праймеров, секвенирование нуклеотидных последовательностей, двумерный электрофорез и идентификацию полипептидов проводили в ФГУ «НИИ физико-химической медицины» ФМБА России (г. Москва); оценку токсических и генотоксических свойств клеток М. hominis PG37, а также наноскопию молекул ДНК проводили в КФУ (биолого-почвенный факультет, кафедра микробиологии; физический факультет, кафедра оптики и нанофотоники) (г. Казань). Выражаю искреннюю благодарность сотрудникам ФГУ «НИИ физико-химической медицины» ФМБА России - д.б.н., проф. В.М. Говоруну, к.х.н. Т.А. Акопиан, М.А. Роговой, к.б.н. М.В. Серебряковой, В.А. Карпову и сотрудникам КФУ - д.б.н., проф. О.Н. Ильинской, к.б.н. Н.И. Акберовой, к.ф.-м.н. О.А. Коноваловой, к.б.н. А.Б. Маргулис за предоставленную возможность проведения совместных работ и помощь в экспериментах.
Положения, выносимые на защиту:
Аллель IL-1B+3954*C, а также генотипы IL-1B+3954*C/*C и IL-10-1082*G/*G повышают риск персистенции М. hominis, а генотипы IL-1B-511*T/*T/IL-1RN*1/*1 и IL-1B+3954*C/*T / IL-lRN*l/*2 снижают вероятность микоплазменной инфекции.
Клинические изоляты М. hominis вариабельны по первичной структуре и модульной организации гена, кодирующего цитоадгезин Vaa. Нуклеотидные последовательности vaa-гена у клинических изолятов микоплазмы содержат гипервариабельный участок, ассоциированный с иммунозначимой зоной белка.
Условия культивирования М. hominis PG37 влияют на пролиферацию культуры, а также морфологию, ультраструктуру клеток микоплазмы и соотношение клеточных морфотипов в популяции бактерии.
М. hominis PG37 обладает генотоксичностью, проявление которой в стрессовых условиях имеет особенности.
Различные виды стрессоров индуцируют у М. hominis PG37 изменение экспрессии как специфичных, так общих белков.
Апробация работы:
Основные результаты диссертационной работы были представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология -XXI век» (Саратов, 2004); 10-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006); Итоговой научной конференции КИББ КазНЦ РАН (Казань, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007); Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007); 11-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2007); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы в биотехнологии» (Казань, 2008), XIV Международной
конференции «Ферменты микроорганизмов в биотехнологии и медицине» (Казань, 2009), Российской конференции «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии» (Казань, 2010).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 193 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованной литературы, а также приложения. В работе представлено 12 таблиц и 41 рисунок. Список цитируемой литературы содержит 363 источника, из них 93 - в отечественных изданиях.
